荧光检测方法
【专利摘要】本发明揭露一种荧光检测方法，首先将荧光检测试剂加入样品中。将样品盛装至一样品盘中，其中样品盘包含至少一列背景样品孔，以及至少一列待测样品孔。以一背景光源照射样品盘。取得样品盘的一背景灰阶影像。均值滤波背景灰阶影像。二值化背景灰阶影像。根据二值化后的背景灰阶影像，计算出此列背景样品孔的边缘位置。根据此列背景样品孔的边缘位置，计算出此列待测样品孔的边缘位置。取得位于此列背景样品孔内的灰阶像素数据，并将其平均作为一背景信号临界值。根据背景信号临界值对此列待测样品孔进行荧光信号读取作业。
【专利说明】荧光检测方法
【技术领域】
[0001]本发明与包含酶或微生物的测定或检验方法有关，特别是有关于一种荧光检测方法。
【背景技术】
[0002]利用荧光，是检测核酸的一种技术。是利用适当波长的光照射具有荧光性质的样品，样品会吸收光的能量而被激发至高能量状态，并在极短时间内回复低能量状态，同时以放光的形式将多余能量释出。当样品上结合有荧光或可呈色的化学物质，便能提供光源，使化学物质产生荧光反应。借此，由外部观察是否有荧光反应，便能知道样品有没有结合化学物质，或者是结合化学物质的样品是否存在。
[0003]已知的荧光技术系统通常包含一激发光源、一感光元件、一聚光装置。当光源照射在样品上，样品吸收能量产生光致荧光效应后发出荧光，但因为荧光信号微弱且亦受其他光源干扰如激发光源，需通过聚光装置收集后才能由感光元件感测。上述的聚光装置通常由多片透镜、反射镜及放射光滤片(Emission Filter)组成，其光路复杂且不容易精确。而且光源通常为汞灯、氙灯或卤素灯等，虽其发光波长涵盖范围长，但激发光源需针对不同的荧光指示剂下去做选择波段，所以还必须使用不同滤镜做搭配，耗费成本高且激发能量弱。而感光元件感测光信号后将其转为电流信号，又需通过转阻放大器(Trans-1mpedanceAmplifier, TIA)将此电流信号转换为模拟电压信号，再利用模拟数字转换电路(Analog toDigital Converter, ADC)将模拟电压信号转为数字电压信号，才能得出所需的实验要据，如此一来手续繁杂又需增加额外成本支出。
[0004]一般由外部判断荧光反应的技术，是直接接收荧光，当荧光强度高于特定值，便视为有荧光反应。然而接收荧光的技术，容易受环境影响，难有稳定的准确度。且已知的荧光检测技术装置大体上为体积庞大的复杂系统，携带不便，如有须检测的样品需带回实验室才有办法进行检测，浪费时间且麻烦。
[0005]有鉴于上述问题，本发明提供了一种方便且检测准确度更为稳定的一种荧光检测方法。
【发明内容】
[0006]因此本发明的一目的在于提供一种荧光检测方法，利用灰阶影像与比对技术准确快速地分辨出样品是否有荧光信号。
[0007]将荧光检测试剂加入样品中；将样品盛装至一样品盘中。其中该样品盘包含至少一列背景样品孔。以及至少一列待测样品孔。以一背景光源照射该样品盘。取得该样品盘的一背景灰阶影像。
[0008]根据本发明一实施方式，上述荧光检测方法还包含下述步骤。均值滤波背景灰阶影像。二值化背景灰阶影像。根据二值化后的背景灰阶影像，计算出背景样品孔的边缘位置。根据背景样品孔的边缘位置，计算出待测样品孔的边缘位置。取得位于背景样品孔内的灰阶像素数据，并将其平均，作为一背景信号临界值。根据待测样品孔的边缘位置以及背景信号临界值，对待测样品孔进行荧光信号读取作业。
[0009]依据本发明又一实施方式，上述对待测样品孔进行荧光信号读取作业的步骤，包含以背景光源照射样品盘；取得样品盘的一待测灰阶影像。均值滤波待测灰阶影像，取得位于待测样品孔内的灰阶像素数据。逐个判断位于待测样品孔内的灰阶像素数据是否大于背景信号临界值；以及当位于待测样品孔内的灰阶像素数据大于背景信号临界值时，判断为读出荧光信号。
[0010]依据本发明另一实施方式，上述对待测样品孔进行荧光信号读取作业的步骤，还包含根据待测灰阶影像，取得位于背景样品孔内的灰阶像素数据；根据位于背景样品孔内的灰阶像素数据，判断是否读出光源信号，当未读出光源信号时，判断为异常状况，并终止实验。
[0011]依据本发明再一实施方式，其中对于取得样品盘的背景灰阶影像的步骤是以电荷率禹合元件(Charge-couple Device, CO))或互补式金属氧化物半导体(ComplementaryMetal Oxide Semiconductor, CMOS)等光感测器为之。
[0012]依据本发明又一实施方式，其中背景样品孔上覆盖有一减光片或偏光片，且待测样品孔上覆盖有一突光滤镜。而背景光源为一发光二极管或一激光光源，且背景光源照射样品盘的方向，是选自样品盘的上方、侧边、下方、及其组合。
[0013]根据本发明另一实施方式是在提供一种荧光检测方法包含下述步骤。均值滤波背景灰阶影像。二值化背景灰阶影像。根据二值化后的背景灰阶影像，计算出背景样品孔的边缘位置。根据背景样品孔的边缘位置，计算出待测样品孔的边缘位置。取得位于背景样品孔内的灰阶像素数据，并将其平均，作为一背景信号临界值。根据待测样品孔的边缘位置以及背景信号临界值，对待测样品孔进行荧光信号读取作业。其中对待测样品孔进行荧光信号读取作业的步骤，包含以背景光源照射该样品盘。以相异曝光的时间取得该样品盘的多个待测灰阶影像。均值滤波待测灰阶影像。取得位于待测样品孔内的灰阶像素数据。逐个判断位于待测样品孔内的灰阶像素数据是否大于背景信号临界值。以及当位于待测样品孔内的灰阶像素数据大于背景信号临界值时，判断为读出荧光信号。
[0014]依据本发明再一实施方式，上述其中取得样品盘的待测灰阶影像可为两次、三次、四次或以上，且曝光时间随着待测样品距离光感测器递增而递增，通过撷取待测灰阶影像的时间相异以浮动方式让起始测量值一致。
[0015]根据本发明又一实施方式是在提供一种荧光检测方法包含下述步骤。一定位步骤。均值滤波背景灰阶影像。二值化背景灰阶影像。根据二值化后的背景灰阶影像，计算出背景样品孔的边缘位置。根据背景样品孔的边缘位置，计算出待测样品孔的边缘位置。取得位于背景样品孔内的灰阶像素数据，并将其平均，作为一背景信号临界值。根据待测样品孔的边缘位置以及背景信号临界值，对待测样品孔进行荧光信号读取作业。
[0016]依据本发明另一实施方式，其中该定位步骤包含直接由样品管内的样品透出光定位。
[0017]依据本发明又一实施方式，其中该定位步骤包含实验前样品孔座标定位。
[0018]依据本发明再一实施方式，其中该定位步骤包含由样品管加上一减光片或一偏光做样品管定位。[0019]依据本发明另一实施方式，其中该定位步骤包含外加至少两光源辅助定位。
[0020]借此，本发明的荧光信号读取作业不易受环境的影响，且移动后的荧光信号读取作业也可以通过定位步骤做测量的校准；且本发明方法的稳定度与准确度高。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1绘示本发明一实施方式的荧光检测方法的流程图；
[0022]图2绘示本发明一实施方式的荧光检测方法的流程图；
[0023]图3绘示图1的对待测样品孔进行荧光信号读取作业的流程图；
[0024]图4绘示对待测样品孔进行荧光信号读取作业的另一实施方式流程图；
[0025]图5绘示应用本发明的实施方式荧光感测装置示意图；
[0026]图6绘示多次取得样品盘的待测灰阶影像的整合示意图。
【具体实施方式】
[0027]图1绘示本发明一实施方式是在提供一种荧光检测方法，包含下述步骤。将荧光检测试剂加入样品中。将样品盛装至一样品盘中，其中样品盘包含至少一列背景样品孔，以及至少一列待测样品孔。以一背景光源照射样品盘。取得样品盘的一背景灰阶影像。请参照图2，如上述的荧光检测方法还包含下述步骤。均值滤波背景灰阶影像。二值化背景灰阶影像。根据二值化后的背景灰阶影像，计算出背景样品孔的边缘位置。根据背景样品孔的边缘位置，计算出待测样品孔的边缘位置。取得位于背景样品孔内的灰阶像素数据，并将其平均，作为一背景信号临界值。根据待测样品孔的边缘位置以及背景信号临界值，对待测样品孔进行荧光信号读取作业。
[0028]其中前述的样品，能结合荧光或可呈色的化学物质。但不确定其中有多少部分已结合前述的化学物质，亦不知有多少部分未结合。因此需要利用前述方法分析。
[0029]其中取得灰阶影像的技术，是取得背景光源中穿过背景样品孔的可见光影像，再分析影像中每个像素的亮度所得。其中均值滤波的技术，是将背景灰阶影像分割成多个由4x4立方的16像素组成的区块。将16个像素的灰阶值相加后除以16，再用此值表示此区块的灰阶值，便能完成均值滤波的技术。其中二值化的技术是将大于临界灰阶值的区块设定为极大值，也就是黑色；将小于临界灰阶值的区块设定为极小值，也就是白色，进而完成二值化。且临界灰阶值并非固定数值，而是依照使用者需求而调整，故于此不讨论之。
[0030]背景光源所发射的光线会透过背景样品孔，因此当背景灰阶影像二值化而成黑白画面后，便能利用白色的发光部分在背景灰阶影像上找到背景样品孔的边缘，并确定背景样品孔的位置。由于早已知道背景样品孔与待测样品孔的尺寸与位置等相对关系，因此能根据背景样品孔的边缘与位置，在背景灰阶影像上标示出待测样品孔的边缘与位置。
[0031]图3绘示图2的对待测样品孔进行荧光信号读取作业的流程图。根据背景灰阶影像中背景样品孔在二值化前的灰阶像素数据，取平均值设定为背景信号临界值。利用背景信号临界值，便能对待测样品孔进行荧光信号读取作业，判断待测样品孔中是否有荧光反应，其方法如下。以背景光源照射样品盘。取得样品盘的一待测灰阶影像。均值滤波待测灰阶影像。取得位于待测样品孔内的灰阶像素数据。逐个判断位于待测样品孔内的灰阶像素数据是否大于背景信号临界值。当位于各待测样品孔内的灰阶像素数据大于背景信号临界值时，判断为读出荧光信号。
[0032]图4是绘示本发明的另一实施方式流程图，其对待测样品孔进行荧光信号读取作业的步骤如下，以背景光源照射样品盘。以相异曝光的时间取得该样品盘的多个待测灰阶影像。均值滤波待测灰阶影像。取得位于待测样品孔内的灰阶像素数据。逐个判断位于待测样品孔内的灰阶像素数据是否大于背景信号临界值。当位于各待测样品孔内的灰阶像素数据大于背景信号临界值时，判断为读出荧光信号。
[0033]图5及图6为应用本发明一实施方式的一突光感测装置400不意图及绘不多次取得样品盘的待测灰阶影像的整合示意图。其中图6详细说明其取得样品盘的待测灰阶影像的步骤。第一次取得样品盘的一待测灰阶影像，其光感测器500撷取待测灰阶影像的曝光时间为2秒。第二次取得样品盘的一待测灰阶影像，其光感测器500撷取待测灰阶影像的曝光时间为4秒。第三次取得样品盘的一待测灰阶影像，其光感测器500撷取待测灰阶影像的曝光时间为6秒。第四次取得样品盘的一待测灰阶影像，其光感测器500撷取待测灰阶影像的曝光时间为8秒。由图6中可以看到光感测器500感测超过背景信号临界值的待测样品410，随着时间变化而不同，以黑色实心表待测样品410已到达背景信号临界值，离光感测器500越远的待测样品410其大于背景信号临界值的时间需越长，所以需使用此曝光时间随着所述多个待测样品距离光感测器递增而递增的方法，能避免不同待测样品410起始背景信号临界值的实验数据上的误差，但如果曝光时间太久，离光感测器500越近的待测样品410其所得的灰阶影像会影响整个实验准确及一致性。最后将这四次所感测的四灰阶影像再做均值滤波，借此能得到更为精确且一致的多个待测样品410数据。
[0034]由于前面取得背景信号临界值的过程中，已界定出待测样品孔的位置，因此待测灰阶影像不需要二值化。只要根据待测灰阶影像，找出各待测样品孔的灰阶像素数据，并与背景信号临界值比较，便能确认各待测样品孔内是否有荧光反应。
[0035]另外，前述的荧光信号读取作业，除了前述方法外，还能增加下述方法。根据待测灰阶影像，取得位于背景样品孔内的灰阶像素数据。根据位于背景样品孔内的灰阶像素数据，判断是否读出光源信号，当未读出光源信号时，判断为异常状况，并终止实验。
[0036]也就是说，当所有待测样品孔内皆无荧光反应时，便停止荧光信号读取作业。如此实验人员可以立刻检查或更换样品，以利实验的续行。
[0037]其中取得背景灰阶影像或待测灰阶影像的技术，可以利用互补式金属氧化物半导体或是电荷耦合元件等光感测器撷取。而光感测器撷取待测灰阶影像的时间相异以浮动方式让起始测量值一致，即通过预设的软件判断，随着不同待测样品的荧光强度而变化，当荧光强度递增而其曝光时间递减。
[0038]其中待测样品孔上覆盖着荧光滤镜。由于非荧光的光线无法通过荧光滤镜，因此能确保通过待测样品孔的都是样品所发射的荧光。
[0039]其中背景光源可以是发光二极管，或者是激光光源。当要激发不同样品发出荧光时，能选择使用适合的色光，而不必再搭配激发光滤片(Excitation filter)加上控制马达来替换滤片得到所需的激发波长。
[0040]值得一提的是本发明利用均值滤波其灰阶影像，并使用二值化做分析样品的技术，使用更为单纯且背景信号临界值可依据不同实验的需求而做更动，比起已知技术还须对实验数据图做分析更为简单直观，再加上对多个待测样品作多次相异时间撷取多个灰阶影像，来整合取得多个待测样品最准确一致的数据。
[0041]而根据本发明又一实施方式是在提供一种荧光检测方法包含下述步骤。将样品盛装至一样品盘中，其中样品盘包含至少一列背景样品孔，以及至少一列待测样品孔。一定位步骤。以一背景光源照射样品盘。取得样品盘的一背景灰阶影像。均值滤波背景灰阶影像。二值化背景灰阶影像。根据二值化后的背景灰阶影像，计算出背景样品孔的边缘位置。根据背景样品孔的边缘位置，计算出待测样品孔的边缘位置。取得位于背景样品孔内的灰阶像素数据，并将其平均，作为一背景信号临界值。根据待测样品孔的边缘位置以及背景信号临界值，对待测样品孔进行荧光信号读取作业。
[0042]依据本发明一实施方式，上述该定位步骤包含以下方式。当样品管置放于样品孔，样品孔的座标可直接由样品管内的样品的透出光通过一分析软件来加以定位其样品孔座标，该透出光的分析方法不限定为影像分析或光电分析。
[0043]或者在此荧光检测方法的实验前通过一软件设定好样品孔的座标做定位。
[0044]也可在样品管外额外加上一减光片或一偏光做样品管的定位，利用减光片或偏光片所透射的光源通过一分析软件来加以定位其样品孔座标，该透出光的分析方法不限定为影像分析或光电分析。
[0045]或者通过外加至少两光源如发光二极管来辅助定位，其光源放置在样品孔两侧，并通过上述的分析软件分析样品受光照射位置并定位其座标。
[0046]虽然本发明已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视所附的权利要求书所界定的范围为准。
【权利要求】
1.一种荧光检测方法，其特征在于，包含: 将荧光检测试剂加入样品中； 将样品盛装至一样品盘中，其中该样品盘包含至少一列背景样品孔及至少一列待测样品孔 ； 以一背景光源照射该样品盘；以及 取得该样品盘的一背景灰阶影像。
2.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，还包含: 均值滤波该背景灰阶影像； 二值化该背景灰阶影像； 根据二值化后的该背景灰阶影像，计算出该列背景样品孔的边缘位置； 根据该列背景样品孔的边缘位置，计算出该列待测样品孔的边缘位置； 取得位于该列背景样品孔内的灰阶像素数据，并将其平均，作为一背景信号临界值；以及 根据该列待测样品孔的边缘位置以及该背景信号临界值，对该列待测样品孔进行荧光信号读取作业。
3.根据权利要求2所述的荧光检测方法，其特征在于，对该列待测样品孔进行荧光信号读取作业的步骤包含: 以该背景光源照射该样品盘； 取得该样品盘的一待测灰阶影像； 均值滤波该待测灰阶影像； 取得位于该列待测样品孔内的灰阶像素数据； 逐个判断位于该列待测样品孔内的灰阶像素数据是否大于该背景信号临界值；以及 当位于该列待测样品孔内的灰阶像素数据大于该背景信号临界值时，判断为读出荧光信号。
4.根据权利要求2所述的荧光检测方法，其特征在于，取得该样品盘的该背景灰阶影像的步骤是以互补金氧式半导体或电荷耦合元件为之。
5.根据权利要求2所述的荧光检测方法，其特征在于，该列待测样品孔上覆盖有一滤镜。
6.根据权利要求2所述的荧光检测方法，其特征在于，该背景光源为发光二极管或激光。
7.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，还包含: 均值滤波该背景灰阶影像； 二值化该背景灰阶影像； 根据二值化后的该背景灰阶影像，计算出该列背景样品孔的边缘位置； 根据该列背景样品孔的边缘位置，计算出该列待测样品孔的边缘位置； 取得位于该列背景样品孔内的灰阶像素数据，并将其平均，作为一背景信号临界值；根据该列待测样品孔的边缘位置以及该背景信号临界值，对该列待测样品孔进行荧光信号读取作业； 以该背景光源照射该样品盘；以相异曝光的时间取得该样品盘的多个待测灰阶影像； 均值滤波所述多个待测灰阶影像； 取得位于该列待测样品孔内的灰阶像素数据； 逐个判断位于该列待测样品孔内的灰阶像素数据是否大于该背景信号临界值；以及 当位于该列待测样品孔内的灰阶像素数据大于该背景信号临界值时，判断为读出荧光信号。
8.根据权利要求7所述的荧光检测方法，其特征在于，取得该样品盘的该背景灰阶影像的步骤是以互补金氧式半导体或电荷耦合元件为之。
9.根据权利要求7所述的荧光检测方法，其特征在于，相异曝光的时间由一软件判断，随着荧光强度递增而递减。
10.根据权利要求7所述的荧光检测方法，其特征在于，该列待测样品孔上覆盖有一滤镜。
11.根据权利要求7所述的荧光检测方法，其特征在于，该背景光源为发光二极管或激光。
12.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，还包含: 一定位步骤； 均值滤波该背景灰阶影像； 二值化该背景灰阶影像； 根据二值化后的该背景灰阶影像，计算出该列背景样品孔的边缘位置； 根据该列背景样品孔的边缘位置，计算出该列待测样品孔的边缘位置； 取得位于该列背景样品孔内的灰阶像素数据，并将其平均，作为一背景信号临界值；以及 根据该列待测样品孔的边缘位置以及该背景信号临界值，对该列待测样品孔进行荧光信号读取作业。
13.根据权利要求12所述的荧光检测方法，其特征在于，对该列待测样品孔进行荧光信号读取作业的步骤包含: 以该背景光源照射该样品盘； 取得该样品盘的一待测灰阶影像； 均值滤波该待测灰阶影像； 取得位于该列待测样品孔内的灰阶像素数据； 逐个判断位于该列待测样品孔内的灰阶像素数据是否大于该背景信号临界值；以及 当位于该列待测样品孔内的灰阶像素数据大于该背景信号临界值时，判断为读出荧光信号。
14.根据权利要求12所述的荧光检测方法，其特征在于，取得该样品盘的该背景灰阶影像的步骤是以互补金氧式半导体或电荷耦合元件为之。
15.根据权利要求12所述的荧光检测方法，其特征在于，该列待测样品孔上覆盖有一滤镜。
16.根据权利要求12所述的荧光检测方法，其特征在于，该背景光源为发光二极管或激光。
17.根据权利要求12所述的荧光检测方法，其特征在于，该定位步骤包含直接由样品管内的样品透出光定位。
18.根据权利要求12所述的荧光检测方法，其特征在于，该定位步骤包含实验前样品孔座标定位。
19.根据权利要求12所述的荧光检测方法，其特征在于，该定位步骤包含由样品管加上一减光片或一偏光做样品孔定位。
20.根据权利要求12所述的荧光检测方法，其特征在于，该定位步骤包含外加至少两光源辅助定位。
【文档编号】G01N21/64GK103472040SQ201310151570
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年4月27日 优先权日:2012年6月6日
【发明者】邓秉华, 林清格, 陈宏铭 申请人:瑞基海洋生物科技股份有限公司