一种可用于全血检测的快捷去除红细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及医药卫生领域，提供了一种简单且快速的有效分离血红细胞的方法。该方法结合免疫凝集与磁性分离技术，通过羊抗人血红细胞抗体与血红细胞形成抗原-抗体复合物，再与包被有鼠抗羊Fc端的单克隆抗体的磁性微球发生免疫吸附从而产生更为强烈的凝集反应，进而磁性分离达到去除红细胞的目的。该发明通过简单快速的方法去除样本中的红细胞，可应用于全自动和半自动化学发光仪，以便于实现普通试剂盒的全血检测。
【专利说明】-种可用于全血检测的快捷去除红细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药卫生领域，提供了一种简单且快速有效分离血红细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 目前临床上血清分离的方法为采血后，采血管静置30分钟,通过离心将红细胞、 白细胞、血小板与血清分开。由于离心过程中产生一定的离心力，这种离心力会导致血红细 胞堆积从而导致细胞的破裂造成溶血。离心是一个复杂的过程，尤其是在样本量大的时候， 即使是熟练的操作人员很难保证操作每份样本的均一性。相关文献报道，由离心分离操作 不当导致的溶血，占溶血现象的41. 2%。
[0003] 红细胞会干扰常规试剂盒中免疫磁珠捕获抗原的性能，这也是诸多常规的化学发 光试剂无法检测全血样本的原因，此外红细胞的破裂会造成大量的血红蛋白、高浓度离子 或酶释放，会引起测量误差，从而极大降低了标本检测的准确性。在检测过程中，溶血现象 会增加假性的比例。
[0004] 此外，常规的血红细胞分离手段耗时较长，且操作复杂，一旦样本量增大将会带来 极大的人工成本。此外，某些项目的分子标志物半衰期非常短，仅为十几分钟，此时快速的 检测，可以更准确、真实的反应待测分子的含量；在心肌梗塞患者中，更会体现精短的测量 时间带来的优势，有利于为患者争取宝贵的时间以便在第一时间内进行治疗。
[0005] 例如在PCT的检测过程中发现它在细菌感染时升高，并且其升高程度与感染 严重程度、病情预后密切相关。近年来随着研究的深入，发现在细菌感染初期，已经有 PCT低水平的升高，文献报道，健康人体内PCT的含量不超过0.05ng/ml ;PCT含量介于 0. 05-0. 25ng/ml之间时预示着有轻微感染不推荐使用抗生素治疗，需做进一步观察；当 PCT含量大于0. 25ng/ml且小于0. 5ng/ml时有局部感染，推荐使用抗生素。常规检测全血 样本虽然在强阳性样本存在的情况下有不错的相关性，但是斜率远小于1，表明了其准确度 不够，在0.05ng/ml以下的浓度时会产生很大程度上的假阳性。因此对医生的判断造成了 干扰。该发明的全血处理试剂盒处理后检测全血样本中PCT含量的相关性和斜率均要优于 常规测试，这一现象尤其在< 0. 5ng/ml的低值处尤为明显，这给医生对病人提供治疗方案 起到了积极作用。本发明提供的这种利用免疫反应及磁性分离快速去除红细胞的方法，操 作简单，可大幅缩短红细胞去除的时间，并大大减少了溶血现象的发生，且可应用于全自动 和半自动化学发光仪，配合相应的体外诊断试剂盒进行全血样本的检测。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为克服现有技术的上述不足，提供了一种利用免疫反应及磁性分 离快速去除红细胞的方法。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种样本处理试剂盒，可以解决传统的化学发光试剂无 法实现全血检测的问题。
[0008] 为解决上述问题，本发明采用以下技术方案予以实现：
[0009] -种利用免疫反应及磁性分离快速去除红细胞的方法。其通过羊抗人血红细胞抗 体与血红细胞发生抗原抗体反应形成红细胞-羊抗人血红细胞抗体复合体产生凝集，这种 复合体被包被有鼠抗羊Fc端的单克隆抗体的磁性微球捕获，进而通过磁性分离达到去除 红细胞的目的。该发明可应用于全自动和半自动化学发光仪，以便于实现化学发光法体外 诊断试剂盒检测全血样本。
[0010] 所述的羊抗人血红细胞的抗体为可特异性识别血红细胞的单抗。
[0011] 所述的鼠抗羊Fc端的单克隆抗体为可特异性识别羊多抗的Fc端的鼠单克隆抗 体。
[0012] 所述用于包被鼠抗羊Fc端的单克隆抗体的磁性微球，是指粒径在0. 2-50 μ m之 间，表面修饰羧基、氨基、氯甲基等化学功能基团的聚苯乙烯或者二氧化硅超顺磁性微粒。
[0013] 一种全血处理试剂盒，包括A液：含羊抗人血红细胞抗体的缓冲液；B液：共价偶 联了鼠抗羊Fc端的单克隆抗体的磁性微球悬浮液。
[0014] 所述的A液中储存抗体缓冲液的组分为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲 液等pH在5-9之间的缓冲液，其中氯化钠的含量在lmM-300mM之间，防腐剂为P300、NaN 3、 硫柳萊中的一种或者几种，保护蛋白为BSA、0VA、酿蛋白中的一种或者几种。
[0015] 所述的B液中储存磁珠的缓冲液组分为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲 液等pH在5-9之间的缓冲液，其中氯化钠的含量在lmM-300mM之间，防腐剂为P300、NaN3、 硫柳萊中的一种或者几种，保护蛋白为BSA、0VA、酿蛋白中的一种或者几种。
[0016] 上述检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
[0017] 1)配制 20mM PBS缓冲液，其中含氯化钠 150mM，0. 1% 的P300,5mg/ml BSA，pH7. 4， 构成抗体的储存液。
[0018] 2)配制 50mM Tris 缓冲液，其中含氯化钠 150mM，0. 1 % 的 P300,5mg/ml BSA， pH7. 6,构成磁珠储存液。
[0019] 3)制备共价偶联了鼠抗羊Fc端的单克隆抗体的磁性微粒：用活化缓冲液活化纳 米粒表面化学基团，活化完成后使用偶联缓冲液清洗磁性微粒，加入相当于磁性微粒质量 的1/20的单克隆抗体，反应后使用封闭缓冲液封闭纳米粒上空余的活化基团，既得鼠抗羊 Fc磁性微粒。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为常规方法检测全血样本PCT含量
[0021] 图2为使用本发明方法检测全血样本PCT含量
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
[0023] 实施例
[0024] 1.实验目的：
[0025] 验证本发明所阐述的快捷去除红细胞的方法辅助化学发光体外诊断试剂盒检测 全血样本中的应用。
[0026] 2.实验器材和试剂：
[0027] 化学发光仪（深圳新产业maglumi)，恒温水浴锅（HH-60,常州国华电器有限公 司），微量移液器（Thermo公司），磁性分离架（天津倍思乐色谱技术开发中心）。PCT校 准品（Audit 公司），PBS-T 缓冲液（KH2P04 3. 35g/L，Na2HP04-12H20 17. 9g/L，KC1 0· 2g/L， NaC18. 77g/L，Tween-20 (λ 5g/L，ρΗ7· 2)，PCT 校准品稀释液为含 20%牛血清的 PBS-T 缓冲 液，PCT检测试剂盒（深圳新产业），全血处理试剂盒的制备同说明书中阐述的制备方法。
[0028] 3.实验步骤：
[0029] 3. 1收集50份已知PCT浓度的血液样本，其中含20份阳性血液标本和30份阴性 血液标本。
[0030] 3. 2. 1常规PCT试剂盒检测全血样本
[0031] 温和的颠倒样本使样本里面的全血混匀，取100微升样本，按照PCT检测试剂盒说 明书中的要求进行操作。
[0032] 3. 2. 2样本经过该发明的全血处理试剂盒处理后检测
[0033] 温和的颠倒样本使样本里面的全血混匀，取100微升样本，加入40微升A液，充分 混匀，37°C温育1分钟；加入10微升B液，充分混匀，37°C温育5分钟，进行磁性分离，将上 清吸出，按照PCT检测试剂盒说明书中的要求操作该上清。
【权利要求】
1. 一种有效分离血红细胞的方法，该方法可快速有效的去除血液样本中的红细胞，并 减少溶血现象的发生。
2. 根据权利要求1所述的分离血红细胞的方法，其特征在于涉及到免疫凝集、免疫吸 附及磁性分尚技术。
3. 根据权利要求2所述的免疫凝集，其特征在于羊抗人血红细胞抗体与红细胞发生抗 原抗体反应形成红细胞-羊抗人血红细胞抗体复合体，产生凝集。
4. 根据权利要求2所述的免疫吸附和磁性分离技术，其特征在于包被有鼠抗羊Fc端单 克隆抗体的磁性微球捕获免疫凝集之后的复合体，在外加磁场的作用下将复合体从血浆中 分离出来。
5. 根据权利要求4所述的磁性微球，其特征在于直径为0. 2-50 μ m，表面修饰羧基、氨 基、氯甲基等化学功能基团的聚苯乙烯或者二氧化硅超顺磁性微粒。
6. 根据权利要求1所述的快捷去除红细胞的方法，其特征在于可大幅缩短红细胞去除 时间，并可与全自动及半自动化学发光仪配合，实现普通试剂盒的全血检测。
【文档编号】G01N33/577GK104111333SQ201310571230
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】叶森 申请人:叶森