含血液成分的试样的处理方法

含血液成分的试样的处理方法
【专利摘要】本发明提供了一种抑制对血液中存在的血细胞以外的细胞的损坏、并对红细胞和白细胞产生损坏的简便的处理方法。在一种实施方式中，涉及一种含有血液成分的试样的处理方法，包括混合含有血液成分的试样与含有表面活性剂A的液体，所述表面活性剂A为通式R1-O-（EO）n-R2（I）所表示的非离子性表面活性剂。在其他的方式中，涉及一种含血液成分的试样的处理方法，包括混合含有血液成分的试样与含有表面活性剂A和表面活性剂B的液体、或者含有表面活性剂A的液体及含有表面活性剂B的液体，所述表面活性剂A为通式R1-O-（EO）n-R2（I）表示的非离子性表面活性剂，所述表面活性剂B对红细胞的溶解性高于所述表面活性剂A对红细胞的溶解性。
【专利说明】含血液成分的试样的处理方法
【技术领域】
[0001]本公开涉及含血液的试样的处理方法、分离含血液的试样中的稀少细胞以及核酸的方法、CTC数测定方法、以及试剂盒。
【背景技术】
[0002]血液的细胞成分为红细胞、白细胞、血小板，但是血液中也稀少地存在除此以外的细胞。作为其中一个例子，可以举出血中循环肿瘤细胞/CTC (Circulating Tumor Cell)。认为癌的转移是由于癌细胞通过血管、淋巴管运送到体内的其他部位并增殖而引起的。并且，报告了血液中的CTC数与癌的转移的可能性以及预后是相关的，并且已知为了作为癌(尤其是乳癌等转移性癌)的诊断、预后诊断、以及治疗效果的预测或判定的指标，而测定血液中的 CTC 数的计数、CTC 的核酸(Circulating Tumor cell ；Evolving Evidence andFuture Challenges.The oncologist2009 ;14 ;1070_1082)。
[0003]作为血液中的CTC的分离、检测技术，有如下方法:通过针对CTC特异性表面抗原的抗体来捕捉分离血液中的CTC的方法(特许3834326号、特开2007-178193)、利用了粘附的分离方法(W02005/043121、W02006/078994 )、利用密度梯度的分离方法(特开2010 — 075073、W095/20429)、利用过滤器的分离方法(W02006/116327、W02008/155398)、测定CTC的端粒酶活性的方法(W02010/071114)、通过使用了低渗溶液的溶血的分离方法(W02004/056978)、利用了流式细胞仪的方法(W02008/057437)等。为了检测、定量、计数用上述分离的物质，进行PCR、利用了有亲和性的物质的核酸的测定，另外，进行组合了抗体、荧光染料的光学CTC的测定是一般的。

【发明内容】

[0004]发明要解决的问题
[0005]为了在含血液成分的试样中的稀少细胞活着的情况下分析，或者分离并培养，需要在不对所述稀少细胞产生大的损坏的情况下，高效地去除血液中的细胞成分(尤其是红细胞及白细胞)。
[0006]因此，本公开提供一种抑制对含血液成分的试样中的血细胞以外的细胞的损坏、并可迅速排除血细胞的简便的处理方法。另外，提供一种通过去除血细胞等来提高CTC的纯度从而可抑制CTC的计数、核酸测定时的噪声、并可进行CTC的检测的简便的处理方法、或者分离或检测方法。
[0007]用于解决问题的手段
[0008]本公开在一个方式中，涉及一种含血液成分的试样的处理方法，包括混合含血液成分的试样与含有表面活性剂A的液体，不使用固定剂，所述表面活性剂A为下述通式(I)表示的非离子性表面活性剂。
[0009]R1-O- (EO) n-R2 (I)
[0010][所述式(I)中，R1为具有分支链的碳数为12?40的烃基，EO表示氧乙烯基，η为EO的平均附加摩尔数,为23?50, R2为氢原子或碳数为I?3的烃基。]
[0011]本公开在又一方式中，涉及一种含血液成分的试样的处理方法，包括:混合含有血液成分的试样与含有表面活性剂A及表面活性剂B的液体、或含有表面活性剂A的液体及含有表面活性剂B的液体，所述表面活性剂A为下述通式(I)表示的非离子性表面活性剂，所述表面活性剂B对红细胞的溶解性高于所述表面活性剂A对红细胞的溶解性。
[0012]R1-O- (EO) n-R2 (I)
[0013][所述式(I)中，R1为具有分支链的碳数为12?40的烃基，EO表示氧乙烯基，η为EO的平均附加摩尔数,为23?50, R2为氢原子或碳数为I?3的烃基。]
[0014]本公开在又一方式中，涉及一种含血液成分的试样的处理方法，包括:混合含有血液成分的试样与含有表面活性剂A及表面活性剂B的液体、或含有表面活性剂A的液体及含有表面活性剂B的液体，所述表面活性剂A为聚氧乙烯辛基十二烷基醚(Ε0=23?50)，所述表面活性剂B为对红细胞的溶解性高于所述表面活性剂A对红细胞的溶解性的非离子性表面活性剂，并且为从聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯辛基十二烷基醚(Ε0=8?22)、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、以及它们的组合所组成的组中选择的非离子性表面活性剂。
[0015]本公开在又一方式中，涉及一种分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法，包括:通过本公开涉及的处理方法处理含有血液成分的试样；以及从处理后的试样中分离或检测稀少细胞或核酸。
[0016]本公开在又一方式中，涉及一种测定含血液成分的试样中的CTC (循环肿瘤细胞)数或CTC的核酸的方法，包括:通过本公开涉及的处理方法来处理含有血液成分的试样；或者通过本公开涉及的分离或检测方法分离或检测血液成分中的稀少细胞或核酸。
[0017]本公开在又一方式中，涉及一种含血液成分的试样中的稀少细胞的分析方法，包括:在通过本公开涉及的处理方法处理含有血液成分的试样之后，通过包括细胞的动态观察或活性测定的方法进行分析。
[0018]本公开在又一方式中，涉及一种试剂盒，用于本公开涉及的处理方法、本公开涉及的分离或检测方法、本公开涉及的CTC数或CTC的核酸的测定方法、和/或本公开涉及的分析方法，所述试剂盒包含所述表面活性剂A和/或所述表面活性剂B。
[0019]发明效果
[0020]根据本公开，能够抑制对含有血液的试样中存在的血细胞以外的细胞的损坏，并溶解红细胞、对白细胞产生损坏。
【专利附图】

【附图说明】
[0021]图1是示出表面活性剂N0.2和表面活性剂N0.1的混合物的混合比与癌细胞的生存率之间的关系的曲线图的一个例子；
[0022]图2是示出表面活性剂N0.3和表面活性剂N0.1的混合物的混合比与癌细胞的生存率之间的关系的曲线图的一个例子；
[0023]图3是对表面活性剂混合物的处理之后用离心分离回收的癌细胞进行培养的结果的显微镜观察照片的一个例子；
[0024]图4是显微镜观察对没有进行表面活性剂混合物的处理的(A)试样以及进行了表面活性剂混合物的处理的(B)试样进行过滤处理之后的试样的照片的一个例子；
[0025]图5是对含有经绿色荧光染色的癌细胞(SNU-1)和经蓝色荧光染色的白细胞的含癌细胞的血液试样进行了表面活性剂混合物的处理之后的荧光显微镜观察的结果的一个例子；
[0026]图6是对含有癌细胞(SNU-1)悬浮液或白细胞的含血液成分的试样进行了表面活性剂混合物的处理之后(A)的试样以及未进行表面活性剂混合物的处理(B)的试样进行库尔特式的流式细胞仪分析的结果的一个例子；
[0027]图7是对含有癌细胞(SNU-1)和白细胞的含有血液成分的试样进行了表面活性剂混合物的处理之后(A)的试样以及未进行表面活性剂混合物的处理(B)的试样用库尔特式的流式细胞仪分析后的结果的一个例子；
[0028]图8是示出对悬浮在生理盐水中的含癌细胞(SNU-1)或含有白细胞的含血液成分的试样用各种PH的表面活性剂混合物进行处理之后的生存率的曲线图的一个例子。
【具体实施方式】
[0029]预计今后循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell:CTC)等血液中的稀少细胞的分析会更加盛行，并需求更简便、损耗少的方法。IOml的血液中通常含有数百亿个红细胞、数千万个白细胞，CTC为O?数千个左右。因此，直接分析CTC时的技术问题很多，例如需要分离、浓缩等处理。因此，期待开发从血液中更高效和/或简便地浓缩分离CTC的技术。
[0030]利用了抗原抗体反应的分离方法中，存在使用附加了抗体的磁性颗粒和磁场来从血液中浓缩细胞的方法(特许3834326号、特开2007-178193)。但是，血液中密集存在阻碍抗体与目标细胞接触的血细胞，需要反应时间、细胞的回收时间。而且在血细胞的存在下，反应体积变大，每体积的试剂量也增加，因此花费成本。另外，在使用颗粒浓缩时，由于大量裹入血细胞因此纯度变低导致假阳性。并且在反复进行去除血细胞的洗浄时，有可能损失目标细胞。
[0031 ] 利用粘附的分离方法(W02005/043121、W02006/078994 )在血液存在下，血细胞、血
小板堆积在一般的细胞培养用的培养皿或载体的底面上，因此，癌细胞不能与培养皿粘附不能分离癌细胞。因此，有将抗体等亲和性高的物质固定在培养皿或载体上来使细胞粘附的方法，但是这也同样需要细胞和具有亲和性的物质在底面接触，血细胞成了阻碍。因此，为了增加接触次数需要在载体侧的结构上下工夫并需要搅拌，结构上下的工夫、搅拌方法等增加了复杂性。
[0032]离心分离法中，血液中离心后从下面开始按红细胞层、白细胞层的顺序形成细胞层。很多癌细胞由于具有与白细胞密度和尺寸近似的密度和尺寸，因此多数白细胞混入癌细胞中，离心分离的纯度受到影响，导致假阳性。另外，由于各层非常接近，因此混入大量红细胞得不到高回收率和纯度。
[0033]通过密度梯度离心法进行的分离(特开2010-075073、W095/20429)作为从血液中回收细胞的方法被通用。但是，利用了细胞密度的分离中，由于癌细胞和白细胞的单核细胞的大小和密度接近，因此单核细胞大量混入，导致假阳性。密度分离离心法过程繁杂，例如分离后必须在不扰乱液面的情况下回收细胞的层，以使分离后各层不混乱。
[0034]使用了过滤器的分离(W02006/116327、W02008/155398)是使用了稀少细胞的大小之差和血细胞的变形能力的分离，用于分离血细胞和癌细胞。大多数红细胞、白细胞通过过滤器，但是部分红细胞、白细胞残留在膜片上。另外，如果使用孔大小小于8 μ m的膜片的孔，则容易产生堵塞，相反为了提高血细胞通过过滤器的效率而增加滤过时的压力时，流速变大稀少细胞受到损坏，或者稀少细胞通过孔，从而回收率也下降。
[0035]血液I μ L中存在数百万个红细胞、数千?I万个左右的白细胞，因此流式细胞仪一般不能直接计数。因此，需要添加去除红细胞的溶血剂，并且测定时为了检测各细胞而需要稀释。稀释IOmL的血液，从数百亿个红细胞、数亿?数千个白细胞中对各细胞进行计数，分离癌细胞并对其进行计数是非常难的。至于电阻式，由于存在与癌细胞同等程度大小的白细胞，因此分离后混入大量白细胞，导致假阳性。
[0036]如此，对于检测、分离稀少细胞来说，现有的分离浓缩技术可以说由于血细胞的残留，在必要的灵敏度、效率和特异性方面不足。如果能进行试样中的血细胞的处理(分离、去除、排除等)，则在使用了抗原抗体反应的分离中，能够在溶解后离心，在重新悬浊的少量体积的溶液中反应，由此缩短试剂成本和反应时间。另外，在利用了粘附的分离中，也能够使用培养用的培养皿，进行培养和粘附分离。另外，在使用了离心分离、密度梯度离心法的分离中，稀少细胞的回收变得容易。另外，在使用了过滤器的情况下，能够使分析容易。即，通过处理含有血液的试样中的血细胞，能够减少稀少细胞的计数和定量中的误差因素(假阳性)，迅速进行测定。
[0037]另外，如果能够在含有血液的试样中的稀少细胞存活的情况下进行分析，或者分离培养，则能够更详细地分析、解析稀少细胞。另外，一般，在血细胞去除中用作溶血试剂的非离子表面活性剂的皂苷或Triton会破坏细胞，也会对癌细胞等稀少细胞产生损坏甚至致死，并且细胞被破坏。因此，一般在使用表面活性剂解析目标细胞的情况下，如W02010/071114中所述，预先用甲醛、多聚甲醛之类的交联试剂(固定试剂)固定含有血液的试样中的稀少细胞之后再与溶血试剂反应。前述那样的甲醛、多聚甲醛之类的交联试剂通常经由游离的氨基形成分子间交联，由此来维持细胞膜、细胞结构。但是，虽然能够期待维持细胞的结构，但是通过该固定化操作而产生的稀少细胞的分离培养、观察、活性测定、药效评价等进一步的解析是困难的。
[0038]另外，W02010/071114中记载的表面活性剂的浓度下不能直接溶解血液，会对癌细胞产生损坏。另外，很多白细胞也生存着。
[0039]在使用溶血试剂的情况下一般同时使用的固定剂即甲醛、多聚甲醛是剧毒物，因此有可能会对使用者的健康产生影响。虽存在W02010/071114、W02004/056978中记载的那样的通过氯化铵盐或低渗溶液去除血细胞的方法，但是这些方法由于反应条件中需要较大的稀释倍率，因此存在反应槽变大的问题。另外，由于没有表面活性剂等那样的溶解力，因此容易得到细胞片等凝集物。
[0040]本公开基于以下知识:在一个或多个实施方式中，通过使用对红细胞的溶解性和对细胞的损坏低的表面活性剂A，溶解红细胞并且能够抑制对血液中存在的稀少细胞的损坏。另外，本公开基于以下知识:在一个或多个实施方式中，当组合对红细胞的溶解性和对细胞的损坏高的表面活性剂B、以及对红细胞的溶解性和对细胞的损坏低的表面活性剂A来处理血液试样时，能够溶解红细胞并对白细胞产生损坏并且能够抑制对血液中存在的稀少细胞的损坏。另外，这些处理具有能够低成本进行的优点。[0041]通过表面活性剂A抑制对血液中的稀少细胞的损坏并能够排除血细胞的详细机理并不清楚，但是可以如下考虑。从细胞的观点来看，细胞的骨格、膜的差异是重要因素。在体内循环的血细胞由于通过毛细血管等细胞的骨格容易变形，另外，细胞膜的磷脂双层的流动性大，磷脂的各疏水部之间的相互作用弱。因此当受到表面活性剂的作用时容易破坏。另一方面考虑稀少细胞与细胞角蛋白等特征性细丝状结构遍布细胞内并结合在细胞膜等上，另外，与血细胞相比脂质双层的流动性也小并且难以被破坏。另外，考虑从表面活性剂的观点看，表面活性剂与细胞膜上的蛋白质、胆固醇、磷脂相互作用，溶解细胞。表面活性剂A优选与磷脂的疏水基的结构接近，带有分支链的分子结构，另外，以疏水基和亲水基、例如烷基和环氧乙烷的附加数的平衡，来控制由于溶解力和亲水基对立体抑制的影响，由此在不破坏稀少细胞的情况下溶解血细胞。但是，本公开也可以不限定于这些机理地进行解释。
[0042]通过表面活性剂A和B的组合来抑制对血液中的稀少细胞的损坏并能够排除血细胞的详细机理并不清楚，但是可以如下考虑。通过在表面活性剂A中组合对血细胞溶解性高的表面活性剂B，表面活性剂A和B形成混合胶束，该混合胶束以一定比例在不干扰表面活性剂A对血细胞的选择性的情况下与血细胞选择性作用，通过表面活性剂B高的溶解性来迅速溶解接触的血细胞。即，考虑能够快速排除血细胞，由此进一步抑制对癌细胞的损坏。但是，本公开也可以不限定于这些机理地进行解释。
[0043]根据本公开的处理方法，能够抑制对含有血液的试样中的血细胞以外的细胞的损坏并简便地排除血细胞。因此，在一个或多个实施方式中，通过进行本公开的处理方法，例如，能够简便地进行血液中的稀少细胞、特别是CTC (循环肿瘤细胞)的分离、浓缩、测定、和/或培养、分析。另外，例如即使在进行CTC的染色、标记的情况下白细胞被染色，通过本公开的处理方法进行处理之后，白细胞也成了死细胞，或者由于受到损坏染色物等漏出到外面，降低了来自白细胞的信号(噪声)。因此，即使是使用了蓄积在细胞内的荧光物质、或利用代谢转变成突光物质的物质、例如使用CellTracker (Green CMFDA/C7025invitrogen)的非特异性的染色方法，在一个或多个实施方式中，通过进行本公开的处理方法，也能够抑制CTC的检测、测定、观察等的假阳性。
[0044][含血液成分的试样]
[0045]在本说明书中，“含有血液成分的试样”也可称为“含血液成分的试样”，是可应用本公开的处理方法的试样,可以举出血液、含有红细胞成分的血液来源物、血液或血液来源物混合存在的体液、以及由它们制备的试样等。“体液”在一个或多个实施方式中，可包括血液、淋巴液、腹水、胸膜液、髄液、唾液、尿、以及母乳。作为血液，可以举出从生物体采集的血液，作为所述生物体，可举出人或人以外的动物(例如，哺乳类)。作为含有红细胞成分的血液来源物，可以举出从血液分离或制备并含有红细胞成分的物质或者它们的稀释/浓缩物，例如含有去除了血浆的血细胞组分、血细胞浓缩物、血液或血细胞的冻干物、对全血进行了溶血处理的溶血试样、离心分离血液、自然沉降血液、洗浄血细胞、特定的组分等。它们当中，在不限定的一个或多个实施方式中，从简便且迅速的处理的观点以及抑制对血液中的稀少细胞的损坏的观点来说，优选血液或含有血细胞成分的源自血液的血细胞作为含有所述血液的试样。
[0046]在本说明书中，“血液中的稀少细胞”或“含有血液成分的试样中的稀少细胞”是指人或人以外的动物的血液中可含有的细胞成分(红细胞、白细胞、以及血小板)以外的细胞，包括肿瘤细胞和/或癌细胞。一般将血液中循环的肿瘤细胞或癌细胞称为CTC。作为血液中的稀少细胞数，一般在血液IOml中含有O?数千个。“血液中的稀少细胞”或“含有血液成分的试样中的稀少细胞”在一个或多个实施方式中，是指选自癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间叶干细胞、胎儿细胞、以及它们的组合所组成的组的细胞。另外，在本说明书中，作为分离或检测对象的“核酸”在一个或多个实施方式中，是选自血液成分中的RNA和DNA、癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮前驱细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、叶间干细胞、胎儿细胞的RNA和DNA、以及它们的组合所组成的组的核酸。
[0047]在本说明书中，“血细胞的排除”是指红细胞的溶血、和/或、白细胞的生长抑制。红细胞的溶解和白细胞的生长抑制例如能够用实施例的方法来确认。此外，在本说明书中，“白细胞的生长抑制”可包括白细胞的消灭(降低生存率)、溶解、和/或白细胞的增殖抑制。在一个或多个实施方式中，在含有血液的试样中，红细胞的溶血能够通过测定浊度的变化来观察。在一个或多个实施方式中，值会根据测定池的大小或多或少发生变化，但是也可以将值从初始浊度起达到1/2以下作为溶血的基准。具体地，将含有血液的试样30 μ I与试剂30 μ I混合，能够使用微孔板检测仪通过测定确认。例如，对于在所述条件下混合了血液和PBS或蒸馏水的溶液而言，以波长650nm的吸光度值计，初始浊度为2?1.5，溶血发生包括0.8以下、0.6以下或0.5以下。另外，在一个或多个实施方式中，在含有血液的试样中，白细胞的生长抑制包括将白细胞的生存率设定为50%以下、不足50%、40%以下、不足40%、或30%以下。
[0048]含有所述表面活性剂A的液体优选具有下述(I)的血细胞去除效果。
[0049](I)用蒸馏水稀释规定量的血液，以使用微孔板检测仪和600nm以上的波长的光用吸光光度法测定的吸光度值为I以上且小于2，由此制备基准样品，
[0050]替代所述基准样品中的蒸馏水，使用含有2.5?5w/v%的所述表面活性剂A的液体来制备被检样品，
[0051]使用600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定的所述被检样品的吸光度值达到所述基准样品的吸光度值的二分之一的时间为I小时以内。
[0052]此外，对于含有所述表面活性剂A的液体而言，关于上述(I)的血细胞去除效果，使用600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定的所述被检样品的吸光度值达到所述基准样品的吸光度值的二分之一的时间优选为60分钟以内，更优选40分钟以内，进一步优选30分钟以内。
[0053]含有所述表面活性剂A和表面活性剂B的液体、或者、含有表面活性剂A的液体和表面活性剂B的液体或者这两种液体的混合物优选具有下述(2)的血细胞去除效果。
[0054](2)用蒸馏水稀释规定量的血液，以使用微孔板检测仪和600nm以上的波长的光用吸光光度法测定的吸光度值为I以上且小于2，由此制备基准样品，
[0055]替代所述基准样品中的蒸馏水，使用含有2.5?5w/v%的所述表面活性剂A和表面活性剂B的液体来制备被检样品，
[0056]使用600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定了的所述被检样品的吸光度值为所述基准样品的吸光度值的二分之一的时间为0.5小时以内。
[0057]此外,对于含有所述表面活性剂A和表面活性剂B的液、含有表面活性剂A的液体和含有表面活性剂B的液体或者这两种液体的混合物而言，关于上述(2)的血细胞去除效果，使用600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定了的所述被检样品的吸光度值变为所述基准样品的吸光度值的二分之一的时间优选在30分钟以内，更优选在20分钟以内，进一步优选为15分钟以内。
[0058]此外，关于用于评价所述血细胞去除效果的所述被检样品，含有所述表面活性剂A的液体中的所述表面活性剂A的浓度例如为0.001w/v%~10w/v%。另外，含有所述表面活性剂A和表面活性剂B的液中的、所述表面活性剂A和所述表面活性剂B的总浓度例如为0.001w/v% ~IOw/v%。
[0059]在本说明书中，由η个要素组成的组的“它们的组合”可以包括所述群中2~η个要素的组合。
[0060][表面活性剂Α]
[0061]本公开的处理方法中使用的表面活性剂A为下述式(I)表示的非离子性表面活性剂。表面活性剂A单独、或者通过与对红细胞的溶解性更高的表面活性剂B组合，能够在维持对红细胞和白细胞的损坏的同时，抑制由表面活性剂B对血液中的稀少细胞的损坏。从缩短处理时间、进一步抑制对稀少细胞的损坏的观点来看，优选组合表面活性剂A和对红细胞溶解性更高的表面活性剂B (后述)。
[0062]R1-O- (EO) n-R2 (I)
[0063][所述式(I)中，R1为具有分支链的碳数为12~40的烃基，EO表示氧乙烯基，η为EO的平均附加摩尔数,为23~50, R2为氢原子或碳数为I~3的烃基。]
[0064]所述式(I)的R1从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，为具有分支链的碳数为12~40的烃基，优选的是具有分支链的碳数为12~30的烷基。在一个或多个实施方式中，所述烃基和烷基的碳数从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，优选12~28，更优选的是14~26、进一步优选的是16~24、更进一步优选的是18~22、更进一步优选的是20。作为所述式(I)的R1的优选的实施方式，有异己基、异壬基、异癸基、异十二烷基、异十六烷基、己基癸基、己基十二烷基、己基十六烷基、辛基癸基、辛基十二烷基、辛基十六烷基、壬基癸基、壬基十二烷基、壬基十六烷基，从同样的观点来看，优选辛基十二烷基。所述式(I)的R2为氢原子或碳数为I~3的烃基，在一个或多个实施方式中，从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，为氢原子或碳数为I~3的烷基，所述烷基在一个或多个实施方式中，为甲基、乙基、丙基或异丙基。从抑制对血液中的稀少细胞的损坏并进行血细胞的排除的观点来看，更优选下述式(II)作为所述式(I)。
[0065]
【权利要求】
1.一种含血液成分的试样的处理方法，包括: 混合含血液成分的试样与含有表面活性剂A及表面活性剂B的液体、或者含有表面活性剂A的液体及含有表面活性剂B的液体； 所述表面活性剂A为下述通式(I)所示的非离子性表面活性剂，所述表面活性剂B对红细胞的溶解性高于所述表面活性剂A对红细胞的溶解性，
R1-O- (EO) n-R2 (I) 所述式(I)中，R1表示具有支链的碳数为12~40的烃基，EO表示氧乙烯基，η为EO的平均附加摩尔数，为23~50, R2为氢原子或碳数为I~3的烃基。
2.一种含血液成分的试样的处理方法,包括:混合含有血液成分的试样与含表面活性剂A的液体， 不使用固定剂， 所述表面活性剂A为下述通式(I)表示的非离子性表面活性剂，
R1-O- (EO) n-R2 (I) 所述式(I)中，R1表示具有支链的碳数为12~40的烃基，EO表示氧乙烯基，η为EO的平均附加摩尔数，为23~50, R2为氢原子或碳数为I~3的烃基。
3.根据权利要求1或2所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述表面活性剂A为聚氧乙烯亚烷基醚(Ε0=23~50)。
4.权利要求1或3所述的含血液成分的试样的处理方法，其中， 所述表面活性剂B为从聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚、聚氧乙烯亚烷基醚(Ε0=8~22)、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、以及它们的组合所组成的组中选择的非离子性表面活性剂。
5.根据权利要求1、3和4中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述表面活性剂B为下述通式(III)表示的非离子性表面活性剂，
R3-O- (AO) m/ (EO) n-R4 (III) 所述式(III)中，R3为碳数为I~24的烷基，R4为氢原子或碳数为I~3的烷基，AO表示碳数为3~6的氧化烯基，EO表示氧乙烯基，m和η分别为AO及EO的平均附加摩尔数，m为I~100的数，η为O~50的数，“/”表示AO基和EO基也能够不论顺序地以随机或嵌段中的任一种方式附加。
6.根据权利要求1、3至5中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述表面活性剂B为下述式(IV)表示的非离子性表面活性剂，
R5-O- (EO) n-R6 (IV) R5表示碳数为12~40的烃基，EO表示氧乙烯基，η为EO的平均附加摩尔数，为8~22,R6为氢原子或碳数为I~3的烃基。
7.根据权利要求1、3至6中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，所述表面活性剂B为下述式(VI)表示的非离子性表面活性剂，
R7-COO- (EO) n-R8 (VI) 所述式(VI)中，R7表示碳数为10~40的烃基，EO表示氧乙烯基，η为EO的平均附加摩尔数，为6~160, R8为氢原子或碳数为I~3的烃基。
8.根据权利要求1、3至7中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，所述表面活性剂B为具有糖残基作为亲水性部分、并具有脂肪链或烷基链作为疏水性部分的表面活性剂。
9.根据权利要求1、3至8中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述表面活性剂B为蔗糖月桂酸酯。
10.一种含血液成分的试样的处理方法，包括: 混合含有血液成分的试样与含有表面活性剂A及表面活性剂B的液体、或含有表面活性剂A的液体及含有表面活性剂B的液体， 所述表面活性剂A为聚氧乙烯辛基十二烷基醚(EO=23~50)， 所述表面活性剂B为对红细胞的溶解性高于所述表面活性剂A对红细胞的溶解性的非离子性表面活性剂，并且为从聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯辛基十二烷基醚(EO=8~22)、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、以及它们的组合所组成的组中选择的非离子性表面活性剂。
11.根据权利要求1和3至10中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述表面活性剂A和所述表面活性剂B的混合的量比(A/B)(重量比)为50/50以上且低于100/0。
12.根据权利要求2至11中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，含有所述表面活性剂A的液体具有下述(I)的血细胞去除效果: (1)用蒸馏水稀释规定量的 血液，以使使用微孔板检测仪和600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定的吸光度值为I以上且低于2，由此制备基准样品， 替代所述基准样品中的蒸馏水，使用含有2.5~5w/v%的所述表面活性剂A的液体来制备被检样品， 使用600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定的所述被检样品的吸光度值达到所述基准样品的吸光度值的二分之一的时间为I小时以内。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法， 含有所述表面活性剂A和表面活性剂B的液体、或者含有表面活性剂A的液体和含有表面活性剂B的液体具有下述(2)的血细胞去除效果: (2)用蒸馏水稀释规定量的血液，以使使用微孔板检测仪和600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定的吸光度值为I以上且低于2，由此制备基准样品， 替代所述基准样品中的蒸馏水，使用含有2.5~5w/v%的所述表面活性剂A和表面活性剂B的液体来制备被检样品， 使用600nm以上的波长的光通过吸光光度法测定的所述被检样品的吸光度值达到所述基准样品的吸光度值的二分之一的时间为0.5小时以内。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的含血液成分的试样的处理方法，其中，所述含血液成分的试样的处理方法是抑制所述试样可含有的稀少细胞的生存率降低并溶解红细胞，并且/或者降低白细胞的生存率的方法。
15.一种分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法，包括:通过权利要求I至14中任一项所述的处理方法处理含有血液成分的试样；以及从处理后的试样中分离或检测稀少细胞或核酸。
16.根据权利要求15所述的分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法，其中，所述稀少细胞或核酸的分离或检测包括:通过从使用亲和性的分离、密度分离、离心分离、粘附分离、大小分离、流式细胞仪、电分离、磁性分离、播种至培养基、以及它们的组合所组成的组中选择的方法进行。
17.根据权利要求15或16所述的分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法， 所述稀少细胞是从癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间叶干细胞、胎儿细胞以及它们的组合所组成的组中选择的细胞。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞或核酸的方法， 所述核酸为从血液成分中的RNA及DNA、癌细胞、循环肿瘤细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、癌干细胞、上皮细胞、造血干细胞、间叶干细胞、胎儿细胞的RNA及DNA、以及它们的组合所组成的组中选择的核酸。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的分离或检测含血液成分的试样中的稀少细胞的方法，包括: 针对所述稀少细胞，使用下述检测方法中附随的标记方法来标记，所述检测方法是从利用了放射性物质的检测方法、利用了发光现象的检测方法、使用了色素的检测方法、利用了磁性的检测方法、电检测方法、光学检测方法、以及它们的组合所组成的组中选择的方法。
20.一种测定含血液成分的试样中的CTC (循环肿瘤细胞)数或CTC的核酸的方法，包括:通过权利要求1至14中任一项所述的处理方法处理含有血液成分的试样；或者通过权利要求15至19中任一项所述的分`离或检测方法从含有血液成分的试样中分离或检测稀少细胞或核酸。
21.一种含血液成分的试样中的稀少细胞的分析方法，包括:在通过权利要求1至14中任一项所述的处理方法处理含有血液成分的试样之后，通过包括细胞的动态观察或活性测定的方法进行分析。
22.—种试剂盒,包含用于权利要求1至14中任一项所述的处理方法、权利要求15至19中任一项所述的分离或检测方法、权利要求20所述的CTC数测定方法、和/或权利要求21所述的分析方法的、所述表面活性剂A和所述表面活性剂B。
23.—种试剂盒，包含用于权利要求2至14中任一项所述的处理方法、权利要求15至19中任一项所述的分离或检测方法、权利要求20所述的CTC数测定方法、和/或权利要求21所述的分析方法的、所述表面活性剂A。
【文档编号】G01N33/48GK103513021SQ201310247504
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年6月20日 优先权日:2012年6月20日
【发明者】高木英纪 申请人:爱科来株式会社