一种重组酵母菌及其制备方法

专利名称：一种重组酵母菌及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种重组酵母菌及其制备方法。
背景技术：
乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis),早期命名为乳酸酵母 (Saccharomyceslactis)和乳酸克鲁维酵母(K. lactis van der Walt)，1984 年 归为Kluyveromycesmarxianus var. lactis,属于克鲁维酵母属，简称乳酸克鲁 维酵母(Kluyveromyceslactis，K. lactis)。该酵母表达系统同巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris, P. pastoris)、汉逊酵母(Hansenula polymorpha)以及酉良酒酵母 (S. cerevisiae)表达系统并称为“酵母四大表达系统”，具有易培养、成本低廉、繁殖快、便 于大规模培养和高密度发酵等特性。作为一种应用广泛的外源基因表达系统，K. Iactis除具有上述酵母表达系统共有 特点外，还具有以下优势1)、K. lactis表达系统安全可靠，例如由K. lactis制备的乳糖酶 和凝乳酶已被美国FDA批准可用于食品医药工业；2)、K. lactis遗传背景非常清楚，全基因 组测序已完成，并公开使用。3)、培养基成分简单，成本低廉，易放大，具备良好的工业发酵 规模特性，例如用K. Iactis在生产凝乳酶的工业发酵规模已超过100m3。4)、不需要使用甲 醇等危险物诱导，医药、食品和工业生产用更安全。5)、具有良好的分泌能力，外源蛋白表达 水平高，人血清白蛋白表达水平达3. 3g/L。乳酸克鲁维酵母能够以乳酸作为唯一碳源，长 期以来一直被用于生产乳糖酶、单细胞蛋白等发酵工业。遗传学研究表明许多不同的筛选 标记均可以在该酵母中很好的应用，例如酿酒酵母TRP1，LEU2，URA3等缺陷型筛选标记基 因，抗性筛选标记KanMX (抗G418)、Ble筛选标记(抗博来霉素)和其它氮源选择方法。另 夕卜，乳酸克鲁维酵母的转化方法也从最初的PEG介导的原生质体法发展至LiAc法和电转化 法。基于近些年的研究，乳酸克鲁维酵母表达系统日渐成熟，其中针对于乳酸克鲁维 酵母的载体-宿主系统，有附加型载体和整合型载体。这两类载体均被直接用于外源基因 的表达。二者各具其特点附加型载体在宿主体内能产生较高的拷贝数，但是不稳定，容易 丢失；整合型载体因其能整合到宿主基因组中可以产生稳定的转化子，但是其拷贝数较低， 表达量相对较低。研究表明使用乳酸克鲁维酵母本身的启动子或者来自酿酒酵母的启动子 都可以很好的启动外源基因的表达。目前乳酸克鲁维酵母表达系统利用较多的主要是酿酒 酵母中的一些组成型和诱导型强启动子，例如磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，酸性磷酸酯 酶(PH05)启动和3-磷酸甘油醛(GAP)启动子等。然而这些启动子有一个不足之处就是外 源启动子的启动效率在乳酸克鲁维酵母中不能严格调控。食品级重组酵母菌的定义在酵母宿主菌已经被批准可以应用于食品医药工业的 基础上，外源基因重组到酵母基因组后，无抗性基因存在，仅仅是外源基因表达盒重组到基 因组中，重组菌安全可靠，无毒无害，可以直接应用于食品和医药工业。为了更好的发展和应用乳酸克鲁维酵母宿主系统，避免在重组乳酸克鲁维酵母宿主构建过程中过多的引入外源组件基因和抗性筛选标记基因，建立适用于该酵母的多尺度 多方位载体表达系统、基因敲除和筛选标记挽救系统以及高效转化系统是非常必要的。针对上述技术问题，本发明应用乳酸克鲁维酵母宿主表达系统结合基因敲除和筛 选标记挽救技术成功构建了没有携带任何筛选标记抗性基因且稳定表达外源基因的乳酸 克鲁维酵母食品级表达菌株。具体是在表达载体中引入两个IoxP位点，利用Cre重组酶附 加型表达载体为介导敲除两个IoxP位点间基因序列，最后传代丢失Cre重组酶附加型表达 载体，从而使最后得到的工程菌中无任何抗性筛选标记基因。
此外，为了进一步提高外源基因在宿主体内的表达产量，需要提高表达载体在宿 主体内的整合拷贝数。本发明在整合型表达载体中引入乳酸克鲁维酵母宿主菌的ISSrDNA 部分序列。由于酵母细胞基因组中的18S rDNA基因拷贝数大约有150-200个，因此通过线 性化表达载体中的18S rDNA部分序列，就可以利用载体中的18S rDNA部分序列作为介质 携带的表达载体的外源基因表达盒在宿主细胞内的18S rDNA基因中发生有效的多次同源 重组，从而实现表达载体在乳酸克鲁维酵母宿主菌高拷贝整合，进一步提高其外源蛋白的 表达量。解决了目前应用于酵母菌中的整合型载体的拷贝数低的问题，而且提高了转化效 率。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种可表达外源基因的食品级重组酵母菌构建方法。本发明所提供的制备重组酵母菌的方法，包括如下步骤(1)将表达载体I转入宿主酵母菌中，得到转入所述表达载体I的重组酵母菌，记 作酵母菌A ；(2)将表达载体II转入所述酵母菌A中，得到转入所述表达载体I和所述表达载 体II的重组酵母菌；将所述转入所述表达载体I和所述表达载体II的重组酵母菌记作酵 母菌B;(3)诱导所述酵母菌B中的所述表达载体II中的Cre重组酶表达，所述Cre重组 酶将所述酵母菌B中的所述载体I中的抗性基因切除，抗性筛选，得到含有所述外源基因和 所述表达载体II、但不含有所述表达载体I中的抗性基因的重组酵母菌；将所述含有所述 外源基因和所述表达载体II、但不含有所述表达载体I中的抗性基因的重组酵母菌记作酵 母菌C;(4)传代培养所述酵母菌C，至所述酵母菌C中的所述表达载体II丢失，抗性筛 选，得到含有所述外源基因但不含有所述表达载体I中抗性基因也不含有所述表达载体II 的重组酵母菌，即为目的重组酵母菌；所述表达载体I包括如下元件1οχΡ位点序列Ι、1οχΡ位点序列II、所述宿主酵母 菌的18S rDNA序列、外源基因表达盒、抗性筛选标记基因表达盒和原核复制起点序列，所述 抗性筛选标记基因表达盒和所述原核复制起点序列在所述IoxP位点序列I和所述IoxP位 点序列II之间；所述IoxP位点序列I和所述IoxP位点序列II在所述表达载体I中为正 向重复序列；所述表达载体II是将所述宿主酵母菌的自我复制序列插入载体PSH65的多克隆 位点得到的；所述载体PSH65中含有Cre重组酶表达盒。
上述过程中，所述表达载体I为由如下元件顺次连接组成的环状载体所述loxP 位点序列I、所述宿主酵母菌的18S rDNA序列、所述外源基因表达盒、所述loxP位点序列 II、所述抗性筛选标记基因表达盒和所述原核复制起点序列；和/或，所述表达载体II是将所述宿主酵母菌的自我复制序列插入载体PSH65的 Bglll位点得到的。上述过程中，所述外源基因表达盒由组成型3-磷酸甘油醛启动子、外源基因、蛋 白纯化标签编码基因和A0X1终止子组成，所述抗性筛选标记基因表达盒由TEFlp启动子、 EM7p启动子、新霉素抗性基因、CYC1终止子组成，所述原核复制起点序列为PUC-Ori ；所述 表达载体I中，所述蛋白纯化标签为myc标签和/或组氨酸标签；和/或，所述表达载体II中，所述宿主酵母菌的自我复制序列如序列表中序列3 所示。上述过程中，所述表达载体I是按照如下方法得到的1)向载体pGAPGA中的外源基因表达盒的两端外侧插入所述loxP位点序列，在距 离所述外源基因表达盒中启动子近的一侧插入loxP位点序列I，在距离所述外源基因表达 盒中启动子远的一侧插入loxP位点序列II，将得到的重组载体记作重组载体A ；2)在所述重组载体A的所述loxP位点序列I与所述外源基因表达盒中启动子之 间插入所述宿主酵母菌的18S rDNA序列，将得到的重组载体记作重组载体B;3)向所述重组载体B中的外源基因表达盒中的多克隆位点插入外源基因，得到所 述载体I。和/或，所述载体II是按照如下方法得到的用限制性内切酶Bglll酶切载体 PSH65，并用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow大片段削平3 ‘突出端，再与序列表中序列3所示 基因连接，得到所述载体II。上述过程中，所述步骤1)是通过如下操作实现的以所述载体pGAPGA作为模板， 用序列表中序列5所示DNA和序列表中序列6所示DNA作为引物对，PCR扩增，得到PCR产 物，将所述PCR产物插入所述载体pGAPGA的Bglll和BamHI酶切位点间，得到的重组载体 即为所述重组载体A ；上述过程中，所述步骤2)是通过如下操作实现的将所述宿主酵母菌的18S rDNA 序列插入所述重组载体A中所述loxP位点序列I与所述外源基因表达盒中启动子之间的 Bglll酶切位点处，得到的重组载体即为所述重组载体B。上述过程中，所述宿主酵母菌为乳酸克鲁维酵母菌；和，所述表达载体I中，所述 宿主酵母菌的18S rDNA序列如序列表中序列2所示，所述loxP位点序列I和所述loxP位 点序列II均如序列表中序列4所示。上述过程中，所述乳酸克鲁维酵母菌为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis) AS2. 1494。由上述任一所述方法获得的重组酵母也属于本发明的保护范围。上述载体系统中，所述酵母表达载体I为应用于乳酸克鲁维酵母的整合型外源基 因表达载体。表达载体I为双链环状DNA。载体I中各个元件的作用如下(1)大肠杆菌PUC载体原核复制起点Ori序列，其 作用可以使该载体能够在大肠杆菌中自我复制，并以游离态形式存在与大肠杆菌中(记作PUC-Ori) ； (2)所述loxP位点序列I和所述loxP位点序列II，其作用是Cre重组酶的识别 位点，在Cre重组酶的作用下，导致两个loxP位点间重组，重组的结果是导致两个loxP位 点间(包括一个loxP位点在内)的基因片段丢失，在此处只留下一个loxP位点；(3)外源 基因表达盒，其作用是为了方便的构建外源基因表达盒，该表达盒具有一个强的组成型GAP 启动子，在该启动子的作用下外源蛋白能够在宿主酵母中持续高效表达。同时在GAP启动 子和A0X1终止子之间包括多个用于分子克隆操作的DNA限制性酶切位点序列，如EcoRI、 SacI、Sail, Xball和NotI等，可以方便的将外源基因插入到该表达盒中，构建表达载体转 化宿主酵母进行外源蛋白的表达。(4)宿主酵母的18S rDNA基因片段，其作用是以18S rDNA基因片段作为中间介质，可以通过该介质有效的携带载体基因同源重组整合到宿主酵 母菌染色体的18S rDNA基因上。由于乳酸克鲁维宿主酵母的18S rDNA基因具有150-200 个拷贝，因此在该介质的作用下，可以实现表达载体多拷贝重组到宿主基因组中，大大提高 外源蛋白在宿主菌中的表达产量。(5)新霉素抗性筛选标记基因表达盒，其作用是作为一种 筛选标记能够同时在大肠和酵母中使用。该新霉素抗性基因(neo)在TEF (原核)和EM(真 核)两个启动子下，在大肠杆菌中，TEF启动子启动该基因表达可以赋予大肠杆菌重组克隆 抗卡那霉素能力。同时，在真核酵母中EM启动子启动该基因表达可以赋予重组酵母菌抗 G418抗生素能力。(6)所述表达载体I中的loxP位点处的酶切位点处(Bglll和BamHI) 可以插入其它元件(例如缺陷型筛选标记Leu2，Ura3等)。上述载体系统中，所述酵母Cre重组酶表达载体II说明如下Cre重组酶表达载 体II为应用于乳酸克鲁维酵母的附加型Cre重组酶表达载体。该载体为双链环状DNA。其 主要包括以下几个元件(1)氨苄青霉素抗性基因表达盒(AmpR)，该质粒转入大肠杆菌中 可以赋予重组大肠杆菌抗氨苄青霉素的能力；(2)原核复制起点PUC-Ori，其作用可以使该 载体能够在大肠杆菌中自我复制，并以游离态形式存在与大肠杆菌中(记作PUC-Ori) ； (3) Cre重组酶基因表达盒(包括Gall启动子、Cre重组酶基因、CYC1终止子)，其作用是在培 养基的碳源从葡萄糖改变为乳糖的情况下，可以低水平诱导Cre重组酶表达，从而执行对 两个loxP位点中间的基因进行重组，该酶作用后的结果会导致两个loxP位点中间的基因 (包括一个loxP位点在内)丢失，在该酵母基因组该基因处仅留下一个loxP位点；(4)博 来霉素抗性筛选标记基因(Ble基因)表达盒(包括TEF和EM启动子、Ble基因、TEF终 止子)，其作用是作为一种筛选标记能够同时在大肠和酵母中使用。该博来霉素抗性基因 (Ble)在TEF(原核)和EM(真核)两个启动子下，在大肠杆菌中，TEF和FM启动子启动该 基因表达可以赋予大肠杆菌和酵母重组克隆抗Zeocin抗生素能力；(5)乳酸克鲁维酵母自 我复制序列(ARS)，其作用是能够在乳酸克鲁维酵母宿主中自我复制，可以使质粒以游离态 形式存在于乳酸克鲁维酵母宿主中；(6)已经突变失活的Ura3表达盒(使用Ncol酶切后， 使用Pfu酶补平然后连接导致其Ura3表达盒失活)。上述过程中，所述宿主酵母菌为乳酸克鲁维酵母菌。该酵母 (Kluyveromyceslactis)是一种能够以乳酸作为其唯一的碳源和能源的酵母，具有营养要 求极其简单、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广(25-46°C )、分泌蛋白能力强，和对 人类安全(GRAS)等优点，长期以来一直被用于生产乳糖酶、单细胞蛋白等发酵工业。实验证明，用本发明方法制备得到的乳酸克鲁维酵母菌不携带任何抗性筛选标记 基因，其表达载体的外源基因表达盒稳定整合在该宿主菌基因组内的拷贝数可达5 50
7个。用本发明的制备的重组乳酸克鲁维酵母菌表达的外源基因蛋白产品可以直接破碎后作 为饲料和食品添加剂使用，安全可靠。本发明制备方法操作简单、省时省力、成本低廉。因 此，本发明的重组酵母菌及其制备方法适于推广使用。


图1为表达载体pKGAPGA结构示意图。图2为表达载体pKGAPGA-18S结构示意图。图3为表达载体KL-Cre结构示意图。图4为表达载体pKGAPGA-Amy_18S结构示意图。图5为实施例中的表达载体重组克隆经过碘熏蒸后在YPD-S固体平皿培养基上的 结果其中A为乳酸克鲁维酵母表达载体II构建的淀粉酶表达载体pKGAPGA-Amy-18S重组 乳酸克鲁维酵母得到的重组克隆经过碘熏蒸后在YPD-S(含淀粉)固体培养基平皿上的结 果。B为乳酸克鲁维酵母表达载体II空载体转化乳酸克鲁维酵母得到的重组克隆经过碘熏 蒸后在YPD-S (含淀粉)固体培养基平皿上的结果(对照)。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、重组酵母菌的构建一、表达载体 pKGAPGA-amy_18S 的构建( 一 )载体 pGAPGA 的构建构建方法如文献(Houhui Song, Yong Li, ffeihuan Fang, Yunfeng Geng, Xu Wang, Min Wang, Bingsheng Qiu. Development of a set ofexpression vectors in Hansenula polymorpha. Biotechnology Letters,2003, 25(23) : 1999-2006.)所述。(中国科学院微生物研究所)( 二 )载体 pKGAPGA 的构建为了能够实现利用loxP位点和Cre重组酶系统敲除载体pGAPGA上的抗性筛选标 记基因序列，设计了一对引物loxP-F和loxP-R，引物的核苷酸序列如下loxP-F 5，-GataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatAGATCTAGGAAAAGGTGACAACTCGCAAAGT -3’(序列表中序列5)loxP-R 5，-TataactcgtataatgtatgctatacgaagttatGGATCCGCACAAACGAAGGTCTCACTTAATC-3’(序列表中序列6) 方法使用载体pGAPGA作为模板，使用引物loxP_F和loxP-R进行PCR扩增，得 到两端带有两个loxP位点的外源基因表达盒[表达盒由组成型3-磷酸甘油醛启动子、多 克隆位点、纯化标签(myc epitope和6XHis_tag)和A0X1终止子组成]。PCR体系体积 50 yl，引物各2 ill (浓度20 ii M)，模板1 iil，pfu酶1 ill (购于天根生化生物公司)，pfu 酶10X缓冲液5iil，dNTP 4iU，其余用双蒸水补足至50iU。PCR扩增程序为95°C 3min ； 94°C lmin，56°C 45sec，72°C，2min，30个循环；再72°C延伸10min，PCR产物使用琼脂糖凝胶
8回收试剂盒(购于TAKARA公司)进行回收。将回收的基因片段与载体片段(使用限制性内切酶Bgglll和BamHI酶切载体 pGAPGA，回收DNA大片段然后利用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow大片段补平得到载体片段) 使用T4连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 a，得到的克隆提取质粒，酶切方法 进行验证。验证如下使用Bglll、BamHI进行单独酶切和Bglll+BamHI双酶切，其结果是 Bglll、BamHI进行单独酶切得到3. 7Kb的DNA片段，Bglll+BamHI双酶切可以得到1Kb和 2. 7Kb的两条片段，表明构建的载体正确，将阳性质粒命名为pKGAPGA，见图1。loxP序列如 序列表中序列4所示。(三)载体 pKGAPGA-ISS 的构建乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)AS 2. 1494(CGMCC 2. 1494)购自中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。载体pMD18T-18S的构建根据Genebank :AF543841中提交的乳酸克鲁维酵母的 18SrDNA序列设计引物18S-F和18S-R，并在引物的两端弓丨入酶切位点BglII/BamHI，其引物 的序列如下18S-F :5，-gcagatctctggttgatcctgccagtagtc-3，18S-R :5，-gcggatcctaatgatccttccgcaggttc-3，以乳酸克鲁维酵母AS2. 1494基因组DNA为模板，用引物18S-F和18S-R进行PCR 扩增。扩增程序为 94°C 5min，94°C lmin，56°C 45sec，72°C，lmin，30 个循环后再 72°C延伸 lOmin。PCR扩增结果得到5 ‘端带有Bglll酶切位点和3’端带有BamHI酶切位点的1. 7kb 大小的18S rDNA部分基因片段。1 %琼脂糖凝胶电泳，割胶回收目的片段，溶于50 yl灭菌 dd H20中，得到纯化的18S rDNA片断。回收后与pMD18-T载体连接，挑取阳性克隆，提取质粒 并测序，测得的序列见序列表中序列2，表明构建的质粒正确，将含有18S rDNA的pMD18_T 载体命名为pMD18T-18S。用限制性内切酶Bglll和BamHI酶切pMD18T_18S，割胶回收1. 8kb 18S rDNA片 段，得到的目的18S rDNA片段与Bglll单酶切并且进行脱磷酸化处理的表达载体pKGAPGA 进行连接，连接产物转化大肠杆菌，氨苄抗性(AmpR)筛选阳性克隆，再用引物18S-F和 18S-R进行PCR鉴定，从阳性克隆中提取阳性质粒，并测序验证，结果得到ISSrDNA插入序列 及方向均正确的阳性质粒，将该质粒命名为PKGAPGA-18S。载体pKGAPGA-18S的结构如图2 所示。(四)载体 pKGAPGA-Amy-lSS 的构建质粒pUC19-aCid-amy(王海燕，秦浚川，王敖全，唐国敏等，中国科学院微生物研 究所，黑曲霉酸性a“淀粉酶基因和糖化酶基因对工业酒精酵母的整合及其共表达，中 国生微生物学报，2004年第44卷第四期)(中国科学院微生物研究所)，根据文献报道 的黑曲霉酸性a “淀粉酶基因，设计引物Amy-F和Amy-R进行PCR扩增，所用的模版为 pUC19-aCid-amy，所用引物的核苷酸序列如下Amy-F 5' -ATAAGAATGCGGCCGCGGatgagattatcgacttcgag-3'Amy-R :5，-GCTCTAGAacagtaaccgaccactcc-3'扩增程序为94°C 5min ；94°C lmin，55°C 45sec，72°C，2min，30 个循环；再 72°C延伸 lOmin。得到的PCR产物进行测序，核苷酸序列如序列表中序列1所示。自序列1的5'末
9端起第11-1528位核苷酸为黑曲霉酸性α-淀粉酶的编码基因，自序列1的5'末端起第 1-8位核苷酸为NotI酶识别位点，自序列1的5'末端起第1529-1534位核苷酸为XbaI酶 识别位点。将PCR扩增产物用NotI和XbaI酶切后，插入载体pKGAPGA_18S的NotI和XbaI 酶识别位点之间，获得重组载体，将该载体命名为pKGAPGA-Amy-18S(图4)。二、Cre重组酶表达载体KL-Cre的构建由于所有宿主为乳酸克鲁维酵母野生菌株，为了避免引入抗性筛选标记基因和其 它外源基因，而且能够很好的多次利用有限的抗性筛选标记，必须对筛选标记进行挽救和 重复利用。因此，依据Cre/loxP系统技术成功构建了在乳酸克鲁维酵母中能够进行基因敲 除和标记挽救的载体KL-Cre和相应的带有IoxP组件的上述表达载体。以下实验是为了在pSH65载体中插入乳酸克鲁维酵母的自我复制序列(ARS)。载体 pSH65 购自 Euroscarf (Frankfurt，Germany ；http://www.uni_frankfurt.de/fbl5/mikro/euroscarf)(见 Giildener, U.， Heck, S.，Fiedler，Τ.，Beinhauer, J.，and Hegemann, J. H. A new efficient gene disruptioncassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Research， 1996,24 :2519-2524.)，产品目录号为 P30121 ；载体KL-Cre的构建过程如下从NCBI数据库查询并下载乳酸克鲁维酵母相关ARS序列信息。根 据文献(Fabiani , L. Aragona, M. Frontal i , L. Isolation and sequenceanalysis of a K. Iactis chromosomal DNA element able to autonomously r印licatein S. cerevisiae and K. lactis)设计引物 ARS-F 和 ARS-R，其序列如下ARS-F (5，-CACTGAGACAAAGTTGATTAAGCC-3，)ARS-R (5，-TAAACGTTGTTGAAGCATCGAAAC-3，)使用引物对ARS-F和ARS-R，以乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis) AS2. 1494 (CGMCC)基因组基因为模板，进行PCR扩增。PCR体系体积50 μ 1，引物各2 μ 1 (浓 度20 μ Μ)，模板1 μ 1，Pfu酶1 μ 1 (购于天根生化生物公司)，pfu酶10 X缓冲液5 μ 1，dNTP 4μ 1，其余用双蒸水补足至 50μ 1。PCR 扩增程序为 95°C3min ； 94 °C lmin，56°C 45sec，72°C， 2min, 30个循环；再72°C延伸lOmin。1 %琼脂糖凝胶电泳，割胶回收目的片段，溶于50 μ 1 灭菌dd H2O中，纯化获得乳酸克鲁维酵母的ARS基因片断。用限制性内切酶BglII酶切载体pSH65，并用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow大片段 削平3'突出端，再与上述PCR回收产物(即ARS基因片断)连接，连接产物转化大肠杆菌， 氨苄抗性(AmpR)筛选阳性克隆，提取质粒，进行测序以验证重组子，获得的序列如序列表 中序列3所示，表明得到的重组载体中ARS基因的序列和插入方向均正确，将阳性重组载体 命名为KL-Cre (图3)。三、重组菌的构建(一)含有pKGAPGA-amy-18S的乳酸克鲁维酵母的构建YPD琼脂培养基由蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、琼脂粉和水组成，其中各个组成成份 在YPD琼脂培养基中的浓度分别为蛋白胨为20g/L，酵母粉为10g/L，葡萄糖为20g/L，琼 脂粉为15g/L,自然pH。
孵育缓冲液由Tris-HCl、DTT、酵母提取物和蛋白胨组成，其中各个组成成份在 孵育缓冲液中的浓度分别为DTT为25mM，酵母提取物为10g/L，蛋白胨为20g/L ；Tris为 20mM,用HCl调节pH值为8. 0。EB缓冲液由蔗糖、MgCl2和Tris组成，其中各个组成成份在EB缓冲液中的浓度 分别为蔗糖为 270mmol/L, MgCl2 为 lmmol/L ；Tris 为 IOmmol/L ；用 HCl 调节 pH 值为 7. 2。YPDTM 由酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、MgCL2和水组成，其中各个组成成份在YPDTM中的浓度分别为酵母提取物为10g/L，蛋白胨为20g/L，葡萄糖为10g/L，MgCL2为 lmmol/L,自然 pH。含有G418抗生素的YPDS 由酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、G418抗生素和 水组成，其中各个组成成份在含有G418抗生素的YPDS中的浓度分别为酵母粉为10g/l， 葡萄糖为20g/l，蛋白胨为20g/l，可溶性淀粉为10g/l，G418抗生素为lOOug/ml。YPDS 由酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉和水组成，其中各个组成成份在 YPDS中的浓度分别为酵母粉为10g/L，葡萄糖为20g/L，蛋白胨为20g/L，可溶性淀粉为 10g/L。感受态细胞制备1)从斜面培养基上挑取乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis) AS2. 1494 (CGMCC) YPD平板上，30°C温箱中培养2天，得到乳酸克鲁维酵母单克隆菌落。2)取乳酸克鲁维酵母单克隆到装有5ml YPD液体培养基的试管中，30°C，250rpm 摇床过夜培养。3)将培养过夜的乳酸克鲁维酵母按照10%的接种量接入到装有50mlYPD液体培 养基的250ml三角瓶中，30°C，250rpm摇床培养，培养到OD6tltl = 1. 2。4)4°C，5000rpm离心收集菌体，用孵育缓冲液洗涤酵母细胞2次，将菌体悬浮在孵 育缓冲液中。5)将其放入30°C，250rpm摇床上孵育30分钟，4°C，5000rpm离心10分钟，用灭菌 的EB缓冲液悬浮菌体，洗涤两次。离心收集菌体，最后用ImlEB缓冲液悬浮菌体，100μ 1每 管分装，-80°C保存备用。转化方法6)将线性化好的载体pKGAPGA-amy_18S DNA和100 μ 1的感受态细胞混合后倒入 0.2em 电击杯中(The Bio-Rad Gene Pulser and Pulse ControUer devices)，并在冰上冰 浴10分钟。载体pKGAPGA-amy-18S的线性化用限制性内切酶BglII进行酶切。7)电击参数为1. Okv, 400 Ω，25 μ F，电击后迅速加入Iml预先冰浴的YPD培养基， 充分混勻后转移到1. 5ml灭菌离心管中，30°C，200rpm，摇床培养lh。8)取IOOul涂于含有G418抗生素(终浓度100ug/ml)的YPDS平板，30°C培养2-3 天，在平板上出现菌落。9)用碘蒸汽熏染平板。以转入载体 PKGAPGA-18S 的乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis) AS2. 1494 为对照。碘蒸汽熏染结果见图5，携带淀粉酶表达载体pKGAPGA-amy-18S乳酸克鲁维重组酵 母克隆子的YPDS平板上产生大小不相同的透明水解圈，携带载体PKGAPGA-18S的乳酸克鲁 维重组酵母(Kluyveromyces lactis)AS2. 1494照YPDS平板上未出现透明水解圈。
分别提取能够在YPDS平板上产生透明圈的重组酵母克隆的基因组DNA和对照菌 基因组DNA，分别利用PCR方法再次检测黑曲霉酸性α _淀粉酶基因是否存在于宿主基因 组中，引物为 Amy-F 和 Amy-R。PCR 的反应程序为-MV 5min ；94°C lmin，56°C 45sec，72°C， lmin，30个循环；再72°C延伸lOmin。PCR扩增结果表明，产生透明水解圈的菌落的基因组 DNA中都能扩增出1. 6kb的片段。将扩增1. 6kb的片段进行测序，测序表明基因序列正确，表 明筛选得到的阳性重组克隆正确。游离的基因片段不会游离存在酵母细胞内，只有片段整 合到基因组中才可以存在，所以该试验证明黑曲霉酸性α-淀粉酶基因正确整合到宿主酵 母基因组中。将黑曲霉酸性α -淀粉酶基因正确整合的重组菌记作AS2/pKGAPGA-amy-18S。使用孵育缓冲液洗涤酵母细胞能够明显提高其转化效率，孵育缓冲液中DTT的浓 度为25mM为最佳；转化效率为IX IO6-I X IO7Cfu/μ g DNA，转化效率的计算方法为确定感 受态细胞的转化效率，可将一定量的完整质粒转化到感受态细胞中，取一部分转化的酵母， 涂布到选择培养基上，可用菌落生长单位/μ g DNA，按下面的方法计算感受态细胞的转化 效率。计算公式转化效率=产生菌落的总数/铺板DNA的总量。使用EB缓冲液悬浮菌体进行保存，可以在保证转化效率的基础上延长保存时间。( 二 )质粒KL-Cre的转入
通过以上工作已将外源基因(黑曲霉酸性淀粉酶基因)转入乳酸克鲁维酵母 AS2. 1494中，并表达了淀粉酶，但该重组菌含有G418抗性，不能算是食品级菌株，KL-Cre质 粒转入是为了去除新霉素抗性基因(neo)(抗G418抗生素)，使其成为食品级工程菌。制备重组菌AS2/pKGAPGA-amy-18S的感受态细胞制备方法与上述实验(一)中 方法相同。将质粒KL-Cre转化到重组菌AS2/pKGAPGA_amy-18S中其转化方法与上述实验 (一)中方法相同。转化后的菌液涂布于YPD+zeocindOOy g/mL)筛选平板上，30°C培养3天，得到转 入质粒KL-Cre的单克隆。(三)pKGAPGA-Amy_18S中新霉素抗性基因的去除及质粒KL-Cre的丢失YPD琼脂培养基平板为上述YPD琼脂培养基配制而成，G418抗生素购自Amresco 公司，产品目录号为E859 ；zeocin抗生素购自Invitrogen公司，产品目录号为wl0487 ；YPD+G418 (200 μ g/mL)培养基向YPD琼脂培养基中添加G418抗生素得到的培养 基，G418在YPD琼脂培养基中的浓度为200 μ g/mL。YPD+zeocin (100 μ g/mL)筛选培养基向YPD琼脂培养基中添加zeocin得到的培 养基，zeocin在YPD琼脂培养基中的浓度为100 μ g/mL。将步骤(二)得到的单克隆挑取到YPD培养基中，30°C过夜培养，20h后加入甲 醇诱导，加入量为8 μ 1甲醇/mL培养基，诱导24-48h后，菌体涂布YPD平板(记作平板 I)，待菌落长出后影印到YPD+G418(200y g/mL)培养基平板上(记作平板II)，30°C培养 3天，对比两块平皿(平板I和平板II)，能够在平板I上生长却不能在平板II上生长的 克隆就是丢失新霉素抗性基因的阳性克隆(即能够抗G418的抗性筛选标记基因被切除的 菌落)。选择丢失新霉素抗性基因的阳性克隆接种YPD培养基连续培养传代3天(至少 10代以上)，然后取少量菌体涂布YPD培养基平板(记作平板III)，待长出菌落后影印到 YPD+zeocin (100 μ g/mL)筛选平板(记作平板IV)，对照比对两块平板(平板III和平板IV)，从中挑选能够在平板III上生长却不能在平板IV上生长的克隆，即为质粒KL-Cre丢 失且新霉素抗性基因被切除的菌落，即为目的阳性克隆。四、重组菌的功能验证(一)无抗性基因所得到的目的重组酵母菌在平板II和平板IX上均不能生长，说明得到的重组菌 不含有任何抗性基因。(二)是食品级菌株乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)AS2. 1494经是食品级酵母菌，且表达的 黑曲霉酸性α-淀粉酶是安全的，没有其它抗性基因等，说明得到的重组菌为食品级重组 酵母。所得到的目的重组酵母菌直接粉碎后可以直接作为食品添加剂使用，同时分离纯 化得到的淀粉酶可以在淀粉水解成葡萄糖的生产中使用。(三)表达外源基因将实验三得到的目的重组酵母菌进行表达，黑曲霉酸性 α -淀粉酶的表达量可以达到1200-1500U/mL。
权利要求
一种制备重组酵母菌的方法，包括如下步骤(1)将表达载体I转入宿主酵母菌中，得到转入所述表达载体I的重组酵母菌，记作酵母菌A；(2)将表达载体II转入所述酵母菌A中，得到转入所述表达载体I和所述表达载体II的重组酵母菌；将所述转入所述表达载体I和所述表达载体II的重组酵母菌记作酵母菌B；(3)诱导所述酵母菌B中的所述表达载体II中的Cre重组酶表达，所述Cre重组酶将所述酵母菌B中的所述载体I中的抗性基因切除，抗性筛选，得到含有所述外源基因和所述表达载体II、但不含有所述表达载体I中的抗性基因的重组酵母菌；将所述含有所述外源基因和所述表达载体II、但不含有所述表达载体I中的抗性基因的重组酵母菌记作酵母菌C；(4)传代培养所述酵母菌C，至所述酵母菌C中的所述表达载体II丢失，抗性筛选，得到含有所述外源基因但不含有所述表达载体I中抗性基因也不含有所述表达载体II的重组酵母菌，即为目的重组酵母菌；所述表达载体I包括如下元件loxP位点序列I、loxP位点序列II、所述宿主酵母菌的18S rDNA序列、外源基因表达盒、抗性筛选标记基因表达盒和原核复制起点序列，所述抗性筛选标记基因表达盒和所述原核复制起点序列在所述loxP位点序列I和所述loxP位点序列II之间；所述loxP位点序列I和所述loxP位点序列II在所述表达载体I中为正向重复序列；所述表达载体II是将所述宿主酵母菌的自我复制序列插入载体pSH65的多克隆位点得到的；所述载体pSH65中含有Cre重组酶表达盒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述表达载体I为由如下元件顺次连接 组成的环状载体所述IoxP位点序列I、所述宿主酵母菌的18S rDNA序列、所述外源基因 表达盒、所述IoxP位点序列II、所述抗性筛选标记基因表达盒和所述原核复制起点序列；和/或，所述表达载体II是将所述宿主酵母菌的自我复制序列插入载体PSH65的 BglII位点得到的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述外源基因表达盒由组成型3-磷 酸甘油醛启动子、外源基因、蛋白纯化标签编码基因和AOXl终止子组成，所述抗性筛选标 记基因表达盒由TEFlp启动子、EM7p启动子、新霉素抗性基因、CYCl终止子组成，所述原核 复制起点序列为PUC-Ori ；所述表达载体I中，所述蛋白纯化标签为myc标签和/或组氨酸 标签；和/或，所述表达载体II中，所述宿主酵母菌的自我复制序列如序列表中序列3所示。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述表达载体I是按照如下方 法得到的1)向载体PGAPGA中的外源基因表达盒的两端外侧插入所述IoxP位点序列，在距离所 述外源基因表达盒中启动子近的一侧插入IoxP位点序列I，在距离所述外源基因表达盒中 启动子远的一侧插入IoxP位点序列II，将得到的重组载体记作重组载体A ；2)在所述重组载体A的所述IoxP位点序列I与所述外源基因表达盒中启动子之间插 入所述宿主酵母菌的18S rDNA序列，将得到的重组载体记作重组载体B ；3)向所述重组载体B中的外源基因表达盒中的多克隆位点插入外源基因，得到所述载 体I ；和/或，所述载体II是按照如下方法得到的用限制性内切酶BglII酶切载体PSH65， 并用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow大片段削平3 ‘突出端，再与序列表中序列3所示基因连 接，得到所述载体II。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述步骤1)是通过如下操作实现的以所述载体PGAPGA作为模板，用序列表中序列5 所示DNA和序列表中序列6所示DNA作为引物对，PCR扩增，得到PCR产物，将所述PCR产 物插入所述载体PGAPGA的BglII和BamHI酶切位点间，得到的重组载体即为所述重组载体 A；和/或，所述步骤2)是通过如下操作实现的将所述宿主酵母菌的18S rDNA序列插入 所述重组载体A中所述IoxP位点序列I与所述外源基因表达盒中启动子之间的BglII酶 切位点处，得到的重组载体即为所述重组载体B。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述宿主酵母菌为乳酸克鲁维 酵母菌；和，所述表达载体I中，所述宿主酵母菌的18S rDNA序列如序列表中序列2所示， 所述IoxP位点序列I和所述IoxP位点序列II均如序列表中序列4所示。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述乳酸克鲁维酵母菌为乳酸 克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)AS2. 1494。
8.由权利要求1-7中任一所述方法获得的重组酵母。
全文摘要
本发明公开了一种重组酵母菌及其制备方法。该方法包括如下步骤(1)将表达载体I转入宿主酵母菌中，得到转入所述表达载体I的重组酵母菌，记作酵母菌A；(2)将表达载体II转入所述酵母菌A中，得到转入所述表达载体I和所述表达载体II的重组酵母菌；将所述转入所述表达载体I和所述表达载体II的重组酵母菌记作酵母菌B。实验证明，用本发明方法制备得到的重组酵母菌中不携带任何抗性基因；转入的表达载体拷贝数多，可达5-50个拷贝，且均整合到宿主菌的基因组中；用本发明的重组菌表达的外源基因产品成为安全的食品级产品。本发明制备方法操作简单、省时省力、成本低廉。因此，本发明的重组酵母菌及其制备方法适于推广使用。
文档编号C12N1/19GK101812409SQ20101013175
公开日2010年8月25日 申请日期2010年3月23日 优先权日2010年3月23日
发明者宋浩雷, 牛振东, 邱并生 申请人:中国科学院微生物研究所