用于聚集颗粒的系统和方法
【专利摘要】提供了一种聚集颗粒的方法，该方法包括：提供所述颗粒在悬浮介质中的悬浮液；以及使该悬浮液沿着通道流动，使得该流动悬浮液占据具有至少一种小于100μm的截面尺寸的一定体积。所述悬浮介质具有这样的粘弹性，使得所述悬浮液在通道中流动将颗粒中的至少一些向在所述一定体积中包含的聚集区域引导。
【专利说明】用于聚集颗粒的系统和方法
[0001]本申请是申请日为2008年6月5日，申请号为200880101686.6，发明名称为“用于聚集颗粒的系统和方法”的申请的分案申请。
[0002]相关申请
[0003]本申请要求2008年6月7日提交的美国临时专利申请第60/924，998号的优先权。发明领域
[0004]在本发明的一些实施方案中，本发明涉及流式细胞术，更具体但不排他地涉及荧光激活细胞分选(FACS)。
_5] 发明背景
[0006]流式细胞术是用于同时多参数分析单个细胞的物理和/或化学特征的一种技术。流式细胞术允许对细胞(或其它微观颗粒)进行计数、检查和分选，并提供单个颗粒的物理和/或化学特征的多参数分析。所要分析的细胞向检查点流动，且该流动被设计成使得颗粒依次运动到达检查点，所以每一颗粒被单独地分析。
[0007]一种特定的流式细胞术被称为荧光激活细胞分选(FACS)。FACS根据每一个细胞的具体光散射和荧光特征，将生物细胞或其它颗粒的多相混合物分选到两个或更多个容器中，每一次一个细胞。它是一种有用的科学仪器，因为它提供了来自单个细胞的荧光信号的快速、客观且定量的记录以及有特定兴趣的细胞的物理分离。
[0008]该技术在许多领域中具有应用，包括分子生物学、病理学、免疫学、植物生物学和海洋生物学。
[0009]例如，在细胞生物学和免疫学的领域中，它与荧光标记抗体一起使用，该荧光标记抗体与特异性靶细胞结合，并允许定量分析血细胞计数器中的抗原。该方法广泛用于研究蛋白质表达和蛋白质定位、细胞表面抗原定量(在不同临床病变例如白血病中的血液细胞上的CD标记物)、细胞内抗原和核抗原(调节性T细胞中的转录因子如FoxP3的激活)、细胞活力(通过Annexin/PI染色来定量凋亡细胞)以及其它。
[0010]流式细胞术和FACS在医学中也具有广泛应用，尤其是在移植、血液学、肿瘤免疫学和化疗、遗传学和体外受精(IVF)中的精子分选。
[0011]一般，在流动血细胞计数器中，光束指向流体流，其中颗粒在该流体中一个接一个排列。许多检测器指向流体流通过光束的位点。通过光束的每一个悬浮的颗粒以某种方式(例如散射光)与所述光相互作用，且来自所述颗粒的光被所述检测器拾取。检测到的光被分析，以提供关于每一单个颗粒的物理和化学结构的各种类型的信息。
[0012]流动血细胞计数器通常具有5个主要组件:
[0013]流动池，其中液体流运载和排列所述细胞，使得它们依次运动通过用于感测的光束；
[0014]光源；
[0015]检测器；
[0016]放大系统；以及[0017]用于分析放大的检测信号的计算机。
[0018]在流动池中排列颗粒通过将外力施加于颗粒来实现。在市场上可获得的流动血细胞计数器中所使用的施加外力的一种方法在本领域中称为“鞘流”。其它方法包括将光和超声施加于颗粒。
[0019]发明概沭
[0020]在一些实施方案中，本发明涉及流式细胞术，更具体但不排他地涉及荧光激活的细胞分选(FACS)。
[0021]本发明的一些实施方案的一个方面涉及排列颗粒，以便它们依次运动例如通过流动血细胞计数器的光束。
[0022]因此，本发明的一些实施方案的一个方面涉及聚集颗粒的方法，该方法包括:
[0023]提供颗粒在第一悬浮介质中的悬浮液；以及
[0024]使该悬浮液沿着具有至少一种小于100 μ m的截面尺寸的通道流动；
[0025]其中所述第一悬浮介质具有这样的粘弹性，以使得所述悬浮液在所述通道中的流动增加了颗粒在所述通道内的聚集区域中的浓度。
[0026]在示例性实施方案中，聚集区域是在通道的高度的一半处。
[0027]在一些实施方案中，所述聚集区域具有与通道的长度垂直的截面，所述截面具有与在相同位置的通道的截面相同的形状，但更小。
[0028]可选择地，所述聚集区域与所述通道同轴。
[0029]在本发明的一些示例性实施方案中，所述悬浮液包括多种尺寸的颗粒；以及
[0030]所述粘弹性使得悬浮液在所述通道中的流动优先将较大的颗粒向所述聚集区域引导。
[0031]可选择地，提供悬浮液包括:
[0032]获得所述颗粒在第二悬浮介质中的悬浮液；以及
[0033]将所述第二悬浮介质与所述第一悬浮介质交换。
[0034]可选择地，提供悬浮液包括:
[0035]提供具有各种粘弹性的多种悬浮介质；
[0036]响应所述介质的粘弹性，从所述多种悬浮介质中选择所述第一悬浮介质；以及
[0037]将颗粒悬浮于所选择的悬浮介质中。
[0038]在一些实施方案中，选择包括:响应所述颗粒的尺寸来选择。
[0039]在示例性实施方案中，提供悬浮液包括:
[0040]将颗粒悬浮于试验悬浮介质中；
[0041]使该悬浮液沿着微通道流动，使得该流动悬浮液具有至少一种小于100 μ m的尺寸；
[0042]估计聚集质量；以及
[0043]改变所述试验悬浮介质的粘弹性，以改进聚集质量。
[0044]可选择地，该方法包括:
[0045]使该悬浮液以一定流速流动；
[0046]估计聚集质量；以及
[0047]增大所述流速以改进聚集质量。[0048]可选择地，增大所述试验悬浮介质的粘弹性包括将高分子量聚合物添加到该悬浮液中。
[0049]可选择地，该通道的深度小于100 μ m。
[0050]可选择地，该通道的宽度小于100 μ m。
[0051]可选择地，该通道具有各自小于100 μ m的深度和宽度。
[0052]在一些示例性实施方案中,所述颗粒是细胞。
[0053]在一些示例性实施方案中，第二悬浮介质包括血清。
[0054]根据本发明的一些实施方案的另一个方面，还提供了用于聚集流动颗粒的系统，该系统包括:
[0055]通道，其具有壁和壁之间的底部；
[0056]流体源，其包括样品流体；以及
[0057]流体引导系统(fluid direction system),其被配置成将所述样品流体从所述流体源通过入口弓I导入所述通道中，
[0058]其中所述样品流体包括悬浮于液体中的颗粒，所述液体具有粘弹性，该粘弹性减轻了施加外力场以在聚集区域聚集颗粒的需要。
[0059]在示例性实施方案中，所述聚集区域是在所述通道的高度的一半处。
[0060]根据一些不例性实施方案,该系统包括:
[0061]光源，其在所述入口的下游的检查区提供与所述聚集区域传感连通(sensorycommunication)的探测光束；以及
[0062]检测器，其被配置成使用探测光束检测所述检查区中的颗粒。
[0063]可选择地，所述颗粒包括细胞。
[0064]在一些实施方案中,所述通道具有在5 μ m和100 μ m之间的至少一种截面尺寸。
[0065]可选择地，所述至少一种截面尺寸包括与所述通道的底部垂直的截面的尺寸。
[0066]可选择地，所述通道具有底部和壁，且在所述壁之间的距离大于100 μ m。
[0067]可选择地，所述系统包括各自具有不同粘弹性的多种流体以及使用每一种流体来聚集不同尺寸的颗粒的说明书。
[0068]根据本发明的一些实施方案，提供了一种试剂盒，其包括:
[0069]多种流体，各自独立地被包装在带有尺寸范围指示的包装物中；以及
[0070]说明书，其使用所述多种流体中的每一种来聚集指定尺寸范围的颗粒。
[0071]本发明的一些实施方案的一个方面涉及评价液体的弹性的方法，该方法包括:
[0072]向介质中添加单分散粒度分布的颗粒以获得悬浮液；
[0073]使该悬浮液在具有至少一种100 μ m或更小的截面尺寸的通道中流动；
[0074]在颗粒在通道中流经给定距离之后获得颗粒的空间分布；以及
[0075]分析所述空间分布以获得介质的弹性。
[0076]可选择地，分析包括:响应介质的粘度进行分析，且所述方法包括获得介质的粘度。
[0077]可选择地，获得所述介质的粘度包括测定所述介质的粘度。
[0078]在一些实施方案中，所述颗粒在获得的悬浮液中的体积分数是在0.001%和1%之间。[0079]可选择地，获得的悬浮液的体积分数是0.1 %。
[0080]根据本发明的一些实施方案的一个方面，还提供了一种评价颗粒和粘合剂之间的相互作用的方法，其包括:
[0081]将所述颗粒聚集在通道的底部以上的层；以及
[0082]使所述聚集的颗粒在固定于所述底部的粘合剂以上流动。
[0083]可选择地，将所述颗粒聚集，使得至少90%的颗粒的中心是在具有小于通道的高度的一半的厚度的层中。
[0084]在一些实施方案中，聚集颗粒包括在根据本发明的实施方案的方法中聚集。
[0085]在一些实施方案中，评价颗粒和粘合剂之间的相互作用包括进行多次以上方法，每次用不同深度的通道。
[0086]本发明的一些实施方案的一个方面涉及用于评价颗粒和粘合剂之间的相互作用的装置，该装置包括:
[0087]多个系统，各自根据本发明的实施方案，且所述系统中的至少一个具有通道，该通道具有固定于所述通道的底部的至少一部分之处的粘合剂。
[0088]可选择地，所述多个系统具有共同的流体源。
[0089]可选择地，所述多个系统具有共同的流体引导系统。
[0090]可选择地，该装置具有控制器，所述控制器用于在与其它系统独立的各系统中控制流体进入通道的流速。
[0091]可选择地，并非所有的通道都具有相同深度。
[0092]可选择地，通道中的每一个具有与所有其它通道不同的深度。
[0093]在一些实施方案中，该装置被配置成在所有的通道中以相同聚集质量聚集颗粒。
[0094]除非另有规定，本文所使用的所有技术术语和/或科学术语具有与本发明所述领域普通技术人员所普遍理解的含义相同的含义。虽然类似或等同于文中所述的方法和材料的方法和材料可以用于实施或试验本发明的实施方案，但在以下描述了示例性方法和/或材料。在冲突的情况下，将以包括定义在内的专利说明书为准。另外，材料、方法和实施例仅是示例性的，而不期望必定是限制性的。
[0095]附图简沭
[0096]在这里仅仅作为例子参考附图描述了本发明的一些实施方案。现在详细地具体参考附图，强调所显示的细节作为例子，用于示例性论述本发明的实施方案。在这方面，参考附图的说明使本领域技术人员清楚本发明的实施方案如何实施。
[0097]在附图中:
[0098]图1是根据本发明的一个示例性实施方案的聚集颗粒的方法中采取的操作的流程图。
[0099]图2A是根据本发明的一个示例性实施方案的用于聚集流动颗粒的系统的示意图。
[0100]图2B是根据本发明的该实施方案的通道的示意图。
[0101]图3是根据本发明的一个实施方案的试剂盒的图示描述。
[0102]图4A是根据本发明的一个实施方案的FACS仪器的示意图。
[0103]图4B是根据本发明的一个示例性实施方案的测定介质的流变性质的方法中采取的操作的流程图。
[0104]图4C是根据本发明的一个示例性实施方案的研究颗粒-粘合剂相互作用的装置的示意图。
[0105]图5A是显示8 μ m直径聚苯乙烯微球在甘油溶液中的HF(粒度分布函数)实验值与垂直偏心距离的关系曲线的图。空心符号为实验结果。
[0106]图5B是显示在与图5A中所述的实验类似、但用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液的实验中获得的实验结果的图。空心符号为实验结果。实线是对实验结果的高斯拟合。
[0107]图6是显示在双对数坐标图上聚合物溶液PVP (头朝上三角)和PAA (头朝下三角)的刚性模量G’与振荡频率ω的关系曲线的图。插图显示了聚合物溶液的剪切粘度η (方形)和复数粘度l*n I (Λ，ν)(三角，如上)分别与Υ和ω的关系曲线。
[0108]图7是显示实验结果(空心符号)和理论预测(实曲线)之间的对比的图:8μπι颗粒，PVP溶液(△ ) ;8 μ m颗粒，PAA溶液O ;5 μ m颗粒，PAA溶液(?)。对应于PAA溶液的理论曲线没有可调节的参数。
[0109]图8A和8B是显示悬浮于PAA溶液中的PS微球的PDF与垂直偏心位置的关系曲线的图。空心符号为实验结果。图8A显示了 8μπι直径颗粒的结果；以及图8B显示了 5μπι直径颗粒的结果。实线用于引导眼睛。
[0110]图9Α是在根据本发明的一个实施方案的给定流动系统中预测给定悬浮介质的聚集质量的方法900中采取的操作的流程图。
[0111]图9Β是在根据本发明的一个实施方案的给定流动系统中预测给定悬浮介质的聚集质量的简化方法900’中采取的操作的流程图。
[0112]发明的具体实施方案的描述
[0113]综述
[0114]在本发明的一些实施方案中，本发明涉及流式细胞术，更具体但不排他地涉及荧光激活细胞分选(FACS)。
[0115]一些实施方案提供了使用微观流体流的颗粒聚集的方法或装置。
[0116]本发明的一些实施方案可以用一般不认为是微观流体的通道来实施。用任何给定尺寸的通道在离开入口的距离x/d可以获得相同的聚集质量，只要以下表达式保持其值:
[0117]
【权利要求】
1.一种聚集颗粒的方法，所述方法包括: 提供所述颗粒在第一悬浮介质中的悬浮液；以及 使所述悬浮液在通道中流动，所述通道具有纵轴和与其垂直的截面且具有至少一种小于100 μ m的截面尺寸； 其中所述第一悬浮介质具有粘弹性，使得所述悬浮液在所述通道中的流动聚集了所述颗粒在包括所述通道的中心的聚集区域中的浓度，并且其中所述颗粒的浓度在所述通道的中心处最大。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚集区域与所述通道的纵轴排列成行。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述截面的第一尺寸小于约100μ m而与所述第一尺寸正交的所述截面的第二尺寸比所述第一尺寸足够大，使得悬浮于所述第一悬浮介质中的所述颗粒在所述聚集区域中以基本上单个颗粒层的方式流动。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述截面的第一尺寸和与所述第一尺寸正交的所述截面的第二尺寸具有不大于约100 μ m的基本上相同的尺寸，使得悬浮于所述第一悬浮介质中的所述颗粒在基本上依次的聚集区域中流动。
5.根据权利要求1所述的方法，其中: 所述悬浮液包括第一尺寸和大于所述第一尺寸的第二尺寸的颗粒；以及 所述粘弹性使得所述悬浮液在所述通道中的流动优先将所述第二尺寸的颗粒向所述聚集区域引导。
6.根据权利要求1所述的方法，其中提供悬浮液还包括: 获得所述颗粒在第二悬浮介质中的悬浮液；以及 添加所述第二悬浮介质与所述第一悬浮介质。
7.根据权利要求1所述的方法，其中提供悬浮液还包括: 提供具有各种粘弹性的多种悬浮介质； 响应所述介质的粘弹性，从所述多种悬浮介质中选择所述第一悬浮介质；以及 将所述颗粒悬浮于所选择的悬浮介质中。
8.根据权利要求7所述的方法，其中选择包括:响应所述颗粒的尺寸来选择。
9.根据权利要求1所述的方法，还包括向所述悬浮液中添加高分子量的聚合物以增加所述第一悬浮介质的弹性。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述颗粒是细胞。
11.根据权利要求1所述的方法，其中提供颗粒在第一悬浮介质中的悬浮液包括用所述第一悬浮介质稀释血液。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述通道具有至少Imm的长度。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一悬浮介质由具有弹性和剪切稀化性质的材料配制，使得所述颗粒在所述聚集区域基本上独立于所述颗粒的流速而浓缩。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一悬浮介质是剪切稀化流体。
15.根据权利要求1所述的方法，其中在所述聚集区域中，约95%的所述颗粒的中心在小于约4μπι的层中被聚集。
16.根据权利要求1所述的方法，其中使所述悬浮液流动以造成颗粒以基本上单个颗粒层在所述通道的中心流动的方式发生。
17.根据权利要求1所述的方法，其中使所述悬浮液流动以造成颗粒以基本上多个颗粒层在所述通道的中心流动的方式发生。
18.根据权利要求1所述的方法，其中使所述悬浮液流动以造成至少90%的所述颗粒的中心位于具有小于所述通道的高度的一半的厚度的层中的方式发生。
19.根据权利要求1所述的方法，其中使所述悬浮液流动以造成约95%的所述颗粒的中心在具有约2μπι厚度的层中在距离通道入口至少约20mm处浓缩的方式发生。
20.根据权利要求1所述的方法，其中使所述悬浮液流动以造成颗粒被驱动离开通道壁，朝向所述通道的中平面的方式发生。
21.根据权利要求1所述的方法，其中使所述悬浮液流动以造成所述颗粒聚集在所述通道的中心水平平面中的方式发生。
22.根据权利要求9所述的方法，其中所述高分子量的聚合物包括高分子量的聚丙烯酰胺(PAA)。
23.一种用于聚集颗粒的流式细胞术设备，所述设备包括: 通道，所述通道具有由小尺寸和大尺寸界定的长度和截面，其中所述长度与所述小尺寸的比为至少10: I ;和 粘弹性的悬浮介质，所述悬浮介质被配置为在所述通道内流动， 其中所述悬浮介质具有粘 弹性，使得所述颗粒连同所述悬浮介质在所述通道中的流动聚集了所述颗粒在包括所述通道的中心的聚集区域中的浓度。
24.根据权利要求23所述的设备，其中所述长度与所述小尺寸的比为至少100: I。
25.根据权利要求23所述的设备，其中所述长度与所述小尺寸的比为至少1000: I。
26.根据权利要求23所述的设备，其中所述长度与所述大尺寸的比为至少10: I。
27.根据权利要求23所述的设备，其中所述小尺寸与所述大尺寸是基本上相等的。
28.根据权利要求23所述的设备，其中所述小尺寸为小于约100微米。
29.根据权利要求23所述的设备，其中所述小尺寸为小于约50微米。
30.根据权利要求23所述的设备，其中所述大尺寸与所述小尺寸的比为至少2: I。
31.根据权利要求23所述的设备，其中所述大尺寸与所述小尺寸的比为至少2: I。
32.一种用于聚集颗粒的流式细胞术设备，包括: 通道，所述通道具有纵轴和与其垂直的截面且具有至少一种小于100 μ m的截面尺寸；和 粘弹性的悬浮介质，其被配置为在所述通道内流动， 其中所述悬浮介质具有粘弹性，使得所述悬浮液在所述通道中的流动聚集了所述颗粒在包括所述通道的中心的聚集区域中的浓度，并且其中所述颗粒的浓度在所述通道的中心处最大。
33.根据权利要求32所述的流式细胞术设备，其中所述截面的第一尺寸小于约100μ m而与所述第一尺寸正交的所述截面的第二尺寸基本上比所述第一尺寸大，使得悬浮于所述粘弹性的悬浮介质中的所述颗粒在所述聚集区域中以基本上单个颗粒层的方式流动。
34.根据权利要求32所述的流式细胞术设备，其中所述截面的第一尺寸和与所述第一尺寸正交的所述截面的第二尺寸具有不大于约100 μ m的基本上相同的尺寸，使得悬浮于所述粘弹性的悬浮介质中的所述颗粒在基本上依次的聚集区域中流动。
35.根据权利要求32所述的流式细胞术设备，还包括至所述通道的入口，并且其中所述粘弹性的悬浮介质和所述通道的所述截面的尺寸被配置为使得与所述粘弹性的悬浮介质一起在所述通道内流动的约95%的颗粒的中心在具有约2μπι厚度的层中在距离所述通道入口至少约2 0mm处浓缩。
【文档编号】G01N15/14GK103543093SQ201310360814
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2008年6月5日 优先权日:2007年6月7日
【发明者】亚历山大·莱申斯基, 阿维谢伊·布兰斯基, 科琳·纳塔尼尔 申请人:技术研究及发展基金有限公司