一种血液和尿液中亚硝酸盐的快速检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种血液、尿液中亚硝酸盐的快速检测方法。利用亚硝酸盐与Griess试剂发生重氮化偶合反应，形成偶氮化合物，进行浊点萃取，将有色偶氮化合物沉于在离心管底，将管底红色与标准色阶比较，根据颜色深浅判断其含量。由于浊点萃取的富集倍数大，且血液、尿液经脱色及脱蛋白处理，大大消除干扰，体系中亚硝酸盐检测限可达0.01μg/mL。该发明具有简单、快速、灵敏度高、可现场检测等特点。
【专利说明】一种血液和尿液中亚硝酸盐的快速检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于体内药物检测【技术领域】，具体涉及一种血液和尿液中亚硝酸盐的快速检测方法。
【背景技术】
[0002]一氧化氮(NO)的生化、生理、病理研究在世界生物和医学界广泛展开。作为相对稳定的NO代谢产物，亚硝酸盐(N02_)在最近10年成为世界医学界的热点，亚硝酸盐是日常饮食和饮用水中常见的无机盐类。一般认为过量的摄入该类物质可能导致高铁血红蛋白血症，并在体内转变成致癌性的亚硝胺。通过测定尿液、血液中的NCV的含量来反映体内NO含量和作为反应多项身体机能的重要指标。
[0003]目前亚硝酸盐检测最通用的方法是食品安全国家标准GB 5009.33- 2010，该标准第一法中采用离子色谱法检测各类食品中的亚硝酸盐和硝酸盐，包括水果、蔬菜、鱼、肉、奶等各种类型的样品。同时，NO2-的测定还有荧光光度法、高效液相色谱法、可见分光光度法等。血液或尿液中NOf的检测通常用Griess检测试剂盒，然而血液或尿液中NOf含量低，基体复杂，常常干扰实验结果，难以达到检测需求。研究小组之前利用高效液相色谱(HPLC)对血液尿液及组织中硝酸盐与亚硝酸盐检测进行过较深入的研究，已经取得了不错的效果，申请了发明专利(201310129291.X)，进一步研究发现，将亚硝酸盐与Griess试剂反应，经浊点萃取(CPE )进行分离、富集，直接目视比色，可进行血液尿液中亚硝酸盐高灵敏、简单快速检测，该技术不需仪器设备，可现场检测，具有更明显的优势。建立一种灵敏度高、特异性强、简单快速尿液、血液中的亚硝酸盐测定方法，对临床医学中涉及一氧化氮信号因子的诸多疾病的诊断和治疗有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种简单快速、灵敏度、能现场检测、尿液中亚硝酸盐定性、半定量的方法。
[0005]本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
[0006]除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。
[0007]一种血液和尿液中亚硝酸盐的检测方法，包括以下步骤:
(1)亚硝酸盐标准色阶制作:取浓度为10.0Pg/mL的NO2-标准溶液0.01,0.05,0.10、
0.30、0.70、1.0mL于刻度离心管中，用蒸懼水稀释至5mL,加入GriessA试剂250μ?,混合均勻；lmin后加入GriessB试剂250?,混合均勻，加入非离子表面活性剂0.5mL,盐0.1?
0.5g，涡旋混合lmin，离心分相，在离心管底出现红色由浅至深的微滴色阶溶液；
(2)样品检测:
尿液的检测:取1mL尿液,硫酸锌0.4?1.0g,加入脱色剂0.5?1.0g,混合均勻，离心脱色，滤纸过滤除去脱色剂；取5mL脱色后的尿液，加入GriessA试剂250μ?，混合均匀；Imin后加入GriessB试剂250μ?,混合均勻，放置5min后,加入非离子表面活性剂0.5mL,盐0.1?0.5g，涡旋混合lmin，离心分相，将管底形成的微滴的颜色与步骤(I)标准色阶比较，判断其含量；
血液的检测:取5 mL新鲜血液，放入离心机中离心，取上清液，加入0.lmol/L氢氧化钠溶液0.2mL和硫酸锌0.2g,混合均匀，加入乙腈lmL，离心分离，取上清液2mL于1mL离心管中用蒸懼水定容至5mL,加入GriessA试剂250μ?,混合均勻；lmin后加入GriessB试剂250μ?，混合均匀，放置5min，加入非离子表面活性剂0.5mL,盐0.1?0.5g，涡旋混合lmin，离心分相，将管底形成的微滴的颜色与步骤(I)标准色阶比较，判断其含量；
其中，步骤(I) (2)中所述的GriessA试剂为50mg对氨基苯磺酸溶于10%醋酸1.5mL和去离子水3mL ；GriessB试剂为4mg N-1-萘乙二胺盐酸盐溶于10%醋酸4mL ；
所述脱色剂为:活性炭、分子筛、硅酸镁、氧化钙、滑石粉中之一种；
所述非离子表面活性剂包括Triton X-114、Triton X-110、壬基酚聚氧乙烯醚类NP-7和 NP-9、Tergitol TMN-6 中之一种；
所述盐包括氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、氯化铵中之一种。
[0008]所述的离心条件为离心时间5?15min,离心速率3000?1000r / min。
[0009]相对于现有技术，本发明具有以下显著优点:
1、通过N02_与Griess试剂形成的偶氮化物，一是有颜色，二是改变N02_本身的极性，利用浊点萃取起到了分离及高富集的作用，使NO2-检测的灵敏度大大提高，用目视比色灵敏度达到了 0.0lPg/mL。
[0010]2、所采用的非离子表面活性剂浊点低，在常温下基本可以进行萃取，操作条件温和。
[0011]3、利用脱色剂、脱蛋白剂进行尿液、血液的颜色、蛋白的脱除，消除了比色时干扰，大大提高了检测灵敏度及目视比色的准确度。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0013]实施例1
利用本发明检测人体尿液中亚硝酸盐的含量。
[0014]1、亚硝酸盐标准色阶制作:取浓度为lOPg/mL的N02_标准溶液0.01、0.05、
0.10、0.30、0.70、1.0mL mL于刻度离心管中，用蒸懼水稀释至5mL,加入GriessA试剂250μ?,混合均勻；lmin后加入GriessB试剂250μ?,混合均勻，放置5min后,加入非离子表面活性剂Triton X-114 0.5mL,硫酸铵0.2g,润旋混合lmin,离心分相,在离心管底出现红色由浅至深的微滴色阶溶液；
2、样品处理及测定结果
取1mL尿液于1mL离心管中，加入1.0g活性炭,混合均勻,4000r/min离心1min,滤纸过滤除去活性炭。取5.0mL脱色后的尿液于1mL离心管中，加入GriessA试剂250μ?，混合均勻。Imin后加入GriessB试剂250μ?,混合均勻,放置5min后,加入非离子表面活性剂Triton X-114 0.5mL，硫酸铵0.2g，涡旋混合lmin，离心分相，离心管底液滴红色介于亚硝酸盐含量0.0^g/mL和0.05Pg/mL之间。
[0015]实施例2 利用本发明检测人体血液中亚硝酸盐的含量。
[0016]1.按实施例1制作亚硝酸盐的标准色阶，非离子表面活性剂为Triton X-100，盐为氯化钠0.5g。
[0017]2.样品处理及测定结果
取5 mL新鲜血液,4000r/min离心15min。取上清液于离心管中，加入0.lmol/L氢氧化钠溶液0.2mL和硫酸锌0.2g,混合均勻，加入乙腈ImL,离心分离,取上清液2mL于1mL离心管中用蒸懼水定容至5mL,加入GriessA试剂250μ?,混合均勻，Imin后加入GriesssB试剂250μ?，混合均匀，加入非离子表面活性剂Triton X-100 0.5mL,氯化钠0.5g，涡旋混合lmin，离心分相，离心管底液滴红色介于亚硝酸盐含量0.3(^g/mL和0.7(^g/mL之间。
[0018]实施例3
利用本发明检测人体血液中亚硝酸盐的含量。
[0019]1.按实施例1制作亚硝酸盐的标准色阶，非离子表面活性剂为NP-7，盐为氯化铵
0.3g0
[0020]2.样品处理及测定结果
取5mL新鲜血液于离心管中，6000r/min离心8min,取上清液于离心管中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液0.2mL和硫酸锌0.2g,混合均匀，加入乙腈lmL，离心分离，取上清液2mL于1mL离心管中用蒸懼水定容至5mL,加入GriessA试剂250μ?,混合均勻。Imin后加入GriessB试剂250μ?，混合均匀，放置5min后，加入非离子表面活性剂NP-7 0.5mL,氯化铵
0.3g，涡旋混合lmin，离心分相，离心管底液滴无色，亚硝酸盐未检出。
[0021]实施例4
利用本发明检测人体尿液中亚硝酸盐的含量。
[0022]1.按实施例1制作亚硝酸盐的标准色阶，非离子表面活性剂为TMN-6，盐为硫酸钠
0.5g。
[0023]2.样品处理及测定结果
2、样品处理及测定结果
取1mL尿液于1mL离心管中，加入分子筛1.0g,混合均勻，5000r/min离心1min,滤纸过滤除去分子筛。取5.0mL脱色后的尿液于1mL离心管中，加入GriessA试剂250μ?,混合均勻。Imin后加入GriessB试剂250μ?,混合均勻,放置5min后,加入非离子表面活性剂TMN-6 0.5mL，硫酸钠0.5g，涡旋混合lmin，离心分相，离心管底液滴红色介于亚硝酸盐含量 0.7(^g/mL 和 L OPg/mL 之间。
【权利要求】
1.一种血液和尿液中亚硝酸盐快速检测方法，包括以下步骤: (1)制备亚硝酸盐标准色阶溶液:取浓度为10.0 μ g/mL的N02_标准溶液0.01,0.05、0.10,0.30,0.70、1.0mL于刻度离心管中，用蒸馏水稀释至5mL,加入GriessA试剂250 μ L，混合均勻；lmin后加入GriessB试剂250 μ L,混合均勻，加入非离子表面活性剂0.5mL,盐0.1?0.5g，涡旋混合lmin，离心分相，在离心管底出现红色由浅至深的微滴色阶溶液。 (2)检测尿液中的亚硝酸盐:取1mL尿液，硫酸锌0.4?1.0g，加入脱色剂0.5?1.0g,混合均勻,离心脱色,滤纸过滤除去脱色剂；取5mL脱色后的尿液,加入GriessA试剂250 μ L,混合均勻；lmin后加入GriessB试剂250 μ L,混合均勻，放置5min后,加入非离子表面活性剂0.5mL，盐0.1?0.5g，涡旋混合lmin，离心分相，将管底形成的微滴的颜色与步骤(I)标准色阶比较，判断其含量。 (3)检测血液中的亚硝酸盐:取5mL新鲜血液，放入离心机中离心，取上清液，加入.0.lmol/L氢氧化钠溶液0.2mL和硫酸锌0.2g，混合均匀，加入乙腈lmL，离心分离，取上清液2mL于1mL离心管中用蒸懼水定容至5mL,加入GriessA试剂250 μ L,混合均勻；lmin后加入GriessB试剂250 μ L,混合均勻，放置5min,加入非离子表面活性剂0.5mL,盐0.1?.0.5g，涡旋混合lmin，离心分相，将管底形成的微滴的颜色与步骤(I)标准色阶比较，判断其含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述的GriessA试剂为50mg对氨基苯磺酸，并溶于1.51^10%醋酸和3mL去离子水中；GriessB试剂为4mg N-1-萘乙二胺盐酸盐，并溶于4mL10%醋酸中。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述的非离子表面活性剂为TritonX-114, Triton X-110、壬基酚聚氧乙烯醚类 NP-7 和 NP-9、Tergitol TMN-6 中的一种；
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述的盐为氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、氯化铵中的一种；
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:尿液的检测中所述脱色剂为活性炭、分子筛、硅酸镁、氧化钙、滑石粉中的一种；
6.权利要求1所述的检测方法，其特征在于:样品检测中所述的离心条件为离心时间.10 ?30min,离心速率 3000 ?10000r/min。
【文档编号】G01N21/78GK104280383SQ201310274145
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月2日 优先权日:2013年7月2日
【发明者】杨亚玲, 赵娇, 王军 申请人:云南健牛生物科技有限公司