一种从城市富营养化蓝藻水华水体中提取蓝藻毒素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从水体中提取蓝藻毒素的方法。该方法包括如下步骤：1）向待提取水体中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的终体积含量为40%，使冰醋酸的终体积含量为3-5%，300赫兹连续超声15-20min；2）将步骤1）超声处理后的水样调节pH为3，用0.45μm滤膜过滤，滤液于6500g离心5-10min，取上清；3）将步骤2）所得上清过固相萃取柱，用体积含量为40%的甲醇水溶液淋洗，再用体积含量为95%的甲醇水溶液洗脱，得到含有蓝藻毒素的洗脱液；4）从步骤3）洗脱液中获得蓝藻毒素。本发明采用固相萃取技术，连续富集、纯化、提取城市湖泊水体中的两种蓝藻毒素主要异构体MC-LR和MC-RR，具有所得产品纯度高，易于操作，成本低廉等特点。
【专利说明】一种从城市富营养化蓝藻水华水体中提取蓝藻毒素的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水环境保护领域，涉及一种从水体中提取蓝藻毒素的方法，特别涉及一种从城市富营养化蓝藻水华水体中提取两种主要蓝藻毒素类型RR和LR的方法。
【背景技术】
[0002]我国城市水体包括城市周边湿地湖泊、公园景观湖泊、城市河道等。然而最近20年来，随着城市化进程的快速推进，工农业以及生活污水携带着大量的营养盐排入城市湖泊水体中，导致城市水体营养化现象日益严重。水体的富营养化危害最大的一个表征现象就是蓝藻水华的出现，更严重的后果是蓝藻水华能释放蓝藻毒素危害人类和其他生物的安全。研究发现LR型蓝藻毒素(MC-LR)和RR型蓝藻毒素(MC-RR)是毒性最强，分布最广，最为常见的两种藻毒素类型。藻毒素不仅可以通过饮用水威胁动植物健康，而且可以在动植物体内富集，通过食物链的作用威胁人类健康。研究表明蓝藻毒素具有强烈的肝毒性和肿瘤促进作用，可打破生命体的磷酸化和脱磷酸化的过程，从而促进肿瘤的发生。其危害性越来越得到世界范围内的关注。尽管目前有关藻毒素形成及其生理生化方面的研究报道越来越多，但国际上藻毒素标准品价格仍非常昂贵，这也极大的限制了藻毒素相关研究的发展。
[0003]我国富营养化城市湖泊众多，尤其夏秋季蓝藻水华现象频繁发生，藻毒素含量较大，这也为藻毒素提取制备提供了天然的物质基础。然而令人遗憾的是目前有关城市湖泊藻毒素污染并未得到重视，每逢蓝藻发生，通常打捞到岸边或用化学试剂杀灭，这不仅严重污染了土壤和水质，也造成藻毒素资源的浪费。当前传统的藻毒素提取方法通常为从制备的藻粉中提取。然而藻粉制备一为将打捞上来的蓝藻在岸边曝晒阴干，然后将其收集粉碎，这种方法在阴干过程中使得大量的藻细胞死亡腐败，极大的危害了岸边附近的土壤，而且其腐败散发的挥发性气体也污染了周围的空气，且不利于藻毒素的提取和纯化。二为实验室用冷冻干燥设备进行藻粉制备，虽然这种方法较好的控制了藻粉制备污染问题，但其制备量有限，且提取成本较高，不适合大量藻毒素提取。此外，目前藻毒素提取多针对MC-LR类型，MC-RR类型较少，这也是为何市场上MC-RR类型藻毒素价格更高的原因之一。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种从水体中提取蓝藻毒素的方法，特别是从城市蓝藻水华水体中提取主要蓝藻毒素类型LR和RR的方法。
[0005]本发明所提供的从水体中提取蓝藻毒素的方法，具体可包括如下步骤:
[0006](I)取待提取水体，向其中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的终体积含量为40%，使冰醋酸的终体积含量为3-5%，300赫兹连续超声15-20min ；
[0007](2)将步骤(1)超声处理后的水样调节pH为3，用0.45 4 111滤膜(如6?/(:玻璃纤维滤膜)过滤，滤液于6500g离心5-10min (如5min或IOmin),取上清；
[0008](3)将步骤(2)所得上清过固相萃取柱(SPE柱)，使蓝藻毒素富集到柱子上，用体积含量为40%的甲醇水溶液淋洗，再用体积含量为95%的甲醇水溶液洗脱，得到含有蓝藻毒素的洗脱液；
[0009](4)从步骤(3)的洗脱液中获得蓝藻毒素。
[0010]在上述方法中，若要步骤(4)中获得的蓝藻毒素最大产量RR型蓝藻毒素(MC-RR)，则所述方法的步骤(I)为:向待提取水体中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的终体积含量为40%，使冰醋酸的终体积含量为3%，300赫兹连续超声15min ;若要步骤(4)中获得最大产量LR蓝藻毒素，则所述方法的步骤(I)为:向待提取水体中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的终体积含量为40%，使冰醋酸的终体积含量为5%，300赫兹连续超声20min。
[0011]在上述方法的步骤(I)中，在所述向待提取水体中加入甲醇和冰醋酸之前，还可包括如下步骤:将所述待提取水体过100目网筛(去除水体中的大部分悬浮物)，将过筛后水样用500g离心去沉淀(去除较小颗粒悬浮物)。
[0012]在上述方法的步骤(3)中，所述固相萃取柱可为C18固相萃取柱。在发明中，所述C18固相萃取柱具体为Cleanert C18-SPE层析柱(天津博纳艾杰尔科技有限公司产品)。
[0013]步骤(3)中，在将步骤(2)所得上清过固相萃取柱之前，需先用I倍柱体积的甲醇和2倍柱体积的水(Mill1-Q水)先后冲洗所述固相萃取柱，使之活化。将步骤(2)所得上清过所述固相萃取柱时的流速可为5-10ml.mirT1 (如5ml.mirT1)。
[0014]在上述方法的步骤(4)中，所述从步骤(3)的洗脱液中获得蓝藻毒素的方法具体可包括如下(a)和(b)的步骤:
[0015](a)将所述洗脱液浓缩，得到蓝藻毒素的浓缩液，溶剂为甲醇；
[0016](b)用高效液相色谱仪串联质谱仪对步骤(a)所得浓缩液进行鉴定与分离，从所述浓缩液中分别得到所述RR型蓝藻毒素和所述LR型蓝藻毒素。
[0017]在上述方法中，进行所述步骤(b)时，采用的高效液相色谱条件具体如下:色谱柱为C18色谱柱，具体如Welch Ultimate XB-C18色谱柱(4.6mmX 150mm,粒径5 μ m);流动相为如下流动相A和流动相B，采用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱；流动相A:甲醇；流动相B:体积百分含量为0.1%的甲酸水溶液；所述梯度洗脱为:0?3min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比从30:70线性变化到75:25 ；4?8min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为75:25 ；9?12min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比从75:25线性变化到30:70 ;采用的质谱条件如下:正离子电离方式；喷雾电压(IS)为5kV ;离子化温度(TEM)为500°C;源内气体I (GS1，N2)压力为55kPa，源内气体2 (GS2，N2)压力为55kPa ;扫描方式为选择离子模式，选择质荷比为519.8或995.6 (MC-RR的质荷比为519.8，MC-LR的质荷比为995.6);碰撞气压力为Medium级;碰撞电压为35V或50V (MC-LR碰撞电压50V，MC-RR碰撞电压35V)。
[0018]在以上所述的高效液相色谱条件中，流速可为0.8ml/min，上样体积可为5_10 μ L(如5 μ L)，柱温可为30。。。
[0019]在上述方法中，所述高效液相色谱仪为Ultimate3000型高效液相色谱仪(Dionex, USA);所述质谱仪为3200Q TRAP型串联质谱仪(Aglient，USA)。
[0020]在上述方法中，所述步骤(b)具体为:采用以上所述的色谱条件和质谱条件对所述浓缩液进行鉴定与分离，收集与RR型蓝藻毒素标准品保留时间(5.14min)—致的洗脱峰，从而实现从所述浓缩液中分离得到所述RR型蓝藻毒素(如将洗脱峰液体减压蒸干获得RR型蓝藻毒素干粉);收集与LR型蓝藻毒素标准品保留时间(5.76min)—致的洗脱峰，从而实现从所述浓缩液中分离得到所述LR型蓝藻毒素(如将洗脱峰液体减压蒸干获得LR型蓝藻毒素干粉)。
[0021 ] 所述RR型藻毒素标准品和所述LR型蓝藻毒素标准品均购于sigma公司。
[0022]以上本发明所提供的从水体中提取蓝藻毒素的方法，适用于城市蓝藻水华水体中提取两种蓝藻毒素主要类型。
[0023]所述水体为蓝藻水华水体，如城市蓝藻水华水体。
[0024]本发明针对目前城市湖泊富营养化问题严重，蓝藻水华引起的蓝藻毒素污染问题严重且藻毒素资源未加利用这一情况，根据藻毒素不同类型，建立从城市富营养化蓝藻水华水体中提取蓝藻毒素方法。该方法采用固相萃取技术，连续富集、纯化、提取城市蓝藻水华水体中的蓝藻毒素两种蓝藻毒素主要异构体MC-LR和MC-RR，具有所得产品纯度高，易于操作，成本低廉等特点。并采用液质联用新方法进行蓝藻毒素提取与分离，其具有快速，精确定性等优点，且此方法能够极大的克服目前常用ELISA酶联反应不能有效区分藻毒素类型和高效液相色谱无法鉴别出现的假阳性峰，且无法准确定量的不足，是目前最新鉴定与分离的检测技术。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为本发明快速提取城市蓝藻水华水体中蓝藻毒素主要类型MC-RR和MC-LR的流程图。
[0026]图2为蓝藻毒素标准品的标准曲线和液质图谱。其中，A为RR型蓝藻毒素标准品的标准曲线方程为LR型蓝藻毒素标准品的标准曲线方程。C为RR型蓝藻毒素标准品的液质图谱；D为LR型蓝藻毒素标准品的液质图谱。
[0027]图3为提取的蓝藻毒素的液质图谱。其中，A为提取的RR型蓝藻毒素(MC-RR)液质图谱；B为提取的LR型蓝藻毒素(MC-LR)液质图谱。
【具体实施方式】
[0028]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0029]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030]下述实施例均按照如下方法从水样中提取蓝藻毒素:
[0031]Cleanert C18-SPE层析柱:天津博纳艾杰尔科技有限公司。
[0032]GF/C玻璃纤维滤膜:北京京腾盛景科技有限公司。
[0033]高效液相色谱仪:Ultimate3000型高效液相色谱仪(Dionex, USA)。
[0034]质谱仪:3200QTRAP 型串联质谱仪(Aglient, USA)。
[0035]RR型蓝藻毒素标准品和LR型蓝藻毒素标准品:sigma公司。
[0036]实施例1、城市蓝藻水华水体蓝藻毒素的提取条件优化
[0037]本实施例中的水样为取自某公园的蓝藻水华水体。
[0038]一、蓝藻毒素粗提取中提取溶剂优化实验
[0039]1、实验方法
[0040]按照如下方法进行水体蓝藻毒素的提取，期间对“蓝藻毒素粗提取”步骤中的提取溶剂进行优化。具体如下:[0041](I)去除杂质处理:水样首先经100目网筛去除里面的大部分悬浮物，然后经500g离心，去除较小颗粒悬浮物，定容到1L，得到过滤水样。
[0042](2)蓝藻毒素的粗提取:向过滤水样中加入甲醇和冰醋酸，设置不同甲醇和冰醋酸混合提取溶剂组，使之提取溶剂终体积分数为(如表I所示):10%?70%甲醇+3%冰醋酸、10%?70%甲醇+5%冰醋酸、10%?70%甲醇+7%冰醋酸(每一实验组均设置两个平行)。将各平行的混合溶液分别于4°C 300赫兹条件下连续超声5min提取蓝藻毒素，超声处理后的水样PH调为7，用GF/C玻璃纤维滤膜(0.45 μ m)过滤，将滤液于6500g离心5分钟，以除去溶液中破碎的蓝藻细胞碎片；
[0043](3)用I倍柱体积的甲醇和2倍柱体积的Mill1-Q水先后冲洗Cleanert C18-SPE层析柱，使之活化；将步骤(2)所得上清过Cleanert C18-SPE层析柱,流速为5ml.mirT1,进行固相萃取(使蓝藻毒素富集到柱子上)；用IOml体积含量为40%的甲醇水溶液淋洗；用20ml体积含量为95%的甲醇水溶液洗脱，得到含有蓝藻毒素的洗脱液；
[0044](4)蓝藻毒素的浓缩与保存:将含有蓝藻毒素的洗脱液进行减压蒸干后用甲醇溶液定容到1ml，得到蓝藻毒素浓缩液，放置_20°C冰箱内。
[0045](5) RR/LR型蓝藻毒素的分离及定性定量分析:利用高效液相色谱仪串联质谱仪对蓝藻毒素浓缩液中的RR/LR型蓝藻毒素的进行分离，同时对其含量进行测定。其中，高效液相色谱仪为Ultimate3000型高效液相色谱仪(Dionex, USA)，质谱仪为3200Q TRAP型串联质谱仪(Aglient, USA)。
[0046]A.色谱条件和质谱条件
[0047]色谱条件:色谱柱为Welch Ultimate XB-C18 色谱柱(4.6_X 150mm,粒径 5 μ m);流动相为如下流动相A和流动相B，采用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱；流动相A:甲醇；流动相B:体积百分含量为0.1%的甲酸水溶液；所述梯度洗脱为:0?3min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比从30:70线性变化到75:25 ；4?8min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为75:25 ;9?12min,所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比从75:25线性变化到30:70 ;柱温30°C，流速0.8ml/min,进样体积5 μ L。
[0048]质谱条件:正离子电离方式；喷雾电压(IS)为5kV ;离子化温度(TEM)为500°C;源内气体I (GS1，N2)压力为55kPa，源内气体2 (GS2，N2)压力为55kPa ;扫描方式为选择离子模式，选择质荷比为519.8或995.6 (MC-RR的质荷比为519.8，MC-LR的质荷比为995.6)；碰撞气压力为Medium级；碰撞电压为35V或50V (提取MC-LR时碰撞电压50V，提取MC-RR时碰撞电压35V)。
[0049]B.待测样品中蓝藻毒素含量的定量分析
[0050]在对步骤(4)中得到的蓝藻毒素浓缩液，以及不同浓度的RR型蓝藻毒素标准品(或LR型蓝藻毒素标准品)(溶剂为甲醇)进行以上液质联用检测过程中，质谱仪分析软件根据检测结果自动提取待测样品(蓝藻毒素浓缩液)中与RR型蓝藻毒素标准品(或LR型蓝藻毒素标准品)保留时间一致的物质的面积计数(Area counts)，一方面以RR型蓝藻毒素标准品(或LR型蓝藻毒素标准品)溶液的浓度(ng/mL)为横坐标，以RR型蓝藻毒素标准品(或LR型蓝藻毒素标准品)溶液的面积计数(Area counts)为纵坐标，制作标准曲线，得到RR型蓝藻毒素标准品(或LR型蓝藻毒素标准品)的标准曲线方程；另一方面将待测样品(蓝藻毒素浓缩液)的面积计数(Area counts)自动代入RR型蓝藻毒素标准品(或LR型蓝藻毒素标准品)的标准曲线方程计算出待测样品(蓝藻毒素浓缩液)中的RR型蓝藻毒素(或LR型
蓝藻毒素)的含量。
[0051](6)蓝藻毒素精提取物质保存:分别收集与RR型蓝藻毒素标准品保留时间(5.14min) 一致的洗脱峰和与LR型蓝藻毒素标准品保留时间(5.76min) 一致的洗脱峰，减压蒸干后，放置在_80°C冰箱中保存。从而成功从蓝藻毒素浓缩液中同时分离得到RR型蓝藻毒素(MC-RR)和LR型蓝藻毒素(MC-LR)。
[0052]2、实验结果 [0053]根据以上步骤I (5)的检测，分别得到待测样品(蓝藻毒素浓缩液)中RR型蓝藻毒素(MC-RR)和LR型蓝藻毒素(MC-LR)的含量。具体结果如表1所示。
[0054]表1蓝藻毒素粗提取中不同用量的甲醇和冰醋酸处理提取效果比较
[0055]
【权利要求】
1.一种从水体中提取蓝藻毒素的方法，包括如下步骤: (1)取待提取水体，向其中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的终体积含量为40%，使冰醋酸的终体积含量为3-5%，300赫兹连续超声15-20min ； (2)将步骤(1)超声处理后的水样调节pH为3，用0.45 μ m滤膜过滤，滤液于6500g离心5-10min,取上清； (3)将步骤(2)所得上清过固相萃取柱，用体积含量为40%的甲醇水溶液淋洗，再用体积含量为95%的甲醇水溶液洗脱，得到含有蓝藻毒素的洗脱液； (4)从步骤(3)的洗脱液中获得蓝藻毒素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:在上述方法中，步骤(1)为如下(I)或(II): (I)向待提取水体中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的终体积含量为40%，使冰醋酸的终体积含量为3%，300赫兹连续超声15min ； (II)向待提取水体中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的终体积含量为40%，使冰醋酸的终体积含量为5%，300赫 兹连续超声20min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤(1)中，在所述向待提取水体中加入甲醇和冰醋酸之前，还包括如下步骤:将所述待提取水体过100目网筛，将过筛后水样用500g离心去沉淀。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:步骤(3)中，所述固相萃取柱为C18固相萃取柱。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述C18固相萃取柱为CleanertC18-SPE层析柱。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:在步骤(4)中，所述从步骤(3)的洗脱液中获得蓝藻毒素的方法包括如下(a)和(b)的步骤: Ca)将所述洗脱液浓缩，得到蓝藻毒素的浓缩液，所述浓缩液中的溶剂为甲醇； (b )用高效液相色谱仪串联质谱仪对步骤(a)所得浓缩液进行鉴定与分离，从所述浓缩液中分别得到所述RR型蓝藻毒素和所述LR型蓝藻毒素。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:进行所述步骤(b)时，采用的高效液相色谱条件如下:色谱柱为C18色谱柱；流动相为如下流动相A和流动相B，采用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱；流动相A:甲醇；流动相B:体积百分含量为0.1%的甲酸水溶液；所述梯度洗脱为:0~3min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比从30:70线性变化到75:25 ；4~8min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为75:25 ；9~12min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比从75:25线性变化到30:70 ； 进行所述步骤(b)时，采用的质谱条件如下:正离子电离方式；喷雾电压为5kV ;离子化温度为500°C;源内气体I为N2、压力为55kPa ;源内气体2为N2、压力为55kPa ;扫描方式为选择离子模式，选择质荷比为519.8或995.6 ;碰撞气压力为Medium级；碰撞电压为35V或50V。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述高效液相色谱条件中，流速为0.8ml/min,上样体积为5-10 μ L,柱温为30°C。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于:所述步骤(b)为:采用权利要求7或8中所述的色谱条件和质谱条件对所述浓缩液进行检测，收集保留时间为5.14min的洗脱峰，从而实现从所述浓缩液中分离得到所述RR型蓝藻毒素；收集保留时间为5.76min的洗脱峰，从而实现从所述浓缩液中分离得到所述LR型蓝藻毒素。
10.根据权利 要求1-9中任一所述的方法，其特征在于:所述待提取水体为蓝藻水华水体。
【文档编号】G01N30/06GK103543219SQ201310424925
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】曲疆奇, 张清靖, 辛知明, 朱华 申请人:北京市水产科学研究所