应用肿瘤特异性启动子表达报告基因来检测循环血中肿瘤细胞的方法和试剂的制作方法

专利名称：应用肿瘤特异性启动子表达报告基因来检测循环血中肿瘤细胞的方法和试剂的制作方法
应用肿瘤特异性启动子表达报告基因来检测循环血中肿瘤
细胞的方法和试剂大多数癌症患者死于肿瘤转移，转移是指肿瘤细胞通过循环系统从原发部位扩散到远离部位，并在新的器官中繁殖生长成新的转移瘤(Ecclesand Welch，2007)。据估计，每克肿瘤组织每天约有106细胞进入血液(Chang et al. ,2000 ；Butler and Gullino，1975)， 不过这其中的大部分很快会清除(Butler and Gullino, 1975 ；Luzzi et al.，1998)。但是，众所周知，肿瘤细胞的侵入和转移在早期就会发生，甚至在癌症确诊前的很多年就会发生。因此，检测血液中的循环肿瘤细胞是癌症早期诊断的有效方法(Husemarmet al.,
2008；Gray, 2003 ；Kohn and Liotta，1995)。另外，最近一项研究表明手术前的循环肿瘤细胞(CTC)水平与癌症患者的总存活期存在相关性，而且术前术后循环肿瘤细胞数量的比较可能是治疗反应的指示剂(Scher et al. ,2009 ；de Bono et al.，2008)。因此，有效的检测循环血中肿瘤细胞不仅有益于癌症的早期诊断，而且对预后和治疗反应很有帮助。目前检测循环血中肿瘤细胞的方法有三种1)检测上皮细胞特异性蛋白的免疫测定；幻基于分子测定的检测肿瘤或上皮细胞特异性mRNA的PCR方法；幻检测与癌症有关的染色体畸变或基因扩增的荧光原位杂交。免疫测定是通过使用固定在磁性颗粒上的抗体来捕获表达某些组织、器官或肿瘤特异性抗原的细胞。由于大多数实体瘤来自上皮细胞源的细胞，因此在上皮细胞中特异性表达的蛋白(如角蛋白 cytokeratins(19，8，18and 20)和 EpCam(Litvinov et al.， 1994))已经被用作区分上皮细胞病和有核血细胞的生物标志物。但是，这个方法可能会导致一些假阳性或假阴性结果。第一，因为入侵的肿瘤细胞因上皮细胞向间质细胞转变， 而丢失原有的上皮抗原，这将导致假阴性结果(ffillipinski-Stapelfeldt et al. ,2005 ； Went et al.，2004)。第二，非肿瘤上皮细胞可能会存在于血液中，或者抗体可能会非特异性地与血细胞结合，这将导致假阳性结果。据估计，在正常对照中，约0% -20%的角蛋白 cytokeratin阳性细胞是白细胞(Goeminne etal. ,2000)。同时用血细胞特异性的抗体(如 CD45)对染可能会减少假阳性。抗器官特异性标志物的抗体，如前列腺特异抗原(PSA)，癌胚抗原(CEA)，mucin-l (MUC-I)，表皮生长因子受体(EGFR)，癌胚蛋白(AFP)，HER-2，也被用来检测循环肿瘤细胞，不过由于不是所有的肿瘤细胞都表达那些生物标志物，所以经常会产生假阴性结果。但是此方法的优点是可以用别的方法，如形态学、mRNA或基因扩增测定， 来富集和分析磁性颗粒捕获的循环血肿瘤细胞。循环血肿瘤细胞也可以通过其物理特性 (如大小和密度)富集。大部分血白细胞(淋巴细胞和中性粒细胞)的大小是8 llum， 而乳腺癌患者血液中肿瘤细胞的平均直径是四 35um(Meng et al.，2004)。使用荧光原位杂交(FISH)，比较基因组杂交(CGH)和突变分析等染色体组学分析可以进一步证明癌症是相关的染色体畸变、基因扩增、突变的存在(Swermenhuis et al. ,2009 ；Leversha et al. ,2009) 但是这些方法通常费用昂贵，而且耗时。反转录 PCR(RT-PCR)，尤其是实时定量反转录PCR，是一种敏感的、实际的，用来检测某些组织或器官(如上面提及的上皮细胞和器官特异性蛋白)的mRNAs特异性的方法(Kitago et al.，
2009； Iakovlevet al.，2008)。此方法可以与免疫测定法结合使用。例如，与免疫磁珠富集的循环血肿瘤细胞可以被进一步分析它们的组织或肿瘤特异性mRNAs的含量。虽然PCR方法在检测信号方面灵敏度高，但是需要采取严格的控制，避免过程中可能会产生的污染。由于缺乏高肿瘤特异性分子，免疫测定法和定量反转录PCR法的应用受到限制， 因此测定循环血肿瘤细胞的存在需要分析多种分子标志物。我们研发出一种新的检测血标本和骨髓标本中肿瘤细胞的方法。此方法使用由组织或肿瘤特异性启动子驱使报告基因表达，达到肿瘤细胞的检测目的。由报告基因驱使的肿瘤特异性启动子的表达盒被转染到血标本和骨髓标本中有核细胞中。然后培养细胞 12-48小时。随后用不同的方法和试剂检测报告基因的表达。表达盒运载所用的载体会在肿瘤细胞中，而不是在有核血细胞中有选择性地扩增或表达，所以检测出的信号对肿瘤细胞的特异性更高。基于所用的方法和用来检测报告基因的信号强度可以测定血标本和骨髓标本中的循环肿瘤细胞。此方法可靠，简单，在检测血标本和骨髓标本中的循环肿瘤细胞方面特异性高，并且对癌症患者的早期诊断，治疗反应的预测及其预后非常有益。可用于此目的的报告基因包括编码各种荧光蛋白(如绿色、红色、蓝色、黄色、 紫色荧光蛋白)的基因，萤火虫荧光素酶基因，海肾荧光素酶基因，细菌半乳糖苷酶 (LacZ)基因等。上述报告基因的表达可以由不同的方法检测。荧光蛋白的表达可以由荧光显微镜和荧光激活流式细胞分析法(FACQ检测。观察荧光显微镜下的细胞可以对细胞的大小和形状进行分析，这可能有益于进一步区分正常细胞和肿瘤细胞。荧光激活流式细胞分析法可以富集荧光阳性细胞，并进一步采用传统方法验证，如用免疫测定法和PCR测定法，进一步确认细胞。生物发光测定法可以检测萤火虫荧光素酶基因，海肾荧光素酶基因，细菌半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达。启动子是调控细胞表达的顺式序列。有些启动子不论其组织类型，生物种类，发育阶段，在大多数细胞中有活性。这种启动子叫做泛在启动子 (ubiquitous promoter)，如巨细胞病毒早期启动子(CMV)，劳斯肉瘤病毒长末端重复序列 (RSV)，SV40病毒启动子，PGK和EFl α启动子。有些启动子仅在某些类型的细胞中有活性。 例如，白蛋白启动子主要在肝细胞中有活性，probasin和前列腺特异性抗原启动子在前列腺组织中有活性。有些基因只在肿瘤细胞中表达，其转录调控序列是肿瘤特异性的。但是， 尽管可能这些启动子在肿瘤细胞中的活性比在正常细胞中的活性高一些，大多数启动子是组织或细胞型特异性的，而不是肿瘤特异性的。它们仅在一些肿瘤细胞中有活性。如肝癌的甲胎蛋白α，前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA)，胃癌的癌胚抗原(CEA)就是这样的例子。酪氨酸酶启动子在黑色素瘤中有活性，mucin-1启动子在粘膜细胞中有活性。相反，人 survivin基因，端粒体反转录酶基因(TERT)，midkine基因在很多种癌症中有活性。组织或肿瘤特异性启动子已经被用来在一些细胞或肿瘤细胞中的基因特异性表达。例如，这些启动子已经被用于癌症基因疗法中治疗基因的肿瘤特异性表达。有时这些启动子也用于转基因动物，控制某些特定组织中转基因的表达。端粒酶是一种特别的反转录酶，它负责染色体末端或端粒的复制(Morin，1989 ； Blackburn, 1992)。它在永生化细胞系和85 %人癌细胞中活性很高，但是在分化的正常人体细胞中是沉默的(Kim et al.，1994 ；Counter etal.，1992 ；Shay and Bacchetti，1997)。 越来越多的事实表明端粒体反转录酶催化亚基基因(TERT)在活化端粒酶方面扮演重要角色，并且端粒体反转录酶基因在原发性肿瘤细胞、多种癌细胞系和端粒酶阳性细胞中的基因表达水平很高(Nakamura et al. , 1997 ；Nakayama et al. , 1998 ；Meyerson et al., 1997)。因此，人端粒体反转录酶基因启动子可以作为广泛适用的肿瘤特异性启动子。体外研究表明人端粒体反转录酶基因启动子在人和鼠的肺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、 脑癌的癌细胞中活性很高(Gu et al. ,2000 ；Gu et al. ,2002a ；Gu et al. ,2002b ；Huang et al.，2002 ；Lin et al. ,2002a ；Lin etal.，2002b)，在正常人纤维母细胞中(Gu et al.， 2000)、正常人气管(Gu et al.，2000)、乳房(Lin et al.，2002b)、卵巢(Huang et al.， 2002)的上皮细胞中、正常人原代肝细胞中(Lin et al.，200 )、正常人⑶34+祖细胞中 (Gu et al.，200 )、正常鼠纤维母细胞(Gu et al. ,2002a)中没有活性。端粒酶启动子也被用来控制条件复制型病毒(包括溶瘤腺病毒)所需的病毒基因表达(Daviset al.，2006 ； Huang et al. ,2004 ；Irving et al.，2004)。端粒酶特异性溶瘤腺病毒可在肿瘤细胞中复制，于是会增加报告基因的拷贝量或表达水平，增加检测信号。通常组织特异启动子的活性较弱。为了提高启动子的转录激活性，同时保留其细胞特异性，研究者可以通过组合不同启动子的序列来设计启动子，从而形成混合型或嵌合型的启动子。使用最为广泛的是CAG启动子，它是结合了巨细胞病毒早期基因的增强子，鸡肌动蛋白基因启动子和兔子球蛋白基因剪接受体序列。这种混合型的启动子通过一些病毒或非病毒载体，驱使了许多基因在各种组织中的高表达。巨细胞病毒增强子的另一个运用是结合了组织特异启动子以加强目的基因的组织特异性的表达。例如，把巨细胞病毒增强子加入到端粒酶逆转录酶启动子中，将会加强端粒酶逆转录酶启动子的活性并且保留它的特异性。我们使用的基因工程的启动子包括端粒酶逆转录酶启动子序列和巨细胞病毒增强子，用于驱使报告基因的表达。甚至是任何一种的组织和肿瘤特异性启动子，或者是他们的嵌合型启动子都能被用来代替端粒酶逆转录酶/巨细胞病毒嵌合启动子。组织或肿瘤特异性启动子的活性也可以通过二元表达系统来加强，其中的弱肿瘤特异性启动子被用来表达强活性转录因子，例如GAL4-VP16融合蛋白，该转录因子接着启动第二个启动子来驱使目的基因表达。这种方法可以在不减少启动子特异性的情况下，增加弱肿瘤特异性启动子活性，有时可超过100多倍(Koch et al 2001)。GAL4-VP16体系已经成功地用于增强癌胚抗原和端粒酶逆转录酶启动子的活性。这些二元体系也将提高报道基因在肿瘤细胞中的表达，有助于检验循环血中肿瘤细胞。启动子，基因和多聚腺苷酸信号序列，这三个要素是报告基因和其他任何靶基因在哺乳动物细胞中表达成功的必要因素。这三个部分在单一 DNA片段中顺序排列叫做“表达盒”。多聚腺苷酸信号序列对组织细胞通常是非特异性的。因此，理论上来说，来自于任何基因的多聚腺苷酸信号序列都可用在表达盒中。通常使用的多聚腺苷酸信号序列来自于牛生长素基因，猿猴病毒40大T抗原基因，球蛋白基因和一些病毒基因。一个表达盒通常会和一个载体DNA连在一起，转染靶细胞，用于基因表达，例如在循环血肿瘤细胞中表达。一个能被用来转染细胞，用于表达核酸序列的载体核酸分子，被称之为载体。载体包括质粒，粘粒(cosmid)，病毒(噬菌体，动物病毒，植物病毒)和人工染色体，例如酵母人工染色体。表达盒能通过标准的重组技术克隆到载体。质粒能通过不同的方法转染到哺乳动物的细胞，例如，物理性的电穿孔法，和化学性的类脂和转染试剂。质粒，粘粒和人工染色体属于非病毒载体。某些病毒通过受体介导的内吞作用有效地转染或者进入细胞，并表达报告基因，这使得它们成为了转移外来核酸进入细胞(例如哺乳动物的细胞)的常用载体。用来转染报告基因或者其他任何基因进入细胞的病毒叫做病毒载体。通常使用的病毒载体来自腺病毒，腺相关病毒(AAV)，逆转录病毒，慢病毒的逆转录病毒(特定类型)，牛痘病毒，巨细胞病毒和单纯疱疹病毒等。有些病毒载体只能在包装(制备)细胞中复制，并不能在其它靶细胞中复制。这些病毒称为复制缺陷型载体。大多数逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺相关病毒载体，和El缺失腺病毒载体都属于有复制缺陷型载体。有些病毒载体，能够在某些种类的靶细胞中复制， 但是不能在其他种类的细胞中复制。他们被称为有条件复制能力的载体。举例来说，溶瘤病毒能够在肿瘤细胞中复制，但不能在其他正常的细胞中复制。溶瘤病毒之所以有这种细胞特异性复制能力，是因为一些病毒基因发生突变，或肿瘤特异性启动子取代了病毒启动子， 从而使一些病毒复制必需基因只能在肿瘤细胞中表达。用端粒酶逆转录酶启动子代替腺病毒El启动子，能导致溶瘤腺病毒在具有高端粒酶逆转录酶活性的癌细胞中复制(Davis et al. ,2006 ；Huang et al. ,2004 ；Irving et al.，2004)。复制缺陷型和条件复制型病毒载体，只要它们带有一个被肿瘤特异性启动子驱使的报告基因，就能够被用于循环血肿瘤细胞的检验。有些病毒载体被进一步进行了修改，改变了其表面的蛋白，使其具有靶向性和转染某些特定的细胞。更改病毒细胞表面蛋白，能加强它们在一些肿瘤细胞中的传染性。例如，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列能够和腺病毒纤维蛋白整合在一起，因此，腺病毒可以不通过腺病毒受体来传染细胞(Wiclcham 2000)。这些被更改过的载体能有效地检验循环血肿瘤细胞和低腺病毒受体水平的细胞。为了通过对报告基因的表达的分析，来检验循环血肿瘤细胞，报告基因应该仅在肿瘤细胞中表达，或者在被检验的细胞中表达，而不能在正常的血细胞中表达。例如不能在中性粒细胞，淋巴细胞和血小板中表达。两种方法可以用来实现这种选择性报告基因的表达，1)定向性的基因转染和2、选择性基因的表达。定向性的基因转染是通过选择特定类型的载体和转染方法来实现的，所以载体只能进入肿瘤细胞，上皮细胞和被检验的细胞。一些病毒载体就具有此类细胞特异性转染能力。举例来说，腺病毒通常不会感染白血细胞，因此，报告基因不会进入白血细胞。当分析报告基因表达时，这些细胞会保持阴性。选择性基因表达能通过使用肿瘤启动子或者特定细胞类型启动子来实现。因此，即使报告基因被转染到正常的血细胞中，其也不会被表达，并且，正常血细胞会保持阴性。肿瘤细胞，上皮细胞的特定启动子就可用于报告基因在肿瘤细胞或上皮细胞中表达，而不在血细胞中表达。例如端粒酶逆转录酶启动子，生存素启动子，probasin启动子，MUCl启动子，癌胚抗原启动子，甲胎蛋白启动子，酪氨酸酶启动子，和其嵌合性的启动子都可用于此目的。通过肿瘤和组织特异性启动子驱动的报告基因的表达，来检验循环血肿瘤细胞的方法包括以下一些步骤，每一步骤应该采取保护措施来防止样本污染和保持样本无菌。1.用抗凝血剂采集血液样本(5毫升-10毫升)，放入无菌管中。通常使用的抗凝血剂是乙二胺四乙酸和肝素。任何抗凝血剂，只要可以防止血液凝固的都可以使用，只要他们不会对以后的细胞培养产生副作用。2.对血液样本进行处理，除去红细胞。这可以通过梯度离心分离法，穿过聚蔗糖的方案解决，或用75-200毫摩尔氯化铵来溶解红细胞等，包括用其他药剂来减少对有核细胞的危害。可重复溶解的过程以达到红细胞的完全溶解。用此两种方法分离的有核细胞应该用磷酸盐缓冲盐水(PBQ或培养基清洗2-3次。3.用携带有肿瘤或者组织特异性启动子驱动的报告基因的表达载体转染细胞，接着将细胞培养在培养基中培养。培养时间取决于所用的表达载体和所用的报告基因表达和检测方法。有时，基因转染和细胞培养可同时进行。4.任何用于培养哺乳动物细胞的培养基都可用于此项用途。例如RPMI-1640， MEM, DMEM等培养基。培养基常常会被补充以5%-20%胎牛血清或小牛血清。培养基还可以补充以抗生素，如氨苄青霉素(50-200单位/毫升)和/或链霉素(50-200微克/毫升)。培养基能够被直接添加到含表达载体的溶液中。细胞被置于细胞培养箱中培养过夜， 或24-48小时。5.分析检测细胞样本中表达报告基因的细胞。取决于报告基因的性质，用不同分析方法检测表达报告基因的细胞。对于荧光蛋白，荧光显微镜，荧光激活流式细胞分析仪可用于检测表达荧光蛋白的阳性细胞。对荧光素酶和半乳糖苷酶检测，可使用生物发光和酶活性测定。至关重要的是，在正常值建立之前，对照组应该包括在测定中。阳性对照样品和阴性对样品都应在测试开始时就使用。具体地，本发明提供下列技术方案在一个方面中，本发明提供一种肿瘤特异性启动子，其在肿瘤细胞中的活性比其在正常细胞中的活性要高。在第一方面的一个实施方案中，所述肿瘤特异性启动子包括人端粒酶逆转录酶启动子，survivin启动子，medkine启动子，癌胚抗原启动子，MUC-I启动子和probasin基因启动子。在第一方面的一个实施方案中，所述端粒酶逆转录酶启动子序列如SEQ ID NO :1所显示。在第一个方面的一个实施方案中，所述肿瘤特异性启动子可以是组织或者细胞型特异性基因的原启动子，也可以是经改造的组合启动子。在第一个方面的一个实施方案中，所述所述组合启动子是含有源自组织或细胞型特异性启动子的序列和源自其他启动子的增强子的嵌合型启动子。在第一方面的一个实施方案中，所述嵌合型启动子是TC嵌合启动子，其包含人体端粒酶逆转录酶启动子和巨细胞病毒增强子。在第一个方面的一个实施方案中，其中所述嵌合启动子序列如SEQ IDNO :8所显示。在第二个方面中，本发明提供一种载体，其是包括由第一方面的肿瘤特异性启动子驱使表达的报告基因基因表达载体。在第二个方面的一个实施方案中，其中提及的报告基因是一种通常作为启动子活性指示剂的基因。在第二个方面的一个实施方案中，其中所述报告基因包括荧光蛋白(绿色，红色，黄色和蓝色荧光蛋白)的基因，萤火虫荧光素酶基因，海肾荧光素酶基因，细菌半乳糖苷酶(LacZ)基因。在第二个方面的一个实施方案中，其中所述基因表达载体指任何一种用于基因转染的载体。在第二个方面的一个实施方案中，其中所述基因表达载体包括质粒，质粒/脂质复合物以及病毒载体。在第二个方面的一个实施方案中，其中提及的病毒载体是指复制缺陷型病毒载体和可复制型病毒载体，例如腺病毒载体，可复制型腺病毒载体，疱疹病毒载体，牛痘病毒载体等。在第二方面的一个实施方案中，所述腺病毒载体是第5型人腺病毒。本发明提及的腺病毒载体是在稳定腺病毒载体活性的缓冲液中配制的。缓冲液含Tris，NaCl, EDTA，乙醇，组氨酸，蔗糖。在第二个方面的一个实施方案中，其中所述病毒载体是经过病毒纤维改进后的。在第二个方面的一个实施方案中，其中所述病毒纤维改进是通过将编码精氨酸-甘油酸-天冬氨酸(RGD)序列插入到位于图距单位86-91的腺病毒基因组中，从而使病毒纤维蛋白含RGD序列，改变其受体特异性，改进后的载体可经整合素蛋白进入靶细胞。在第二个方面的一个实施方案中，其中组织或肿瘤特异性启动子的活性通过二元表达系统来加强。 在第二个方面的一个实施方案中，所述二元表达系统应用绿色荧光蛋白/TRAIL融合基因。 在第二个方面的一个实施方案中，所述绿色荧光蛋白/TRAIL融合基因如SEQ ID NO :5所显示。在第二个方面的一个实施方案中，其中提及的基因表达载体包括可复制型腺病毒载体 Ad/El-GFP 和 Ad/El-GFP-RGD，复制缺陷型腺病毒载体 Ad/TERT_GFP，Ad/TERT-LacZ, Ad/ GFP-TRAIL 和 Ad/TERT-Luciferase。在第三个方面中，本发明提供一种试剂盒，其用于癌症患者的早期诊断，治疗反应的预测及其预后，其包含第一方面的肿瘤特异性启动子和/或第二个方面的载体。在第三个方面中的一个实施方案中，所述试剂盒用于检测血标本和骨髓标本中的肿瘤细胞。在第四个方面中，本发明提供一种诊断剂，其用于癌症患者的早期诊断，治疗反应的预测及其预后，包含第一方面的肿瘤特异性启动子和第二个方面的载体。在第四个方面的一个实施方案中，所述诊断剂用于检测血标本和骨髓标本中的肿瘤细胞。在第五个方面中，本发明提供第一方面的肿瘤特异性启动子用于制备第二个方面的载体以及第三方面的试剂盒和第四方面的诊断剂的应用。


图1，比较LacZ基因在正常细胞(NHBE，NHLF，⑶;34+)，正常组织(脾和肝)及癌细胞(H1299，AM9，UV-2237M)中的表达。细胞或小鼠用相同剂量的腺病毒载体(Ad/CMV_GFP， Ad/CMV-LacZ, Ad/hTERT-LacZ))转染。用Χ-gal染色法检测LacZ基因(β -半乳糖苷酶) 活性。阳性细胞为蓝色。细胞名称列于左侧。上方为所用载体，右方提示细胞(组织)属性，正常或癌细胞。图2，癌细胞(HU99，A549，L0V0，DLD1)和正常细胞(OKM+，NHFB，NHBE)用相同剂量的腺病毒载体(Ad/CMV-GFP，Ad/CMV-LadZ，Ad/hTERT-LacZ)转染后，用发光法分析β-半乳糖苷酶活性。β-半乳糖苷酶活性用相对光强度(relative light units (RLU) / μ g蛋白)表示。所示值为三次分析的均值+标准差(SD)。图3.由腺病毒载体Ad/hTERT-gBax介导的GFP-Bax融合基因在肿瘤中的特异表达。左侧，肿瘤细胞(H1299，AM9，H322，H358)和正常成纤维细胞(NHFB)用相同剂量的Ad/ CMV-GFP或Ad/TERT-GFP/Bax (2000病毒颗粒/细胞)转染，48小时后在荧光显微镜下观察 GFP或GFP/Bax的表达。CMV驱动的GFP在所有细胞中都表达，而TERT驱动的GFP-Bax仅在肿瘤细胞中表达，而不在NHFB中表达。右侧，带瘤小鼠用Ad/CMV-GFP或Ad/TERT_GFP/ Bax治疗后肿瘤和肝GFP和GFP-Bax，Bax的表达。Bax表达用免疫组化法检测。细胞调亡用TUNEL法检测。GFP-Bax和Bax仅在肿瘤中表达并引起调亡，但不在正常肝组织中表达。图4.上方，腺病毒载体Ad/gTRAIL示意图.腺病毒El区(map unit 1. 3-9. 3)被由GT启动子表达GFP/TRAIL的表达盒和由TERT启动子表达Gal4/GV16的表达盒取代。下方，肿瘤细胞(DLD-I)和正常细胞(NHFB)用相同剂量的Ad/CMV-GFP或Ad/gTRAIL转染，48 小时后观察GFP或GFP-TRAIL的表达及细胞状态。GFP-TRAIL仅在DLDl细胞中表达并杀死细胞。图5。TERT/CMV(TC)融合启动子示意图。本图含TC-GFP表达盒。TC启动子序列见SEQ ID NO:8。图6，条件复制型腺病毒(Ad/GFP-El)示意图(上方)及其El基因在正常细胞 (NHFB)和肿瘤细胞(MiaPaca2, H1299, DLD1)中的表达。Ad/GFP-El由TC启动子驱动GFP 和El。El蛋白表达用蛋白印迹法(Western blot)检测。图7。条件复制型腺病毒(Ad/ GFP-E1)携带的GFP基因在肿瘤细胞(HU99)和正常细胞(NHFB)中的表达(左侧)，图上方为转染剂量。右侧，条件复制型腺病毒(Ad/GFP-El)携带的GFP基因在实体肿瘤中的表达。图8，纤维蛋白修饰后的条件复制型腺病毒(Ad/GFP-El-RGD)。上方，病毒载体示意图，与图6所示相同，由TC启动子驱动GFP和E1。但病毒的纤维蛋白含RGD序列。下方，比较Ad/CMV-GFP，Ad/GFP-El, Ad/GFP-El-RGD在实体瘤中的表达。将病毒载体注射到实体瘤中，两周后观察GFP表达。Ad/GFP因不能在肿瘤中复制，随肿瘤增长而表达消失。 Ad/GFP-El, Ad/GFP-El-RGD均有GFP在肿瘤中表达，而不在周围正常细胞中表达。但Ad/ GFP-El-RGD的GFP表达更高。图9，正常血样，加肿瘤细胞(上方)与不加肿瘤细胞(下方)，分别用Ad/GFP-El， 和Ad/GFP-El-RGD转染，24小时后在荧光显微镜下观察GFP表达。GFP阳性细胞仅在加肿瘤细胞的血样中，而不在无肿瘤细胞的血样中。图10。比较正常人(normal)与肿瘤(肺癌)患者的血样。各取5毫升血，分离白细胞，并用Ad/GFP-El转染白细胞二4小时后在镜下观察细胞。左侧，荧光镜(黑白照)，右侧，普通镜，但相通视野。正常血样中无GFP阳性细胞，而肺癌患者血中则有GFP阳性细胞 (肿瘤细胞)。图11是Ad/CMV-LacZ的图谱。第5型人腺病毒的El基因G56bp-322m3p，图谱单位1.3-9. 3)被删除，并在该区域插入一基因表达盒(如图所示).AD/TERT-LacZ的表达盒含有TERT启动子，LacZ基因(LacZ)和牛生长素基因的多聚A信号序列(BGHpA)。第5型人腺病毒的图谱单位显示在图的上方。图12是Ad/TERT-LacZ的图谱。第5型人腺病毒的El基因056bp-3228bp，图谱单位1.3-9. 3)被删除，并在该区域插入一基因表达盒(如图所示).AD/TERT-LacZ的表达盒含有TERT启动子，LacZ基因(LacZ)和牛生长素基因的多聚A信号序列(BGHpA)。第5型人腺病毒的图谱单位显示在图的上方。图13是Ad/TERT-Bax的图谱。第5型人腺病毒的El基因056bp-3228bp，图谱单位1. 3-9. 3)被删除，并在该区域插入双基因表达盒(如图所示).AD/TERT-Bax的双表达盒含有TERT启动子，TetR-GV16基因(TetR_GV16)，牛生长素基因的多聚A信号序列(BGHpA)， TRE 启动子，GFP/Bax 基因(GFP/Bax)，和 SV40 多聚 A 信号序列(sv40polyA)。第5型人腺病毒的图谱单位显示在图的上方。TERT =人端粒酶逆转录酶基因启动子TRE =四环素反应因子启动子TetR =四环素抑制蛋白图14是Ad/TERT-gTRAIL的图谱。第5型人腺病毒的El基因056bp-3228bp，图谱单位1.3-9. 3)被删除，并在该区域插入双基因表达盒(如图所示).AD/TERT-gTRAIL的双表达盒含有TERT启动子，GAL4-GV16基因(GAL4-GV16)，牛生长素基因的多聚A信号序列(BGHpA)，GT 启动子，GFP/TRAIL 基因(GFP-TRAIL)，禾口 SV40 多聚 A 信号序列(sv40polyA)。TERT =人端粒酶逆转录酶基因启动子GT = GT 启动子，含 GAL4/TATA 序列第5型人腺病毒的图谱单位显示在图的上方。图15是Ad/GFP-El的图谱。第5型人腺病毒的El基因启动子(45 - ,图谱单位1.3-1。5)被删除，并在该区域插入一基因表达盒(如图所示).AD/GFP-E1的表达盒含有TC启动子，GFP基因(GFP)，牛生长素基因的多聚A信号序列(BGHpolyA)。接着又是TC启动子，并由它控制El基因的表达。TC = TC启动子，含人端粒酶逆转录酶基因启动子和CMV增强子序列。第5型人腺病毒的图谱单位显示在图的上方。图16是AD/CMV-GFP的图谱。第5型人腺病毒的El基因G56bp-322m3p，图谱单位1.3-9. 3)被删除，并在该区域插入一基因表达盒(如图所示).AD/CMV-GFP的表达盒含有CMV启动子，绿色荧光蛋白基因(GFP)和牛生长素基因的多聚A信号序列(BGHpA)。第5型人腺病毒的图谱单位显示在图的上方图17是Ad/GFP-El-R⑶的图谱。第5型人腺病毒的El基因启动子(45 - , 图谱单位1.3-1。5)被删除，并在该区域插入一基因表达盒(如上图所示).AD/GFP-E1-RGD 的表达盒含有TC启动子，GFP基因(GFP)，牛生长素基因的多聚A信号序列(BGHpolyA)。接着又是TC启动子，并由它控制El基因的表达。本载体的病毒纤维蛋白被改进，含RGD序列。TC = TC启动子，含人端粒酶逆转录酶基因启动子和CMV增强子序列RGD = Arg-Gly-Asp氨基酸序列，它被插入到图谱单位约86-91的腺病毒纤维蛋白基因中，这使表达的纤维蛋白含⑶CRGDCFC氨基酸序列。第5型人腺病毒的图谱单位显示在图的上方。本发明将通过下列具体实施方式
进一步举例说明，但需要注意的是本发明并不限于所述实施例。本发明的范围仅由后附的权利要求限定。
实施例材料与方法本发明所用的具体的腺病毒载体为第5型人腺病毒(human adenovirustype 5)， 构建腺病毒载体的质粒可以购自Stratagene公司(http://www. stratagene. com/lit/ vector, aspx) (catalog#240010)或 CellBiolabs, Inc.公司(http://www. cellbiolabs. com)(catalog#VPK-250)。下述实施例中所述的腺病毒载体(构建腺病毒载体的质粒来自Mratagene 公司，catalog#240010)构建方法与文献报道相同，(见文献FangB，Eisensmith RC, Li XHC, Finegold MJ, Shedlovsky A, Dove W, Woo SLC. Gene Therapy for Phenylketonuria :phenotypic correction in a geneticallydficient mouse model by adenovirus-mediated hepatic gene transfer. GeneTherapy 1; 1994)。 一般先用分子克隆技术将目的基因的表达盒，如TERT-GFP，插入到一穿梭质粒中(shuttle plasmid)。使该表达盒的俩端分别含有一小段来自重组腺病毒的DNA序列。再将穿梭质粒和另一含有几乎全部或极大部分重组腺病毒载体序列的质粒(如PJM17，pBHGlO)，共转染到293细胞中。将细胞在培养箱中培养1 2周。穿梭质粒与PJM17或pBHGlO会在四3细胞中发生同源重组，形成重组的腺病毒载体。再用多聚酶链反应法或检测目的基因表达的方法来检测所得到腺病毒是否是所需要的重组腺病毒载体。最后，提取腺病毒的DNA进行序列分析，进一步验证重组腺病毒载体重组部位的序列。实施例1.端粒酶逆转录酶启动子(端粒酶逆转录酶)驱动肿瘤特异性报告基因 LacZ的表达。图1显示，比较人类端粒酶逆转录酶启动子和巨细胞病毒启动子驱动报告基因 LacZ的表达。在实验中，我们用载有378bp长的端粒酶逆转录酶核心启动子(SEQID NO 1)驱动的LacZ基因(SEQ ID NO 2)的复制缺陷型人腺病毒载体(Ad/TERT-LacZ)(该载体是经重组DNA技术而构建(Gu et al,2000)构建的载体图谱见图12)感染(具体的感染方法见Gu J et al,2000)正常或肿瘤细胞。将载有CMV启动子(SEQ ID NO 9)驱动的LacZ 基因的腺病毒载体(Ad/CMV-LacZ)(其构建方法见Gu et al，2000，启动子、LacZ基因在载体上的排列见所附载体图谱图11)用作阳性对照。病毒感染单位为1000颗粒/细胞。培养的人体肺癌细胞株(H1299和A549)，小鼠纤维肉瘤细胞(UV-2237)，正常的人体成纤维细胞(NHLF)，⑶34+间质主细胞，正常的人体支气管上皮细胞(NHBE)(购自American Type CultureCollection或Clonetics Corp (San Diego, CA)，用相同剂量的腺病毒颗粒感染细胞M小时后，用X-gal染色法分析半乳糖苷酶活性(具体方法见Gu J etal，2000)。X-gal 染色法分析显示，在所有癌细胞株中，CMV启动子和端粒酶逆转录酶启动子都能驱动较强的 β -半乳糖苷酶表达。而在两个正常的细胞株里，只有感染了 Ad/CMV-LacZ病毒的细胞产生了高水平的LacZ基因表达(将近100% )(图1)。用同样药剂量的Ad/TERT-LacZ病毒感染的正常细胞仅仅产生了非常少的LacZ-阳性细胞。在所有细胞的检测中，在癌细胞里的端粒酶逆转录酶启动子的活性显著高于在正常细胞中的(P ^ 0. 05)。同样的结果也出现在对小鼠的实验中。将^clOici腺病毒载体注入小鼠尾静脉，两天后将小鼠处死，并取各器官进行半乳糖苷酶活性分析。注射生理盐水的小鼠用作背景对照品。在注射Ad/CMV-LacZ病毒的小鼠肝脏和脾脏里检测(具体方法见Gu J et al, 2000)到了高水平的β-半乳糖苷酶活性。在用Ad/CMV-LacZ病毒处理的小鼠的其他器官里，酶的活性和背景对照品(即注射生理盐水的小鼠)保持一致。在对比后可发现，在注入 Ad/TERT-LacZ的小鼠肝脏，脾脏和其他小鼠的器官中的酶的活性，都在背景对照品所见的范围之内。说明Ad/TERT-LacZ的报道基因表达与经磷酸盐缓冲液，对照载体处理的小鼠相同。(结果详见图1)实施例2.端粒酶逆转录酶启动子和巨细胞病毒启动子活性的比对用磷酸盐缓冲液，对照载体(Ad/CMV-GFP)(构建方法见Gu et al. ,2000.载体图谱见附图16),Ad/TERT-LacZ(图12)或Ad/CMV-LacZ.(图11)转染(即在细胞培养液中加入磷酸盐缓冲液或重组腺病毒颗粒(1000病毒颗粒/细胞))癌细胞(HU99，A549, Lovo, 和DLD1)和正常细胞(人体成纤维细胞(NHFB)，CD34+间质主细胞，正常的人体支气管上皮细胞(NHBE))(购自Clonetics Corp (San Diego, CA))。用β -半乳糖苷酶活性分析法检验LacZ表达(具体方法见Gu et al，2000)。来自于巨细胞病毒或端粒酶逆转录酶启动子的半乳糖苷酶活性，在癌细胞中只相差了 2-10倍。但是，在正常的细胞中，它们却相差超过500倍。结果详见图2。
实施例3. CMV启动子和端粒酶逆转录酶启动子驱使绿色荧光融合蛋白的表达同样的结果也在巨细胞病毒(CMV)启动子和端粒酶逆转录酶启动子驱使绿色荧光融合蛋白的实验中获得。 用Ad/CMV-绿色荧光蛋白(Ad/CMV-GFP)(图16)或Ad/TERT-绿色荧光蛋白/ Bax (Ad/TERT-GFP/Bax)(图 13)转染人肺癌细胞(H1299, A549, H322 和 H!358)，即在细胞培养液(MEM或DMEM)中加入1000病毒颗粒/细胞。Ad/CMV-GFP(图16)禾口 Ad/TERT-GFP/ Bax (具体构建方法见Gu etal.，2002b.载体图谱见附图1 均为复制缺陷型腺病毒载体， 由它们各自的表达盒(CMV-GFP (GFP基因序列见SEQ ID NO 3)或TERT_GFP/Bax (GFP/Bax 基因融合序列见SEQ ID NO :4))插入并取代腺病毒El区(见所附在图谱)而构建的，表达盒的启动子见基因所附序列(TetR和TRE序列，编号为SEQ ID NO 11和12)。转染后的细胞经培养(37°C，5% CO2，培养液为含10%小牛血清的DMEM) 24-48小时，可在荧光显微镜(Olympus)下检测到绿色荧光蛋白和绿色荧光蛋白-Bax融合蛋白的表达。图3显示，巨细胞病毒-绿色荧光蛋白能在所有癌细胞(H1299，AM9，H322和H358)和正常细胞(NHFB) 中表达。但是，端粒酶逆转录酶-绿色荧光蛋白只能在癌症细胞里表达，而不能在正常的 NHFB细胞里表达。在小鼠体内的测试也得到了同样的结果(具体的测试方法见Gu et al., 2002b)。将切101(1腺病毒载体注入小鼠尾静脉或小鼠的肿瘤中，两天后将小鼠处死，取其肝脏组织或肿瘤组织，冷冻切片后荧光显微镜(Olympus)下观察。CMV-GPF在肿瘤组织和正常的肝脏组织里得到表达。但是，TERT-GFP/Bax只在肿瘤组织里得到表达。这些结果表明肿瘤特异的报告基因或目的基因表达是通过端粒酶逆转录酶启动子获得的，结果如图3。实施例4.用二元表达系统进行肿瘤特异性基因表达应用绿色荧光蛋白/TRAIL融合基因(GFP/TRAIL其序列见SEQ IDNO 5)观察肿瘤细胞特异性基因表达。这显示说明书中提到的二元表达系统进行肿瘤特异性基因表达。在这种情况下，Gal4/VP16融合转录因子(其序列如SEQ ID NO 6所示)被用来增强肿瘤特异性基因表达。端粒酶逆转录酶启动子被用来驱动fel4/VP16表达。被表达的 Gal4/VP16再激活它的靶启动子Gal4/TATA(GT)(其序列如SEQ ID NO 7所示)启动子，后者用于驱使绿色荧光蛋白-TRAIL的表达。这个二元表达系统的好处是，转基因表达水平可显著增强(超过100倍)，但启动子的特异性却被保留(Koch et al 2001)。如图4所见，将由GT启动子表达GFP/TRAIL的表达盒和由TERT启动子表达feil4/ GV16的表达盒一起插入腺病毒El区，构建成载体Ad/gTRAIL(具体的载体图谱见图4和图14。这两个表达盒以头尾方式相连接。从右到左，依次为GT启动子-GFP/TRAIL融合基因-SV40多聚A信号-TERT启动子-GAL4/GV16转录因子基因-牛生长基因多聚A信号)。 用Ad/gTRAIL和Ad/CMV-GFP (对照载体)分别转染(转染剂量为500 2000moi)结肠癌细胞DLDl和正常成纤维细胞(NHFB)，培养M-48小时后观察绿色荧光蛋白(GFP或GFP/ TRAIL)的表达及细胞形态。CMV-GFP在癌细胞和成纤维细胞中均表达，但不引起细胞死亡。 而Ad/gTRAIL仅在癌细胞DLDl得到表现并将细胞杀死，却不在成纤维细胞中表现。实施例5.构建TC嵌合启动子TC嵌合启动子包含人体端粒酶逆转录酶启动子和巨细胞病毒增强子(其具体序列如SEQ ID N0:8所示)。这种嵌合式启动子具有端粒酶逆转录酶启动子的特异性，并且启动子的活性也比野生型的端粒酶逆转录酶启动子要强很多。嵌合启动子包括了相应的端粒酶逆转录酶的起始密码子之前的碱基对(-456到-2(基因库编号僅2192幻)和巨细胞病毒启动子的小片段增强子序列，即人体巨细胞病毒早期蛋白起始密码子的-1017到-901序列(基因库编号M21925)。这种嵌合式启动子被命名为TC启动子(SEQ ID NO :8)。图5 中显示的是质粒结构，其包括了驱使于绿色荧光蛋白表达盒的TC启动子。实施例6.条件复制型腺病毒表达报告基因绿色荧光蛋白(Ad/GFP-El)。绿色荧光蛋白基因和腺病毒El基因均由TC嵌合性启动子(见实施例幻驱使。Ad/GFP-El的构建是将TC-GFP表达盒(表达盒具体的构建见Davis JJet al， 2006)插入到腺病毒El区之前，用TC启动子取代腺病毒El启动子(即将TC启动子序列插入到El基因的上游，图谱见附图15)。用同样剂量(IOOOmoi)的Ad/GFP-El转染成纤维细胞(NHFB)和癌细胞(MiaPaca2(购自ATCC. ORG)，DLDl和HU99，M-48小时后用蛋白印迹法 (Western blot)检测El蛋白的表达(具体方法见Davis JJ et al.，2006)，或在荧光显微镜下观察GFP表达。可见条件复制型腺病毒能在癌细胞里表达绿色荧光蛋白和E1A，但是不能在正常的细胞里表达这些基因，例如不能在正常的纤维原细胞(NHFB)表达这些基因(见图6和图7)。当细胞被载有CMV-GFP的病毒载体(Ad/CMV-GFP，CMV启动子驱动绿色荧光蛋白的表达)感染时，癌细胞(HU99)和正常细胞(NHFB)都表达绿色荧光蛋白。但是，当细胞被Ad/GFP-El感染时，只有H1299细胞表达绿色荧光蛋白。NHFB细胞不表达绿色荧光蛋白(图7)。同样的，当Ad/GFP-El被注入到肿瘤里，只有肿瘤能表达绿色荧光蛋白，而肿瘤周围的正常的组织却不能表达(图7)。实施例7.纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体病毒纤维改进后的条件复制型腺病毒表达报告基因绿色荧光蛋白(Ad/ GFP-E1-RGD)(图 17)。在图8中的条件复制型腺病毒和在图6里的是(见上述实施例6) —样的，但是它的表面纤维蛋白被修改。编码精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列被插入到位于图距单位86-91的腺病毒基因组中，从而使病毒纤维蛋白头部(knob)含有(RGD)序列(见所附腺病毒纤维蛋白基因序列，如SEQID N0:10所显示)。这种腺病毒能感染含低水平的腺病毒受体或不含腺病毒受体的肿瘤细胞。图8就是对照载体(Ad/CMV-GFP)，Ad/GFP-El和Ad/ GFP-El-RGD在肿瘤中的绿色荧光蛋白的表达。先将小鼠纤维肉瘤细胞(UV-2237)接种在小鼠腿部，在其形成肿瘤后(约一周左右)，将相同剂量(5xl09病毒颗粒/小鼠)的Ad/CMV-GFP (对照载体)，Ad/GFP-El和Ad/ GFP-El-RGD注射到肿瘤内，两周后观察GFP在肿瘤和肿瘤周围正常组织中的表达，结果显示，在被Ad/GFP-El-RGD感染的肿瘤里，绿色荧光蛋白比较强。注，周围正常组织没有报告基因能表达。实施例8.在血液样本中检验肿瘤细胞。测试腺病毒能否通过嵌合式的TC启动子表达绿色荧光蛋白被用来检测肿瘤细胞。把100个人体肿瘤细胞(培养的人肺癌细胞HU99)加入到5毫升正常的人体血液样本里。血液样本用低渗氯化铵溶液溶解去除红血细胞。用磷酸盐缓冲液把白血细胞清洗三次，然后用IxlO4病毒颗粒的Ad/GFP-El或Ad/GFP-El-RGD感染细胞(即在0. 5ml培养液中加入IxlO4病毒颗粒，直接加到上述白细胞中，混勻)，在37°C下，将转染后的白细胞和肿瘤细胞在RPMI 1640培养基里培养M小时。在荧光显微镜下观察细胞。没有添加肿瘤细胞的血液样本也用同样量的Ad/GFP-El或Ad/GFP-El-RGD进行培养。结果显示，只有添加了肿瘤细胞的血液样本出现绿细胞(图幻。没有肿瘤细胞的血液样本没有出现任何绿细胞。 这样的结果表明肿瘤特性启动子能用于检验血液样本里肿瘤细胞的报告基因表达。实施例9.癌症患者血样本检测。从一例肺癌患者及一例正常对照取血5毫升，用Ficoll梯度离心方法分离有核细胞后，加10000病毒感染单位的Ad/GFP-El于白细胞中。再将白细胞培养于一 48孔板的培养板(购自Fisher kientific)，每孔一个样品，培养两天后在荧光显微镜下观察。在正常样品中未见绿色荧光蛋白阳性细胞，而在肺癌患者的样品中，一个视野就有几个阳性细胞 (图10)。图10左侧在荧光显微镜下；右侧，与左侧相同视野，但在普通显微镜下。注，荧光蛋白在黑白照中显白色。附录1，所述启动子或基因序列人端粒酶逆转录酶核心启动子序列(SEQ ID NO 1)accctgggagcgcgagcggcgcgcgggcggggaagcgcggcccagacccccgggtccgcccggagcagctgcgctgtcggggccaggccgggctcccagtggattcgcgggcacagacgcccaggaccgcgctccccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccacccccgccLacZ 基因序列(SEQ ID NO 2)atgtcgtttactttgaccaacaagaacgtgattttcgttgccggtctgggaggcattggtctggacaccagcaaggagctgctcaagcgcgatcccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtaacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttaactcggcgtttcatctgtggtgcaacgggcgctgggtcggttacggccaggacagtcgtttgccgtctgaatttgacctgagcgcatttttacgcgccggagaaaaccgcctcgcggtgatggtgctgcgttggagtgacggcagttatctggaagatcaggatatgtggcggatgagcggcattttccgtgacgtctcgttgctgcataaaccgactacacaaatcagcgatttccatgttgccactcgctttaatgatgatttcagccgcgctgtactggaggctgaagttcagatgtgcggcgagttgcgtgactacctacgggtaacagtttctttatggcagggtgaaacgcaggtcgccagcggcaccgcgcctttcggcggtgaaattatcgatgagcgtggtggttatgccgatcgcgtcacactacgtctgaacgtcgaaaacccgaaactgtggagcgccgaaatcccgaatctctatcgtgcggtggttgaactgcacaccgccgacggcacgctgattgaagcagaagcctgcgatgtcggtttccgcgaggtgcggattgaaaatggtctgctgctgctgaacggcaagccgttgctgattcgaggcgttaaccgtcacgagcatcatcctctgcatggtcaggtcatggatgagcagacgatggtgcaggatatcctgctgatgaagcagaacaactttaacgccgtgcgctgttcgcattatccgaaccatccgctgtggtacacgctgtgcgaccgctacggcctgtatgtggtggatgaagccaatattgaaacccacggcatggtgccaatgaatcgtctgaccgatgatccgcgctggctaccggcgatgagcgaacgcgtaacgcgaatggtgcagcgcgatcgtaatcacccgagtgtgatcatctggtcgctggggaatgaatcaggccacggcgctaatcacgacgcgctgtatcgctggatcaaat
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ccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtactcagatatggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggcccaccagctctgagcagatcatgaagacaggggcccttttgcttcagggtttcatccaggatcgagcagggcgaatggggggggaggcacccgagctggccctggacccggtgcctcaggatgcgtccaccaagaagctgagcgagtgtctcaagcgcatcggggacgaactggacagtaacatggagctgcagaggatgattgccgccgtggacacagactccccccgagaggtctttttccgagtggcagctgacatgttttctgacggcaacttcaactggggccgggttgtcgcccttttctactttgccagcaaactggtgctcaaggccctgtgcaccaaggtgccggaactgatcagaaccatcatgggctggacattggacttcctccgggagcggctgttgggctggatccaagaccagggtggttgggacggcctcctctcctactttgggacgcccacgtggcagaccgtgaccatctttgtggcgggagtgctcaccgcctcgctcaccatctggaagaagatgggctgaGFP/TRAIL 基因融合序列(SEQ ID NO 5)atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtactcagatctcgagctcaagcttcgaattcctgcagcccggcgaaggagggccaccatggccatgatggaggtccaggggggacccagcctgggacagacctgcgtgctgatcgtgatcttcacagtgctcctgcagtctctctgtgtggctgtaacttacgtgtactttaccaacgagctgaagcagatgcaggacaagtactccaaaagtggcattgcttgtttcttaaaagaagatgacagttattgggaccccaatgacgaagagagtatgaacagcccctgctggcaagtcaagtggcaactccgtcagctcgttagaaagatgattttgagaacctctgaggaaaccatttctacagttcaagaaaagcaacaaaatatttctcccctagtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggctaagGal4/VP16 融合转录因子序列(SEQ ID NO 6)
AtgaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccggggatcaccgcccccattaccgacgtcagcctgggagacgaactccgcctggacggcgaggaggtggatatgacgcccgccgacgccctggacgacttcgacttggagatgctgggggacgtggagtcccccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggtagGal4/TATA(GT)启动子序列(SEQ ID NO 7)gtcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagactctagagggtatataatTC嵌合启动子序列(划线部份来自CMV启动子，其余来自TERT启动子)(SEQ ID NO 8)accctgggagcgcgagcggcgcgcgggcggggaagcgcggcccagacccccgggtccgcccggagcagctgcgctgtcggggccaggccgggctcccagtggattcgcgggcacagacgcccaggaccgcgctccccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctttaccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagcCctRRccccRRccacccccRccaRatctRatctRtaRRcRtRtaCRRtRRRaRRCCtatataaRCaRaRCtCRtttaRtRaaccRtcaRatcRcctRRaRacRccatccacRctRttttRacctccataRaaRacaccRRRaccRatccaCMV 启动子序列(SEQ ID NO 9)Gcccggttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacggacctgc腺病毒纤维蛋白序列(划线部分为插入序列，含RGD序列)(SEQ ID NO 10)atgaagcgcgcaagaccgtctgaagataccttcaaccccgtgtatccatatgacacggaaaccggtcctccaactgtgccttttcttactcctccctttgtatcccccaatgggtttcaagagagtccccctggggtactctctttgcgcctatccgaacctctagttacctccaatggcatgcttgcgctcaaaatgggcaacggcctctctctggacgaggccggcaaccttacctcccaaaatgtaaccactgtgagcccacctctcaaaaaaaccaagtcaaacataaacctggaaatatctgcacccctcacagttacctcagaagccctaactgtggctgccgccgcacctctaatggtcgcgggcaacacac
tcaccatgcaatcacaggccccgctaaccgtgcacgactccaaacttagcattgccacccaaggacccctcacagtgtcagaaggaaagctagccctgcaaacatcaggccccctcaccaccaccgatagcagtacccttactatcactgcctcaccccctctaactactgccactggtagcttgggcattgacttgaaagagcccatttatacacaaaatggaaaactaggactaaagtacggggctcctttgcatgtaacagacgacctaaacactttgaccgtagcaactggtccaggtgtgactattaataatacttccttgcaaactaaagttactggagccttgggttttgattcacaaggcaatatgcaacttaatgtagcaggaggactaaggattgattctcaaaacagacgccttatacttgatgttagttatccgtttgatgctcaaaaccaactaaatctaagactaggacagggccctctttttataaactcagcccacaacttggatattaactacaacaaaggcctttacttgtttacagcttcaaacaattccaaaaagcttgaggttaacctaagcactgccaaggggttgatgtttgacgctacagccatagccattaatgcaggagatgggcttgaatttggttcacctaatgcaccaaacacaaatcccctcaaaacaaaaattggccatggcctagaatttgattcaaacaaggctatggttcctaaactaggaactggccttagttttgacagcacaggtgccattacagtaggaaacaaaaataatgataagctaactttgtggaccacaccagctccatctcctaactgtagactaaatgcagagaaagatgctaaactcactttggtcttaacaaaatgtggcagtcaaatacttgctacagtttcagttttggctgttaaaggcagtttggctccaatatctggaacagttcaaagtgctcatcttattataagatttgacgaaaatggagtgctactaaacaattccttcctggacccagaatattggaactttagaaatggagatcttactgaaggcacagcctatacaaacgctgttggatttatgcctaacctatcagcttatccaaaatctcacggtaaaactgccaaaagtaacattgtcagtcaagtttacttaaacggagacaaaactaaacctgtaacactaaccattacactaaacggtacacaggaaacaggagacacaacttgtgactgccgcggagactgtttctgcccaagtgcatactctatgtcattttcatgggactggtctggccacaactacattaatgaaatatttgccacctcgagttacactttttcata cattgcccaagaataagTRE sequence(SEQ ID NO :11)TttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagctcggtacccgggtcgagtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctTetR sequence (SEQ ID NO 12)atgtctagattagataaaagtaaagtgattaacagcgcattagagctgcttaatgaggtcggaatcgaaggtttaacaacccgtaaactcgcccagaagctaggtgtagagcagcctacattgtattggcatgtaaaaaataagcgggctttgctcgacgccttagccattgagatgttagataggcaccatactcacttttgccctttagaaggggaaagctggcaagattttttacgtaataacgctaaaagttttagatgtgctttactaagtcatcgcgatggagcaaaagtacatttaggtacacggcctacagaaaaacagtatgaaactctcgaaaatcaattagcctttttatgccaacaaggtttttcactagagaatgcattatatgcactcagcgctgtggggcattttactttaggttgcgtattggaagatcaagagcatcaagtcgctaaagaagaaagggaaacacctactactgatagtatgccgccattattacgacaagctatcgaattatttgatcaccaaggtgcagagccagccttcttattcggccttgaattgatcatatgcggattagaaaaacaacttaaatgtgaaagtgggtccgcgtacagccgcgcgcgtacgaaaaacaattacgggtctaccatcgagggcctgctcgatctcccggacgacgacgcccccgaagaggcggggctggcggctccgcgcctgtcctttctccccgcgggacacacgcgcagactgtcgacggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggc
gatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggtag参考文献Blackburn，Ε. H. (1992). Telomerases. Annual Review of Biochemistry 61， 113-129.Butler, T. P. and Gullino, P.M. (1975). Quantitation of cell shedding into efferentblood of mammary adenocarcinoma. Cancer Res. 35,512-516.Chang，Y. S.，di Tomaso, Ε.，McDonald，D. Μ.，Jones，R.，Jain, R. K.，andMunn， LL (2000). Mosaic blood vessels in tumors :frequency of cancercells in contact with flowing blood. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97，14608—14613.Counter，C. M.，Avilion，A. A.，LeFeu vre , C. E.，Stewart, N. G.， Greider, C. W.，Harley, C. B.，and Bacchetti, S. (1992). Telomere shortening associated withchromosome instability is arrested in immortal cells which expresstelomerase activity. EMBO Journal 11，1921—1929·Davis, J. J.，Wang, L，Dong，F.，Zhang，L，Guo, W.，Teraishi，F.，Xu, K.，Ji，L， andFang，B. (2006). 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权利要求
1.一种肿瘤特异性启动子，其在肿瘤细胞中的活性比其在正常细胞中的活性要高。
2.权利要求1的肿瘤特异性启动子，其包括人端粒酶逆转录酶启动子，survivin启动子，medkine启动子，癌胚抗原启动子，MUC-I启动子和probasin基因启动子。
3.权利要求1的肿瘤特异性启动子，其可以是组织或者细胞型特异性基因的原启动子，也可以是经改造的组合启动子，例如含有源自组织或细胞型特异性启动子的序列和源自其他启动子的增强子的嵌合型启动子。
4.权利要求3的肿瘤特异性启动子，其中所述肿瘤特异性启动子是改造的人端粒酶逆转录酶启动子，其含有人端粒酶逆转录酶启动子序列以及源自CMV启动子的增强子序列。
5.权利要求4的肿瘤特异性启动子，所述启动子序列如SEQID N0:8所示。
6.一种载体，其是包括由权利要求1-5任一项的肿瘤特异性启动子驱使表达的报告基因的基因表达载体。
7.权利要求6的载体，其中提及的报告基因是一种通常作为启动子活性指示剂的基因。
8.权利要求7的载体，其中所述报告基因包括荧光蛋白(绿色，红色，黄色和蓝色荧光蛋白)的基因，萤火虫荧光素酶基因，海肾荧光素酶基因，细菌半乳糖苷酶(LacZ)基因。
9.权利要求7的载体，其中所述基因表达载体指任何一种用于基因转染的载体。
10.权利要求7的载体，其中所述基因表达载体包括质粒，质粒/脂质复合物以及病毒载体。
11.权利要求10的载体，其中提及的病毒载体是指复制缺陷型病毒载体和可复制型病毒载体，例如腺病毒载体，可复制型腺病毒载体，疱疹病毒载体，牛痘病毒载体等。
12.权利要求11的载体，其中所述病毒载体是经过病毒纤维改进后的。
13.权利要求12的载体，其中所述病毒纤维改进是通过将编码精氨酸-甘油酸-天冬氨酸(RGD)编码序列插入到位于图距单位86-91的腺病毒基因组中，从而使病毒纤维蛋白含RGD序列，改变其受体特异性，改进后的载体可经整合素蛋白(integrin)进入靶细胞。
14.权利要求7的载体，其中组织或肿瘤特异性启动子的活性通过二元表达系统来加强。
15.权利要求7的载体，其中提及的基因表达载体包括可复制型腺病毒载体Ad/El-GFP 和 Ad/El-GFP-RGD，复制缺陷型腺病毒载体 Ad/TERT_GFP，Ad/TERT-LacZ, Ad/GFP-TRAIL 和 Ad/TERT-Luciferase.。
16.一种试剂盒，其包含权利要求1-5任一项的肿瘤特异性启动子和/或权利要求 6-15任一项的载体，用于癌症患者的早期诊断，治疗反应的预测及其预后。
17.权利要求16的试剂盒，其用于检测血标本和骨髓标本中的肿瘤细胞。
18.—种诊断剂，其包含权利要求1-5任一项的肿瘤特异性启动子和/或权利要求 6-15任一项的载体，用于癌症患者的早期诊断，治疗反应的预测及其预后。
19.权利要求18的诊断剂，其用于检测血标本和骨髓标本中的肿瘤细胞。
20.权利要求1-6中任一项的肿瘤特异性启动子用于制备权利要求7-15任一项的载体以及权利要求16-17任一项的试剂盒和权利要求18-19任一项的诊断剂的应用。
全文摘要
本发明提供用于检测循环血样本和骨髓样本中肿瘤细胞的方法与试剂，即应用肿瘤特异性启动子驱使报告基因表达，来检测血样本和骨髓样本中的肿瘤细胞。肿瘤特异性启动子，如人端粒酶逆转录酶启动子(TERT)，在大多数肿瘤细胞中有很高的活性，但是在正常细胞中没有活性。用含有肿瘤特异性启动子驱使的报告基因表达盒的基因载体，例如腺病毒载体，转染血样本或骨髓样本中的有核细胞，然后检测样本中是否存在报告基因高表达的细胞，从而确认样本中是否存在肿瘤细胞。本发明提供包含所述启动子，报告基因和载体的诊断试剂盒，可用于癌症患者的早期诊断及治疗反应的预测。
文档编号C12Q1/02GK102191245SQ20101013175
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月15日 优先权日2010年3月15日
发明者方效良 申请人:浙江东方基因生物制品有限公司