专利名称：一种在活细胞内精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法
技术领域：
本发明涉及一种评价抗朊病毒药物作用效果的方法，特别是在活细胞内利用FRAP 技术精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法。
背景技术：
朊病毒是一类能在动物和人中引起可传染性脑病(包括疯牛病、羊搔痒症、库鲁 病、克雅氏病等)的病原体，其高度传染性和致死性对整个社会造成了极大的危害。关于朊 病毒的分子致病机理和治疗药物筛选、开发的研究是国际上生物学、医学领域研究的前沿 和热点。全世界的研究者们正致力于寻求抗朊病毒药物筛选的细胞模型的研究，从而尽快 研发出预防和治疗朊病毒引发疾病的药物。目前基于酵母细胞的抗朊病毒药物筛选常用的 方法是利用颜色变化来评价药物的作用效果，或者进一步利用SDS-PAGE/Western Blot技 术在蛋白质水平通过检测朊病毒蛋白聚集体的状态变化来实现。通过颜色变化评价药物的 作用效果，大部分时候比较准确，但会出现假阳性和假阴性结果。SDS-PAGE/Western Blot 技术可以检测朊病毒蛋白聚集体的存在状态(聚集或可溶)但是检测过程繁琐费时，关键 是不能定量检测朊病毒蛋白聚集体大小的变化，而聚集体的大小的变化是抗朊病毒药物作 用效果的重要指标。
发明内容
为了解决上述问题，本发明采用荧光漂白恢复技术(Fluoresceneredistribution after photobleaching, FRAP)在活细胞内精确定量检测经药物作用后酵母朊蛋白聚集体 的大小，解决了利用颜色变化评价药物作用效果的不稳定和SDS-PAGE/Western Blot技术 不能精确定量朊蛋白聚集体大小的技术问题。本发明使用的菌种为野生型酿酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae)，来自于 美国标准菌种库(American Type Culture Collection, ATCC)，保藏编号为 208719。这种 野生型酿酒酵母细胞带有[PSI+]朊病毒，即Sup35p呈聚集状态，表现为较大的分子量，菌 落颜色表现为白色；经药物作用后，聚集的Sup35p解聚，不同的药物促进Sup35p聚集体 解聚的能力不同，从而表现出不同的分子量，菌落的颜色也随着聚集体的变化而变化—— Sup35p聚集体越小菌落颜色越深，即随着Sup35p聚集体从大到小，菌落依次表现为白色， 粉色，红色。彻底治愈的细胞内Sup35p完全解聚呈单体，表现为恒定的较小的分子量(约 为74kDa)，菌落颜色表现为红色，称为[psi_]细胞。本发明的技术方案是将荧光标签GFP (绿色荧光蛋白)插入SUP35的N和M结构域 中间，而不影响朊病毒的聚集及传播，在共聚焦荧光显微镜下可以观察活细胞朊病毒蛋白 发出荧光。共聚焦激光扫描荧光显微镜FRAP技术是借助高强度脉冲式激光照射带荧光细 胞某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，通过低强度激光扫描，可以探测到该区域 周围的非淬灭荧光分子向被照射区域扩散的速率，荧光分子扩散的速率与该分子的大小，荧光分子的分子量越大，扩散速率越慢；荧光分子的分子量越小则扩散速率越快。通过比较 不同细胞光漂白区域荧光强度恢复快慢，可以定量的比较荧光蛋白质分子的大小。朊病毒 蛋白Sup35p聚集时，分子量大，荧光漂白后的恢复速率相对较慢，而朊病毒蛋白Sup35p被 药物治愈后变成可溶状态，分子量变小，荧光漂白后的恢复速率则较快。因此可利用共聚焦 激光扫描荧光显微镜FRAP技术在蛋白质水平检测药物对朊病毒作用的效果本发明采用的技术方案是一种在活细胞内精确定量检测抗朊病毒药物作用效果 的方法，其步骤如下1) [GPSI+]酵母细胞的制备将荧光标签GFP基因插在野生型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae, ATCC, 208719)朊病毒[PSI+]的编码基因SUP35的N和M结构域中间，得到荧光标记[PSI+]朊病 毒的[GPSI+]酵母细胞；2) [GPSI+]酵母细胞的活化将[GPSI+]酵母细胞接入1/2YPD培养液中，30°C振荡过夜培养，然后调整[GPSI+] 酵母细胞悬液0D6(1(1 = 0. 2 ； 3)抗朊病毒药物的初筛选取无菌冻存管，分别加入待测药物、1/2YPD培养液以及调试好的[GPSI+]酵母细胞 悬液，在24°C的条件下，振荡培养，每天定时取前一天冻存管中的[GPSI+]酵母细胞放入新 的装有1/2YPD培养液和待测药物的无菌冻存管中，振荡培养5天；从第一天起，隔天提取 100 ul前一天的冻存管中的酵母细胞悬液，稀释后，在1/2YPD固体培养基上涂布；将涂布 的培养皿置于24°C恒温培养箱中培养3天，再转入4°C冰箱中培养7天，通过观察菌落颜色 的变化初步判断待测药物的治疗效果；Sup35p呈聚集状态时，朊病毒蛋白聚集体表现为较大的分子量，菌落颜色表现 为白色；经药物作用后，聚集的Sup35p解聚，菌落的颜色也随着聚集体的变化而变化—— Sup35p聚集体越小菌落颜色越深，即随着Sup35p聚集体从大到小，菌落依次表现为白色， 粉色，红色。彻底治愈的细胞内Sup35p完全解聚呈单体，表现为恒定的较小的分子量(约 为74kDa)，菌落颜色表现为红色。4)用荧光漂白恢复技术定量检测抗朊病毒药物作用效果培养取3)步中，经药物治疗不同时间后稀释涂平板在1/2YPD上长出的单菌落， 按菌落颜色分组，挑选每组的菌落在YPAD培养液中30°C振荡过夜培养；制样片在无菌载玻片上滴一滴2mg/mL刀豆球蛋白溶液，用无菌接种环铺开，区 域大小与盖玻片大小相当，自然晾干，将培养后的菌落稀释后滴一滴在载玻片上，盖上盖玻 片，指甲油封片。检测将样片置于激光共聚焦显微镜下，设置激发波长为488nm，输出功率为最大 输出功率的2%，针孔调整为3 u m,物镜为40倍，扫描整个样品，确定细胞，选取漂白区，漂 白功率为100%，漂白程度为50 80%，漂白后采集图像时间间隔为0.5秒，采集图像次数 为40 50次，漂白结束后，保存图像，分析数据。处理数据，得到细胞漂白后荧光恢复曲线(荧光恢复率VS时间)，可以定量的分析 Sup35p聚集体的大小。如图1所示[PSI+]细胞的朊病毒蛋白聚集，分子量较大，荧光分子 扩散速率慢，荧光漂白后漂白区的荧光恢复速率较慢，因此[PSI+]细胞的恢复曲线斜率较小，20秒内达到的最大荧光恢复率相对较小，而被治愈后的[psil细胞由于朊病毒蛋白呈 可溶状态，分子量小，荧光分子扩散速率较快，荧光漂白后漂白区的荧光恢复速率较快，因 此恢复曲线斜率较大，20秒内达到最大荧光恢复率较大。本发明的有益效果本发明能够在酵母活体细胞内定量分析药物对于朊病毒的作 用效果。现有方法中，利用野生型酵母细胞进行药物筛选的方法，是通过菌落颜色变化来判 断药物对朊病毒的作用，或者利用SDS-PAGE/Western Blot检测蛋白质聚集体的大小变化 来评价药物的作用效果，但是检测过程繁琐费时，而且不能在活细胞中精确定量检测聚集 体的大小。而本发明由于在朊病毒[PSI+]的编码基因SUP35上，插入了绿色荧光标签GFP 基因，在待测药物作用过程中，利用共聚焦激光扫描荧光显微镜FRAP技术在活细胞内检测 朊蛋白聚集体的大小，可精确地评估出药物对于朊病毒聚集体的作用效果。本发明因具有 方便以及能够在活细胞中定量检测药物对于朊病毒的治疗作用的优点，为大范围内的筛选 抗朊病毒的药物奠定了技术基础。
图1是[PSI+]和[psi_]细胞荧光漂白后的恢复曲线；图2A是实施例1中盐酸胍作用[PSI+]细胞一天后1/2YPD平板上挑选不同颜色 的菌落经过FRAP技术检测后的恢复曲线；图2B是实施例1中盐酸胍作用[PSI+]细胞三天后1/2YPD平板上挑选不同颜色 的菌落经过FRAP技术检测后的恢复曲线；图2C是实施例1中盐酸胍作用[PSI+]细胞五天后1/2YPD平板上挑选不同颜色 的菌落经过FRAP技术检测后的恢复曲线；图3A是实施例2中菲啶作用[PSI+]细胞一天后1/2YPD平板上挑选不同颜色的 菌落经过FRAP技术检测后的恢复曲线；图3B是实施例2中菲啶作用[PSI+]细胞三天后1/2YPD平板上挑选不同颜色的 菌落经过FRAP技术检测后的恢复曲线；图3C是实施例2中菲啶作用[PSI+]细胞五天后1/2YPD平板上挑选不同颜色的 菌落经过FRAP技术检测后的恢复曲线。
具体实施例方式菌种来源Sf生型酿酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae ATCC208719)，来自 于美国标准菌种库(American Type Culture Collection，ATCC)，保藏编号为 208719。实施例1在活细胞内精确定量检测盐酸胍对朊病毒的作用效果1) [GPSI+]酵母细胞的制备利用基因重组技术将荧光标签GFP(绿色荧光蛋白)基因插在野生型酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae ATCC 208719)朊病毒[PSI+]的编码基因 SUP35 的 N 和 M 结 构域中间，得到荧光标记[PSI+]朊病毒的[GPSI+]酵母细胞；2) [GPSI+]酵母细胞的活化将[GPSI+]酵母细胞接入1/2YPD培养液中，30°C振荡过夜培养，然后调整[GPSI+] 酵母细胞悬液0D6(1(1 = 0. 2 ；
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3)抗朊病毒药物的初筛选取2支无菌冻存管，分别加入1/2￥ 0培养液900111、895111;上述调试好的 [GPSI+]酵母细胞悬液各100 ill以及11111的盐酸胍0111、5111，使盐酸胍终浓度分别为01111、 5mM。在24°C的条件下，振荡培养5天。每天定时取前一天冻存管中的[GPSI+]酵母细胞 100 Pi放入新的装有和上述同样含量的1/2YPD培养液和盐酸胍的无菌冻存管中。从第一 天起，隔天提取100 yl前一天的冻存管中的酵母细胞悬液，稀释后，在1/2YPD固体培养基 的培养皿上涂布；将涂好酵母细胞悬液的培养皿置于24°C恒温培养箱中培养3天，再转入 4°C冰箱中培养7天，观察菌落颜色的变化。在盐酸胍作用的过程中，经5天的治疗，菌落颜色从白色逐渐变为粉色和红色，初 步判断盐酸胍对朊病毒具有治疗效果；4)用FRAP技术定量检测盐酸胍对朊病毒的作用效果培养取3)步中，经药物治疗不同时间后稀释涂在1/2YPD平板上长出的单菌落， 按菌落颜色分组(将同一天的颜色相同的菌落作为一组)，每组挑取单菌落3 5个在YPAD 培养液中30°C振荡过夜培养；制样片在无菌载玻片上滴一滴2mg/mL刀豆球蛋白溶液，用无菌接种环铺开，区 域大小与盖玻片大小相当，自然晾干，将培养的不同颜色的菌液稀释后滴一滴在上步干燥 的载玻片上，盖上盖玻片，指甲油封片。FRAP检测将样片置于激光共聚焦显微镜的指定位置(激光共聚焦显微镜采用奥 林巴斯FV1000型)，设置相关的“Bleach/Time Series Scan”过程的参数，设置激发波长为 488nm，输出功率为最大输出功率的2 %，针孔调整为3 u m,物镜为40倍，扫描整个样品，确 定细胞，选取漂白区(R0I)，漂白功率为100%，漂白程度为50 80%，漂白后采集图像时间 间隔为0. 5秒，采集图像次数为40 50次，漂白结束后，保存图像，分析数据。数据处理结果如图2A 图2C所示，盐酸胍作用一天后的1/2YPD平板上只有白色 菌落，经过FRAP技术检测后为[PSI+]细胞(图2A)。盐酸胍作用三天后的1/2YPD平板上有 白色、粉色和红色菌落，经过FRAP技术检测分别为[PSI+]、[psil和[psi_]细胞(图2B)。 盐酸胍作用五天后的1/2YPD平板上有白色、粉色和红色菌落，经过FRAP技术检测后分别为 [PSI+]、[psil和[psil细胞(图2C)。根据盐酸胍作用不同时间的1/2YPD平板上的白色、 粉色和红色菌落即[PSI+]、[psi_]占总菌落数的比例不同可以比较5mM盐酸胍不同时间的 治愈效果。这也说明我们采用的评价药物作用效果的方法具有可行性。实施例2在活细胞内精确定量检测菲啶对朊病毒的作用效果1) [GPSI+]酵母细胞的制备利用基因重组技术将荧光标签GFP(绿色荧光蛋白)基因插在野生型酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae ATCC 208719)朊病毒[PSI+]的编码基因 SUP35 的 N 和 M 结 构域中间，得到荧光标记[PSI+]朊病毒的[GPSI+]酵母细胞；2) [GPSI+]酵母细胞的活化将[GPSI+]酵母细胞接入1/2YPD培养液中，30°C振荡过夜培养，然后调整[GPSI+] 酵母细胞悬液0D6(1(1 = 0. 2 ；3)抗朊病毒药物的初筛选取5支无菌冻存管，按下表分别加入1/2YPD培养液、1M DMS0溶解的盐酸胍、DMS0、40mM DMS0溶解的菲啶溶液和调试好的[GPSI+]酵母细胞菌液。在24°C的条件下，振荡培 养5天。每天定时稀释酵母细胞培养液，即取前一天冻存管中的[GPSI+]酵母细胞100 yl 放入新的共装有900 yl培养液和不同药物的无菌冻存管中。
从第一天起，隔天提取100 iU前一天的冻存管中的酵母细胞悬液，稀释后，在 1/2YPD固体培养基的培养皿上涂布；将涂好酵母细胞悬液的培养皿置于24°C恒温培养箱 中培养3天，再转入4°C冰箱中培养7天，观察菌落颜色的变化。在菲啶作用的过程中，经5天的治疗，菌落颜色从白色逐渐变为粉色和红色，初步 判断菲啶对朊病毒具有治疗效果；4)用FRAP技术定量检测菲啶对朊病毒的作用效果培养取3)步中，经药物治疗不同时间后稀释涂平板在1/2YPD上长出的单菌落， 按菌落颜色分组(将同一天的颜色相同的菌落作为一组)，每组挑取单菌落3 5个在YPAD 培养液中30°C振荡过夜培养；制样片同实施例1FRAP检测同实施例1处理数据得到不同试样的荧光漂白恢复曲线如图3A 图3C所示，0. 5mM盐酸胍 +0. 2mM菲啶共同作用于[PSI+]细胞一天、三天和五天后1/2YPD平板上出现不同颜色的菌 落，利用FRAP技术检测不同菌落的聚集体的大小发现0. 5mM盐酸胍+0. 2mM菲啶作用一天 后出现的白色和粉色菌落的聚集体大小分别与[PSI+]和[psi—]细胞相近(图3A) ；0. 5mM 盐酸胍+0. 2mM菲啶作用三天后出现的白色、粉色和红色菌落的聚集体大小分别与[PSI+]、 [psi—]和[psil细胞相近(图3B) ；0. 5mM盐酸胍+0. 2mM菲啶作用五天后出现的白色、粉色 和红色菌落的聚集体大小分别与[PSI+]、[psil和[psil细胞相近(图3C)。说明0. 5mM 盐酸胍+0.2mM菲啶对[PSI+]细胞有治愈作用。说明亚治愈的盐酸胍可以与微量的菲啶协 同作用治愈酵母朊病毒，这也说明了我们采用的方法评价药物的作用效果具有可操作性。实施例1和实施例2用已知的抗朊病毒药物盐酸胍和菲啶对本发明的方法进行了 验证。本发明的方法适用于在次级药物筛选中精确定量的检测其抗朊病毒的作用效果，对 于某一新的化合物或已知的药物，可以按本发明的步骤，通过初筛选来初步判断其是否具 有抗朊病毒的作用，经初步判断后，可以进一步采用荧光漂白恢复技术FRAP定量检测抗朊 病毒药物作用效果。
权利要求
一种在活细胞内精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法，其特征在于步骤如下1)[GPSI+]酵母细胞的制备将荧光标签GFP基因插在野生型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，ATCC，208719)朊病毒[PSI+]的编码基因SUP35的N和M结构域中间，得到荧光标记[PSI+]朊病毒的[GPSI+]酵母细胞；2)[GPSI+]酵母细胞的活化将[GPSI+]酵母细胞接入1/2YPD培养液中，30℃振荡过夜培养，然后调整[GPSI+]酵母细胞悬液OD600＝0.2；3)抗朊病毒药物的初筛选取无菌冻存管，分别加入待测药物、1/2YPD培养液以及调试好的[GPSI+]酵母细胞悬液，在24℃的条件下，振荡培养，每天定时取前一天冻存管中的[GPSI+]酵母细胞放入新的装有1/2YPD培养液和待测药物的无菌冻存管中，振荡培养5天；从第一天起，隔天提取100μl前一天的冻存管中的酵母细胞悬液，稀释后，在1/2YPD固体培养基上涂布；将涂布的培养皿置于24℃恒温培养箱中培养3天，再转入4℃冰箱中培养7天，通过观察菌落颜色的变化初步判断待测药物的治疗效果；4)用荧光漂白恢复技术定量检测抗朊病毒药物作用效果培养取3)步中，经药物治疗不同时间后稀释涂在1/2YPD平板上长出的单菌落，按菌落颜色分组，挑选每组的菌落在YPAD培养液中30℃振荡过夜培养；制样片在无菌载玻片上滴一滴2mg/mL刀豆球蛋白溶液，用无菌接种环铺开，区域大小与盖玻片大小相当，自然晾干，将培养后的菌落稀释后滴一滴在载玻片上，盖上盖玻片，指甲油封片。检测将样片置于激光共聚焦显微镜下，设置激发波长为488nm，输出功率为最大输出功率的2％，针孔调整为3μm，物镜为40倍，扫描整个样品，确定细胞，选取漂白区，漂白功率为100％，漂白程度为50～80％，漂白后采集图像时间间隔为0.5秒，采集图像次数为40～50次，漂白结束后，保存图像，分析数据。
全文摘要
本发明涉及一种在活细胞内精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法。采用的技术方案是1)将荧光标签GFP基因插在野生型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ATCC208719)朊病毒[PSI+]的编码基因SUP35的N和M结构域中间，得到荧光标记[PSI+]朊病毒的[GPSI+]酵母细胞；2)将[GPSI+]酵母细胞的活化；3)通过观察菌落颜色的变化对抗朊病毒药物进行初筛选；4)用荧光漂白后恢复技术FRAP定量检测抗朊病毒药物作用效果。本发明具有方便以及能够在活细胞中精确定量检测药物对朊病毒的治愈作用的优点，为筛选抗朊病毒药物提供一种快捷、准确的评价作用效果的方法。
文档编号C12Q1/02GK101858866SQ20101013200
公开日2010年10月13日 申请日期2010年3月25日 优先权日2010年3月25日
发明者宋尧, 宋有涛, 李辉, 钟正伟 申请人:辽宁大学