中蜂囊状幼虫病毒抗体的elisa检测方法
【专利摘要】一种中蜂囊状幼虫病毒抗体的ELISA检测方法，用碳酸盐缓冲液作为包被液将纯化的中蜂囊状幼虫病毒抗原稀释至工作浓度，加入酶标板的酶标孔内，温育，密封培养过夜；弃掉上层液体，洗涤；向酶标孔内加入封闭液，密封温育或密封培养过夜，洗涤；将待检卵黄抗体进行倍比稀释，弃掉上层液体，洗涤；加入标记的兔抗鸡IgG进行反应；弃掉上层液体，洗涤；加入底物显色液，加入终止液，终止反应；用酶标仪在490nm～599nm下测定OD值，确定抗体效价。该检测方法具有使用简便、敏感性高、检测成本低、生物安全度高的特点，可以评价制备的中蜂囊状幼虫病毒抗体的效价，确保临床上用量的准确性，达到预期治疗效果，避免药物浪费或用量不足。
【专利说明】中蜂囊状幼虫病毒抗体的ELISA检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种中蜂囊状幼虫病毒抗体的ELISA检测方法。
【背景技术】
[0002]中华蜜蜂，又称中华蜂、中蜂、土蜂，其抗寒抗敌害能力强，在寒冷的冬季也可以给植物授粉，因此，中蜂对保持我国植物生态系统特别是冬季开花的植物具有不可替代的作用，研究表明，如果中蜂灭绝，我国有30%的植物将要随之灭绝。
[0003]目前，为了加强中蜂产业的发展，在全国建立了中蜂保护区。然而，中蜂囊状幼虫病具有蔓延快的特点，一旦中蜂囊状幼虫病发生，就会迅速蔓延，给中蜂种群造成了毁灭性的打击，使中蜂损失严重。
[0004]CN102504023A公开了一种卵黄抗体的制备方法,该卵黄抗体能用于制备防治中蜂囊状幼虫病的药物，但对抗中蜂囊状幼虫病病毒抗体的效价评估，还没有相应的检测方法，抗中蜂囊状幼虫病病毒抗体的效价评估不准确，导致卵黄抗体使用过量而浪费或卵黄抗体用量不足致使治疗效果不能达到预期，直接制约了中蜂囊状幼虫病病毒抗体(卵黄抗体)的应用和研究。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种中蜂囊状幼虫病毒抗体的ELISA检测方法，可评价制备的中蜂囊状幼虫病毒抗体的效价，以确定给药量，达到预期治疗效果，避免药物浪费。
[0006]本发明的技术解决方案是:
一种中蜂囊状幼虫病毒抗体的ELISA检测方法，其具体步骤如下:
1.1、用碳酸盐缓冲液作为包被液将纯化的中蜂囊状幼虫病毒抗原稀释至工作浓度，加入酶标板的酶标孔内，酶标孔每孔加入量为50μl~100μl，抗原含量为55ng/孔~65ng/孔，温育，密封培养过夜，上层为液体，包被抗原吸附在酶标板上；
1.2.弃掉上层液体，用PBST缓冲液洗涤包被抗原，重复洗涤3次~5次，吸干水分；
1.3、向酶标孔内加入封闭液,每孔加入量为50μl~100μl,密封温育或密封培养过夜，用PBST缓冲液洗涤包被抗原，重复洗涤3次~5次，吸干水分；
1.4、将待检卵黄抗体按2的倍数进行倍比稀释，并依次加入酶标孔，同时设阴性对照卵黄抗体、阳性对照卵黄抗体，每孔加入量为50μl~100μl，在36.5°C~37.5°C下反应2h~3h，上层为液体，包被抗原与抗体复合物吸附在酶标板上；
1.5、弃掉步骤1.4的上层液体，用PBST缓冲液洗涤被抗原与抗体复合物，重复洗涤3次~5次，吸干水分；
1.6、向酶标孔内加入稀释的辣根过氧化酶标记的兔抗鸡1gG，每孔加入量为50μl，在36.5°C~37.5°C下反应1h~1.5h后；弃掉上层液体，用PBST缓冲液进行洗涤，重复洗涤3次~5次，吸干水分；1.7、向酶标孔内加入底物显色液，每孔加入量为50μ?~?οομ?，在室温下避光显色IOmin~15min,加入终止液,每孔加入量为5μ?~ΙΟμ?,终止反应；
1.8、用酶标仪在490nm~599nm下测定OD值，OD值≤1.7854为阳性，OD值< 1.7854为阴性，步骤1.4中倍比稀释测定OD值是阳性的最大稀释倍数为抗体效价。
[0007]本发明的有益效果:
该检测方法具有使用简便，敏感性高，检测成本低，生物安全度高等特点，可以评价制备的中蜂囊状幼虫病毒抗体的效价，确保临床上用量的准确性，达到预期治疗效果，避免药物浪费或用量不足。
【具体实施方式】
[0008]实施例1
1.1、配制包被液(碳酸盐缓冲液):碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g,加蒸馏水稀释定容至 1000 mL，调 PH 至 9.6 ;
用包被液将纯化的中蜂囊状幼虫病毒抗原稀释至工作浓度，加入酶标板的酶标孔内，酶标孔每孔加入量为50μ?,抗原含量为55ng/孔,在37°C下温育Ih后,在4°C下密封培养过夜，上层为液体，包被抗原吸附在酶标板上；
1.2.配制PBST缓冲液:氯化钠8g，氯化钠:0.2g,磷酸二氢钾0.2g,磷酸氢二钠(12个结晶水)2.9g，Tween-20 0.5 mL,加蒸馏水稀释定容至1000 mL,调PH至7.4 ;
弃掉上层液体，用PBST缓冲液洗涤包被抗原，重复洗涤3次，吸干水分；
1.3、配制封闭液:5克脂奶粉用PBST溶解，定溶至100ml;
向酶标孔内加入封闭液，每孔加入量为50μ?，在37°C下密封温育lh，用PBST缓冲液洗涤包被抗原，重复洗涤3次，吸干水分；
1.4、将待检卵黄抗体按2的倍数进行倍比稀释，并依次加入酶标孔，同时设阴性对照卵黄抗体、阳性对照卵黄抗体，每孔加入量为50μ?，在36.5°C下反应3h，上层为液体，包被抗原与抗体复合物吸附在酶标板上；
1.5、弃掉步骤1.4的上层液体，用PBST缓冲液洗涤被抗原与抗体复合物，重复洗涤3次，吸干水分；
1.6、向酶标孔内加入稀释的辣根过氧化酶标记的兔抗鸡IgG，每孔加入量为50μ?，在
36.5°C下反应1.5h后；弃掉上层液体，用PBST缓冲液进行洗涤，重复洗涤3次，吸干水分；1.7、配制底物显色液-M.lmol/L柠檬酸2.43mL, 0.2mol/L磷酸氢二钠2.57mL,邻苯二胺(OPD) 4mg,蒸懼水5mL, 30%过氧化氢IyL;
配制终止液(2mol/L硫酸):98%浓硫酸22.2 mL，缓慢加入蒸馏水177.8 mL ；
向酶标孔内加入底物显色液，每孔加入量为50μ?，在室温下避光显色lOmin，加入终止液，每孔加入量为5μ?,终止反应；
1.8、用酶标仪在490nm~599nm下测定OD值，OD值≤1.7854为阳性，OD值< 1.7854为阴性，测定OD值是阳性的步骤1.4中倍比稀释最大稀释倍数为抗体效价。
[0009]实施例2
配制包被液、PBST缓冲液、封闭液、底物显色液、终止液的方法及用量同实施例1 ;
1.1、用碳酸盐缓冲液作为包被液将纯化的中蜂囊状幼虫病毒抗原稀释至工作浓度，加入酶标板的酶标孔内，酶标孔每孔加入量为１００μｌ，抗原含量为65ng/孔，在37°C下温育Ih后,在4°C下密封培养过夜,上层为液体,包被抗原吸附在酶标板上；
1.2.弃掉上层液体，用PBST缓冲液洗涤包被抗原，重复洗涤5次，吸干水分；
1.3、向酶标孔内加入封闭液，每孔加入量为１００μｌ，在4°C下密封培养过夜，用PBST缓冲液洗涤包被抗原，重复洗涤5次，吸干水分；
1.4、将待检卵黄抗体按2的倍数进行倍比稀释，并依次加入酶标孔，同时设阴性对照卵黄抗体、阳性对照卵黄抗体，每孔加入量为１００μｌ，在37.5°C下反应2h，上层为液体，包被抗原与抗体复合物吸附在酶标板上；
1.5、弃掉步骤1.4的上层液体，用PBST缓冲液洗涤被抗原与抗体复合物，重复洗涤5次，吸干水分；
1.6、向酶标孔内加入稀释的辣根过氧化酶标记的兔抗鸡IgG，每孔加入量为50μ?，在
37.5°C下反应Ih后；弃掉上层液体，用PBST缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，吸干水分；
1.7、向酶标孔内加入底物显色液，每孔加入量为１００μｌ，在室温下避光显色15min，加入终止液，每孔加入量为１０μｌ,终止反应；
1.8、用酶标仪在490nm~599nm下测定OD值，OD值≥1.7854为阳性，OD值< 1.7854为阴性，测定OD值是阳性的步骤1.4中倍比稀释最大稀释倍数为抗体效价。
[0010]实施例3
配制包被液、PBST缓冲液、封闭液、底物显色液、终止液的方法及用量同实施例1 ;
1.1、用碳酸盐缓冲液作为包被液将纯化的中蜂囊状幼虫病毒抗原稀释至工作浓度，加入酶标板的酶标孔内，酶标孔每孔加入量为80μ?，抗原含量为60ng/孔，在37°C下温育Ih后,在4°C下密封培养过夜,上层为液体,包被抗原吸附在酶标板上；
1.2.弃掉上层液体，用PBST缓冲液洗涤包被抗原，重复洗涤4次，吸干水分；
1.3、向酶标孔内加入封闭液，每孔加入量为80μｌ，在4°C下密封培养过夜，用PBST缓冲液洗涤包被抗原，重复洗涤4次，吸干水分；
1.4、将待检卵黄抗体按2的倍数进行倍比稀释，并依次加入酶标孔，同时设阴性对照卵黄抗体、阳性对照卵黄抗体，每孔加入量为80μ?，在37°C下反应2.5h，上层为液体，包被抗原与抗体复合物吸附在酶标板上；
1.5、弃掉步骤1.4的上层液体，用PBST缓冲液洗涤被抗原与抗体复合物，重复洗涤4次，吸干水分；
1.6、向酶标孔内加入稀释的辣根过氧化酶标记的兔抗鸡IgG，每孔加入量为50μ?，在37°C下反应Ih后；弃掉上层液体，用PBST缓冲液进行洗涤，重复洗涤4次，吸干水分；
1.7、向酶标孔内加入底物显色液，每孔加入量为80μｌ，在室温下避光显色12min，加入终止液，每孔加入量为58μｌ,终止反应；
1.8、用酶标仪在490nm~599nm下测定OD值，OD值≥1.7854为阳性，OD值< 1.7854为阴性，测定OD值是阳性的步骤1.4中倍比稀释最大稀释倍数为抗体效价。
[0011]一、敏感性试验
将中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)标准阳性卵黄抗体做1:100~1:12800倍比稀释，其余条件按最佳反应条件进行试验。结果当抗原按最佳包被浓度和条件进行包被时，将CSBV阳性卵黄抗体分别做1:100~1:1280倍比稀释，其余条件按最适反应条件进行间接ELISA。结果显示，当1:6400稀释后仍可检测为阳性，而1:12800稀释的阳性卵黄抗体检测结果低于
1.7854。
[0012]二、中蜂囊状幼虫病毒的ELISA检测方法实际应用
制备卵黄抗体时，分别在首次免疫后28天、35天和其他免疫前7天按10%比例随机选取鸡蛋，对每批鸡蛋进行效价测定，当有效抗体效价在28以上后，收集所有鸡蛋用水合法提取卵黄抗体IgY，并对提取的卵黄抗体IgY抗体按照实施例3进行最终效价测定,根据测定的效价给出临床上使用量。
[0013]三、间接ELISA阴性和阳性临界值的确定
按上述建立的间接ELISA方法，对实验室保存的20份卵黄抗体进行检测，每份样品重
复2孔，结果取其平均值，如表1所示，计算样本OD值的平均值(i )和标准方差(OD)，
根据统计学的原则，阴阳性临界值=平均数+3X标准方差，可以在99.9%的水平上判定为阳性。结果实验临界值为1.7854，即待测样品的OD值大于或者等于1.7854时为阳性，小于1.7854则为阴性。
[0014]表1.20份卵黄抗体OD值检测结果
【权利要求】
1.一种中蜂囊状幼虫病毒抗体的ELISA检测方法，其特征是: 具体步骤如下: 1.1、用碳酸盐缓冲液作为包被液将纯化的中蜂囊状幼虫病毒抗原稀释至工作浓度，加入酶标板的酶标孔内，酶标孔每孔加入量为50μl~100μl，抗原含量为55ng/孔~65ng/孔，温育，密封培养过夜，上层为液体，包被抗原吸附在酶标板上； 1.2、弃掉上层液体，用PBST缓冲液洗涤包被抗原，重复洗涤3次~5次，吸干水分； 1.3、向酶标孔内加入封闭液,每孔加入量为5θμl~100μl,密封温育或密封培养过夜，用PBST缓冲液洗涤包被抗原，重复洗涤3次~5次，吸干水分； 1.4、将待检卵黄抗体按2的倍数进行倍比稀释，并依次加入酶标孔，同时设阴性对照卵黄抗体、阳性对照卵黄抗体，每孔加入量为50μ?~ΙΟΟμ?，在36.5°C~37.5°C下反应2h~3h，上层为液体，包被抗原与抗体复合物吸附在酶标板上； 1.5、弃掉步骤1.4的上层液体，用PBST缓冲液洗涤被抗原与抗体复合物，重复洗涤3次~5次，吸干水分； 1.6、向酶标孔内加入稀释的辣根过氧化酶标记的兔抗鸡IgG，每孔加入量为50μ?，在36.5°C~37.5°C下反应Ih~1.5h后；弃掉上层液体，用PBST缓冲液进行洗涤，重复洗涤3次~5次，吸干水分； 1.7、向酶标孔内加入底物显色液，每孔加入量为50μl~100μl，在室温下避光显色1Omin~15min,加入终止液,每孔加入量为5μl~10μl,终止反应； 1.8、用酶标仪在490nm~599nm下测定OD值，OD值≥1.7854为阳性，OD值< 1.7854为阴性，测定OD值是阳性的步骤1.4中倍比稀释最大稀释倍数为抗体效价。
【文档编号】G01N33/569GK103760344SQ201310457342
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】马鸣潇, 张大利, 韩喜斌, 袁小波, 樊琼, 郑洪玲, 郑林, 李慧 申请人:辽宁医学院