一种测定交联透明质酸钠凝胶中聚乙二醇残留量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种交联透明质酸钠凝胶中聚乙二醇残留量的检测方法，依据PEG与钡离子和碘离子形成1∶1∶1的复合物的光密度与PEG的含量在535nm处呈线性关系的原理采用非常规溶剂建立了一种操作简单、快速、稳定性好的交联凝胶中微量PEG残留量的检测方法。该检测方法在0-50.0μg/mL范围内具有良好的线性关系，尤其可用于残留量在2μg/mL以下的和大分子量的交联剂检测。本检测方法不仅可用于PEG交联的透明质酸钠凝胶中PEG残留量的痕量检测和凝胶产品的质量控制，对PEG交联的其它凝胶及含有PEG的其它液态样品中PEG残留量的检测也有重要意义。
【专利说明】—种测定交联透明质酸钠凝胶中聚乙二醇残留量的方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及生物化学、药物化学与药物分析【技术领域】，具体涉及一种测定交联透明质酸钠凝胶中聚乙二醇残留量的方法。
【背景技术】
[0003]透明质酸是广泛存在于生物体中的一种天然保湿因子，Ig透明质酸至少持水600g，透明质酸是由双糖单位D-葡萄糖醛酸与N-乙酰葡糖胺多次重复排列所组成的酸性大分子多糖，广泛地应用于化妆品、食品和医药领域，商品一般用其钠盐，即透明质酸钠(SH)。天然的透明质酸钠凝胶具有良好的生物相容性好，然而因其易被降解，在体内存留时间短，限制其广泛应用。通过化学修饰制备交联凝胶是目前提高或延长其稳定性的主要手段。目前制备交联凝胶常用的方法是以1，4-丁二醇二缩水甘油基醚(I，4-butanediol diglycidyl ether , BDDE)、二乙烯基讽(Divinyl sulphone, DVS)、碳二亚胺(Biscarbodimide, EDC)等为交联剂采用一定的工艺技术制成,但是这些交联剂都有一定的刺激性和毒性，交联剂在凝胶制品中的残留量或含量各个国家都有严格的规定。聚乙二醇是一种被世界各国批准的既可食用又可药用的化合物，在医药领域，它不仅常作为口服制剂的辅料，还是一些注射剂常用的载体，无毒，具有良好的生物相容性且易被机体排出体外。用PEG做交联剂制备交联透明质酸钠凝胶已引起人们的广泛关注和高度重视，PEG交联的透明质酸钠凝胶具有明显的优越性和广阔的市场前景。
[0004]虽然PEG应用广泛，但无论是在食品还是在药品中，PEG对机体来说都是一种外来的化合物，所以在相关产品中其含量或残留量都有严格的限制，必须进行检测。目前国内外见于报道的分析检测PEG含量或残留量的方法主要有纸色谱、薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱、分光光度法等，但这些方法大都是针对液态样品如疫苗、尿液等液体中PEG的含量进行检测的，对于凝胶中PEG残留量的检测尚未见报道。而且在已报道的上述方法中，纸色谱的分离时间较长，且同薄层色谱一样，难以对PEG进行精确定量。气相色谱和高效液相色谱是对PEG进行定量检测的常用方法，然而气相色谱所测定的PEG分子量较低，IOOODa为最高上限，且分子量大于500的PEG需进行衍生化后再检测，衍生步骤耗时且衍生物稳定性不高。高效液相色谱可对PEG进行分离和定量，大多数高效液相色谱方法使用的是示差折光检测器，而这种方法由于灵敏度低应用范围也不普遍，而且液相色谱仪器设备投资大，并且所需试剂耗材昂贵。分光光度法测定PEG含量主要有D试剂法和氯化钡法。由于D试剂法配制试剂过程繁琐且不稳定易降解，硝酸铋价格昂贵，且该方法的最低检测限偏高(大于2Pg/mL)而使其应用越来越少。Childs于1975年首次建立了 PEG的氯化钡检测法，其基本原理为PEG与钡离子和碘离子形成复合物(1:1:1 )，在535nm处的光密度值与PEG的含量呈线性关系进行检测，后经B.Skoog和G.E.C.Sims及T.J.Snape改进,至今仍在应用。然而B.Skoog报道的PEG的最低检测限是5 Mg/mL,G.E.C.Sims和T.J.Snape的研究结果中PEG的含量低于2 l^g/mL时就检测不到，而在医学美容等领域相关交联凝胶产品中的交联剂的残留量一般应小于2呢/mL才算符合要求，目前还缺乏采用分光光度法检测出凝胶中PEG600-20000残留量小于2 l^g/mL的相关技术和方法。
【发明内容】
[0005]本发明针对已有技术的不足，提供一种交联透明质酸钠凝胶中聚乙二醇残留量的测定方法，通过提供一种凝胶样品的前处理或预处理方法，再加上一种非常规标准曲线的制作，建立了一种可简单、快速检测交联透明质酸钠钠凝胶中PEG残留量(小于2呢/mL)的痕量分析方法。该方法对凝胶样品进行特殊的预处理，用95%或无水乙醇沉淀该凝胶，离心取上清液检测其聚乙二醇残留量。依据PEG与钡离子和碘离子形成1:1:1的复合物的光密度与PEG的含量在535nm处呈线性关系的原理，检测凝胶样品中PEG的残留量。该方法与其他方法相比，可以大大降低实验成本且灵敏度高，稳定性好，简单安全，方便快捷。 [0006]该测定交联透明质酸钠凝胶中聚乙二醇残留量的方法包括以下工艺步骤:
(I)样品预处理
交联透明质酸钠凝胶的样品预处理:将PEG交联的透明质酸钠凝胶用7-14倍体积的95%乙醇或无水乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将部分粉碎后的颗粒或粉末在108-124°C下复溶10-30min，精密称取复溶后的凝胶1.0g，加入2 mL无水乙醇，密封，经漩涡振荡器振荡，使凝胶沉淀，然后于5000-1800()r/min离心3_30min，取上清液待测；
非交联透明质酸钠凝胶的样品预处理:将非交联透明质酸钠凝胶用7-14倍体积的95%乙醇或无水乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将粉碎后的颗粒或粉末在108-124°C复溶10-30min,精密称取复溶后的全部凝胶于1000mL烧杯内，加入2倍体积(g:mL)无水乙醇，用玻璃棒搅拌使凝胶沉淀，然后将上清液分装于IOOmL离心管中在5000-18000r/min离心3-30min,取上清液备用；
(2)PEG标准溶液的配制PEG600-20000标准贮存液:精密称取50mg的PEG600-20000，加入非交联透明质酸钠凝胶样品经预处理所制得的上清液中溶解，在IOOmL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存备用；PEG600-20000标准工作液:吸取PEG600-20000标准贮存液5mL于50mL容量瓶中，用非交联透明质酸钠凝胶样品经预处理所制得的上清液定容，质量浓度为50|ag/mL ；
(3)氯化钡溶液的配制
精确称取5g氯化钡，加蒸馏水定容至100ml，得到5%的氯化钡溶液；
(4)碘液的配制
精确称取碘化钾2.0g和碘1.3g，加蒸馏水定容至100ml，得到0.05mol/L的碘液；
(5)PEG溶液标准曲线的制作
分别取6-15组具有不同浓度为0,0.5、10.5,20.5,30.5,40.5 l^g/mL的PEG标准溶液1.0ml,浓度范围在0-50 ii g/ml之间，加入5ml蒸馏水，5%的氯化钡溶液和碘液各50-1000 iil，反应8-15min，于波长535nm处测定光密度值；每个浓度做三个平行样；以上加量可按比例增减；根据每组PEG浓度与测得的光密度值之间的关系，以PEG浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线；
(6)交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的计算本发明的用于计算交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的计算公式如下:
Y=0.0108X+0.2047 (R2=0.9994)
式中:X——PEG的质量浓度(U g/ml)；
Y——碘-氯化钡-PEG (1:1:1)复合物在535nm处的光密度值；
(7)交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的测定方法步骤
按步骤(5)，取步骤(1)交联透明质酸凝胶样品预处理中所得的上清液适量加入一定量的蒸馏水、氯化钡溶液和碘液反应，反应时间为15min以内，于波长535nm处测定光密度值，根据步骤(5)制作的PEG浓度与相应光密度值之间的标准对应关系曲线或按步骤(6)的计算公式确定待测交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量。
[0007]所述步骤(1)中对交联凝胶所进行的预处理是用95%的乙醇醇沉交联凝胶，用离心后所得到的上清液来检测交联透明质酸钠凝胶中的PEG残留量。
[0008]所述步骤(2)中所配制的PEG标准溶液的溶剂为步骤(Tl中非交联凝胶经与交联凝
胶相同体积份数的95%乙醇醇沉得到的上清液，非交联凝胶除了在制备过程中未加入交联剂PEG外，其他步骤均相同，所以，所配制的PEG标准溶液与所要检测残留量的上清液除了PEG含量有所不同外，其他的组分都一样。
[0009]所述步骤(5) PEG溶液标准曲线的制作中的零对照为步骤⑴中非交联透明质酸钠
凝胶经95%乙醇醇沉并离心所得的上清液，且步骤(5)中标准PEG溶液要依次加入5ml蒸馏
水，5%的氯化钡溶液和碘液，而零对照则是对非交联透明质酸钠凝胶经95%乙醇醇沉并离心所得的上清液补加蒸馏水至体积与标准PEG溶液梯度系列相等。
[0010]所述方法测定光密度值的最佳时间为1Omin。
[0011]所述方法反应时加入氯化钡溶液和碘液的最佳量为250ul。
[0012]本发明的特点和优点是制作标准曲线所用的PEG600-20000的标准溶液的配制与常规方法不同，常规方法是用蒸馏水作为溶剂溶解PEG600-20000配制成一定浓度的溶液，再加入不同比例的蒸馏水稀释成所需要的浓度梯度，而本研究所用的配制PEG600-20000的标准溶液的方法则是用非交联透明质酸凝胶醇沉后的上清液作为溶剂溶解PEG600-20000配制成一定浓度的溶液，再加入不同比例的上清液稀释成所需要的浓度梯度。除了非交联透明质酸钠凝胶醇沉后上清液中不含PEG600-20000，所用的非交联透明质酸钠凝胶的上清液与样品检测时交联透明质酸钠凝胶上清液的组成成分一致，尽可能多的排除了影响检测结果的干扰因子，与传统方法中用蒸馏水来配制标准溶液的方法是不同的。
[0013]另外本发明的空白对照也与常规方法不同，常规方法中空白对照为蒸馏水，最后步骤要加入显色剂氯化钡和碘液，而本发明所用方法的空白对照则是为非交联透明质酸凝胶醇沉后的上清液，在最后步骤不加显色剂，用蒸馏水替代显色剂。本方法的具体操作是用非交联透明质酸钠凝胶醇沉上清液加入5.5mL蒸馏水后的溶液作为空白对照，与传统方法中的空白对照为蒸馏水中加入显色剂的溶液是不同的，此类方法对于测量PEG含量较高的溶液是合适的，对于PEG含量较低的样品则难以检测。因为本方法的空白对照未加入显色剂，所以可以在PEG浓度较低(≤2ug/mL)的情况下可得到理想的光密度值。因此，本发明的方法可用于较低PEG残留量(≤2ug/mL)的检测，可直接用于PEG交联的凝胶产品生产过程中PEG残留量的痕量检测和凝胶产品的质量控制。
[0014]本发明的有益效果是:
本发明经过长期试验探索之后，终于找到一种凝胶样品的前处理或预处理方法，通过一种非常规标准曲线的制作，建立了一种可简单、快速检测交联透明质酸钠钠凝胶中PEG残留量(小于2呢/mL)的痕量分析方法。本检测方法可为PEG交联的透明质酸钠凝胶中PEG残留量的痕量检测和凝胶产品的质量控制奠定基础，对PEG交联的其它凝胶及含有PEG的其它液态样品中PEG残留量的检测有一定的参考价值，对凝胶制品生产过程中其它交联剂的微量检测和产品质量控制也具有借鉴作用。
[0015]同时，本发明通过醇沉技术以醇沉后的上清液来检测凝胶样品中的交联剂残留量，既对原样品无任何污染或破坏，又可对原样品进行进一步的精制，通过检测后的凝胶样品醇沉物通过一定的制胶技术还可再次做成凝胶，具有一举多得的效果。
[0016]本发明用氯化钡和碘液作为显色剂，PEG与钡离子和碘离子(1:1:1)所生成复合物在535nm的光密度值与PEG的浓度在较宽范围内呈线性关系。该法不需要昂贵的仪器，大大节省了实验成本，简单方便，便于大规模推广应用。
【具体实施方式】
[0017]以下详细介绍本发明的实施例。
[0018]实施例1:
主要仪器:FA1204B型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；SW-CJ-1FD洁净工作台，苏净安泰有限公司；722N型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；TGL-16C型菲恰尔离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司；涡旋振荡仪，北方同正有限公司；移液器，德国Eppendorf公司；
CL)样品预处理
交联透明质酸钠凝胶的样品预处理:将制备的交联透明质酸钠凝胶用14倍体积的95%乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将部分粉碎后的颗粒或粉末在121°C复溶20min，精密称取复溶后的凝胶1.0g，加入2 mL无水乙醇，密封，经漩涡振荡器振荡，使凝胶沉淀，然后于10000r/min离心15min，取上清液待测；
非交联透明质酸钠凝胶的样品预处理:将制备的非交联透明质酸钠凝胶用14倍体积的95%乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将粉碎后的颗粒或粉末在121°C复溶20min，精密称取复溶后的全部凝胶于1000mL烧杯内，加入2倍体积(g:mL)无水乙醇，用玻璃棒搅拌使凝胶沉淀，然后将上清液分装于IOOmL离心管中在10000r/min离心15min，取上清液备用；
(2)PEG标准溶液的配制 PEG20000标准贮存液:精密称取50mg的PEG20000，加入非交联透明质酸钠凝胶的样品经预处理所制得的上清液中溶解，在IOOmL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存备用；
PEG20000标准工作液:吸取PEG20000标准贮存液5mL于50mL容量瓶中，用非交联透明质酸钠凝胶的样品经预处理所制得的上清液定容，质量浓度为50|ag/mL ；
(3)氯化钡溶液的配制
精确称取5g氯化钡，加蒸馏水定容至100ml，得到5%的氯化钡溶液；
(4)碘液的配制
精确称取碘化钾2.0g和碘1.3g，加蒸馏水定容至100ml，得到0.05mol/L的碘液；
(5)PEG溶液标准曲线的制作
分别取6组具有不同浓度为0、0.5,10.5,20.5,30.5,40.5 l^g/mL的PEG标准溶液
1.0ml，浓度范围在0-50 ii g/ml之间，加入5ml蒸馏水，5%的氯化钡溶液和碘液各250 yl，反应15min，于波长535nm处测定光密度值；每个浓度做三个平行样；以上加量可按比例增减；根据每组PEG浓度与测得的光密度值之间的关系，以PEG浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线；
(6)交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的计算
本发明的用于计算交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的计算公式如下:
Y=0.0108X+0.2047 (R2=0.9994)
式中:X——PEG的质量浓度(U g/ml)；
Y——碘-氯化钡-PEG (1:1:1)复合物在535nm处的光密度值；
(7)交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的测定方法步骤
按步骤(5)，取步骤(1)交联透明质酸凝胶样品预处理中所得的上清液适量加入蒸馏水、氯化钡溶液和碘液反应，反应时间为15min以内，于波长535nm处测定光密度值，根据步骤(5)制作的PEG浓度与相应光密度值之间的标准对应关系曲线或按步骤(6)的计算公式确定待测交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量。
[0019]实施例2:
主要仪器:FA1204B型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；SW-CJ-1FD洁净工作台，苏净安泰有限公司；722N型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；TGL-16C型菲恰尔离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司；涡旋振荡仪，北方同正有限公司；移液器，德国Eppendorf公司；
(I)样品预处理
交联透明质酸钠凝胶的样品预处理:将制备的交联透明质酸钠凝胶用7倍体积的无水乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将部分粉碎后的颗粒或粉末在108°C复溶30min，精密称取复溶后的凝胶1.0g，加入2 mL无水乙醇，密封，经漩涡振荡器振荡，使凝胶沉淀，然后于5000r/min离心30min，取上清液待测；
非交联透明质酸钠凝胶的样品预处理:将制备的非交联透明质酸钠凝胶用7倍体积的无水乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将粉碎后的颗粒或粉末在108°C复溶30min，精密称取复溶后的全部凝胶于1000mL烧杯内，加入2倍体积(g:mL)无水乙醇，用玻璃棒搅拌使凝胶沉淀，然后将上清液分装于IOOmL离心管中在5000r/min离心30min，取上清液备用；
(?:) PEG标准溶液的配制
PEG600标准贮存液:精密称取50mg的PEG600，加入非交联透明质酸钠凝胶的样品经预处理所制得的上清液中溶解，在IOOmL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存备用；
PEG600标准工作液:吸取PEG600标准贮存液5mL于50mL容量瓶中，用非交联透明质酸钠凝胶的样品经预处理所制得的上清液定容，质量浓度为50|ag/mL ；
(3)氯化钡溶液的配制
精确称取5g氯化钡，加蒸馏水定容至100ml，得到5%的氯化钡溶液；
(4)碘液的配制
精确称取碘化钾2.0g和碘1.3g，加蒸馏水定容至100ml，得到0.05mol/L的碘液；
(5)PEG溶液标准曲线的制作
分别取15组具有不同浓度为0、0.5,10.5,20.5,30.5,40.5 l^g/mL的PEG标准溶液
1.0ml，浓度范围在0-50 u g/ml之间，加入5ml蒸馏水，5%的氯化钡溶液和碘液各50 yl，反应8min，于波长535nm处测定光密度值；每个浓度做三个平行样；以上加量可按比例增减；根据每组PEG浓度与测得的光密 度值之间的关系，以PEG浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线；
(6)交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的计算
本发明的用于计算交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的计算公式如下:
Y=0.0108X+0.2047 (R2=0.9994)
式中:X——PEG的质量浓度(U g/ml)；
Y——碘-氯化钡-PEG (1:1:1)复合物在535nm处的光密度值；
(7)交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的测定方法步骤
按步骤(5)，取步骤(1)交联透明质酸凝胶样品预处理中所得的上清液适量加入蒸馏水、氯化钡溶液和碘液反应，反应时间为15min以内，于波长535nm处测定光密度值，根据步骤(5)制作的PEG浓度与相应光密度值之间的标准对应关系曲线或按步骤(6)的计算公式确定待测交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量。
[0020]实施例3:
主要仪器:FA1204B型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；SW-CJ-1FD洁净工作台，苏净安泰有限公司；722N型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；TGL-16C型菲恰尔离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司；涡旋振荡仪，北方同正有限公司；移液器，德国Eppendorf公司；
(I)样品预处理交联透明质酸钠凝胶的样品预处理:将制备的交联透明质酸钠凝胶用10倍体积的95%乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将部分粉碎后的颗粒或粉末在110°C复溶18min，精密称取复溶后的凝胶1.0g，加入2 mL无水乙醇，密封，经漩涡振荡器振荡，使凝胶沉淀，然后于15000r/min离心5min,取上清液待测；
非交联透明质酸钠凝胶的样品预处理:将制备的非交联透明质酸钠凝胶用10倍体积的95%乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将粉碎后的颗粒或粉末在110°C复溶18min，精密称取复溶后的全部凝胶于1000mL烧杯内，加入2倍体积(g:mL)无水乙醇，用玻璃棒搅拌使凝胶沉淀，然后将上清液分装于IOOmL离心管中在15000r/min离心5min，取上清液备用；
(2)PEG标准溶液的配制
PEG2000标准贮存液:精密称取50mg的PEG2000，加入非交联透明质酸钠凝胶的样品经预处理所制得的上清液中溶解，在IOOmL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存备用；
PEG2000标准工作液:吸取PEG2000标准贮存液5mL于50mL容量瓶中，用非交联透明质酸钠凝胶的样品经预处理所制得的上清液定容，质量浓度为50|ag/mL ；
(3)氯化钡溶液的配制
精确称取5g氯化钡，加蒸馏水定容至100ml，得到5%的氯化钡溶液；
(4)碘液的配制
精确称取碘化钾2.0g和碘1.3g，加蒸馏水定容至100ml，得到0.05mol/L的碘液；
(T)PEG溶液标准曲线的制作
分别取10组具有不同浓度为0,0.5,10.5,20.5,30.5,40.5 l^g/mL的PEG标准溶液
1.0ml，浓度范围在0-50 u g/ml之间，加入5ml蒸馏水，5%的氯化钡溶液和碘液各1000 U 1，反应9min，于波长535nm处测定光密度值；每个浓度做三个平行样；以上加量可按比例增减；根据每组PEG浓度与测得的光密度值之间的关系，以PEG浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线；
(6)交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的计算
本发明的用于计算交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的计算公式如下:
Y=0.0108X+0.2047 (R2=0.9994)
式中:X——PEG的质量浓度(U g/ml)；
Y——碘-氯化钡-PEG (1:1:1)复合物在535nm处的光密度值；
(7)交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的测定方法步骤
按步骤(5)，取步骤(1)交联透明质酸凝胶样品预处理中所得的上清液适量加入蒸馏水、氯化钡溶液和碘液反应，反应时间为15min以内，于波长535nm处测定光密度值，根据步骤(5)制作的PEG浓度与相应光密度值之间的标准对应关系曲线或按步骤(6)的计算公式确定待测交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量。
[0021]实施例4:·主要仪器:FA1204B型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；SW-CJ-1FD洁净工作台，苏净安泰有限公司；722N型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；TGL-16C型菲恰尔离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司；涡旋振荡仪，北方同正有限公司；移液器，德国Eppendorf公司；
(I)样品预处理
交联透明质酸钠凝胶的样品预处理:将制备的交联透明质酸钠凝胶用12倍体积的无水乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将部分粉碎后的颗粒或粉末在115°C复溶25min，精密称取复溶后的凝胶1.0g，加入2 mL无水乙醇，密封，经漩涡振荡器振荡，使凝胶沉淀，然后于8000r/min离心25min，取上清液待测；
非交联透明质酸钠凝胶的样品预处理:将制备的非交联透明质酸钠凝胶用10倍体积的无水乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将粉碎后的颗粒或粉末在115°C复溶25min,精密称取复溶后的全部凝胶于1000mL烧杯内，加入2倍体积(g:mL)无水乙醇,用玻璃棒搅拌使凝胶沉淀，然后将上清液分装于IOOmL离心管中在8000r/min离心25min，取上清液备用；
(2)PEG标准溶液的配制
PEG8000标准贮存液:精密称取50mg的PEG8000，加入非交联透明质酸钠凝胶的样品经预处理所制得的上清液中溶解，在IOOmL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存备用；
PEG8000标准工作液:吸取PEG8000标准贮存液5mL于50mL容量瓶中，用非交联透明质酸钠凝胶的样品经预处理所制得的上清液定容，质量浓度为50|ag/mL ；
G)氯化钡溶液的配制
精确称取5g氯化钡，加蒸馏水定容至100ml，得到5%的氯化钡溶液；
(4)碘液的配制
精确称取碘化钾2.0g和碘1.3g，加蒸馏水定容至100ml，得到0.05mol/L的碘液；
(5)PEG溶液标准曲线的制作
分别取11组具有不同浓度的PEG标准溶液1.0ml，浓度范围在0-50 u g/ml之间，加入5ml蒸馏水，5%的氯化钡溶液和碘液各500 yl，反应llmin，于波长535nm处测定光密度值；每个浓度做三个平行样；以上加量可按比例增减；根据每组PEG浓度与测得的光密度值之间的关系，以PEG浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线；
(6)交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的计算
本发明的 用于计算交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的计算公式如下:
Y=0.0108X+0.2047 (R2=0.9994)
式中:X——PEG的质量浓度(U g/ml)；
Y——碘-氯化钡-PEG (1:1:1)复合物在535nm处的光密度值；
(7)交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的测定方法步骤 按步骤(5)，取步骤(I)交联透明质酸凝胶样品预处理中所得的上清液适量加入蒸馏水、氯化钡溶液和碘液反应，反应时间为15min以内，于波长535nm处测定光密度值，根据步骤(5)制作的PEG浓度与相应光密度值之间的标准对应关系曲线或按步骤(6)的计算公式确定待测交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量。
[0022]实施例5:
主要仪器:FA1204B型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；SW-CJ-1FD洁净工作台，苏净安泰有限公司；722N型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；TGL-16C型菲恰尔离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司；涡旋振荡仪，北方同正有限公司；移液器，德国Eppendorf公司；
(I)样品预处理
交联透明质酸钠凝胶的样品预处理:将制备的交联透明质酸钠凝胶用9倍体积的95%乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将部分粉碎后的颗粒或粉末在120°C复溶19min，精密称取复溶后的凝胶1.0g，加入2 mL无水乙醇，密封，经漩涡振荡器振荡，使凝胶沉淀，然后于12000r/min离心lOmin，取上清液待测；
非交联透明质酸钠凝胶的样品预处理:将制备的非交联透明质酸钠凝胶用9倍体积的95%乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将粉碎后的颗粒或粉末在120°C复溶19min，精密称取复溶后的全部凝胶于IOOOmL烧杯内，加入2倍体积(g:mL)无水乙醇，用玻璃棒搅拌使凝胶沉淀，然后将上清液分装于IOOmL离心管中在12000r/min离心lOmin，取上清液备用；
(2)PEG标准溶液的配制
PEG10000标准贮存液:精密称取50mg的PEG10000，加入非交联透明质酸钠凝胶的样品经预处理所制得的上清液中溶解，在IOOmL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存备用；
PEG10000标准工作液:吸取PEG10000标准贮存液5mL于50mL容量瓶中，用非交联透明质酸钠凝胶的样品经预处理所制得的上清液定容，质量浓度为50|ag/mL ；
(3)氯化钡溶液的配制
精确称取5g氯化钡，加蒸馏水定容至100ml，得到5%的氯化钡溶液；
(4+)碘液的配制
精确称取碘化钾2.0g和碘1.3g，加蒸馏水定容至100ml，得到0.05mol/L的碘液；
(5.1 PEG溶液标准曲线的制作
分别取13组具有不同浓度的PEG标准溶液1.0ml，浓度范围在0-50 u g/ml之间，加入5ml蒸馏水，5%的氯化钡溶液和碘液各750 yl，反应13min，于波长535nm处测定光密度值；每个浓度做三个平行样；以上加量可按比例增减；根据每组PEG浓度与测得的光密度值之间的关系，以PEG浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线；
(6)交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的计算本发明的用于计算交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的计算公式如下:
Y=0.0108X+0.2047 (R2=0.9994)
式中:X——PEG的质量浓度(U g/ml)；
Y——碘-氯化钡-PEG (1:1:1)复合物在535nm处的光密度值；
(7)交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的测定方法步骤
按步骤(5)，取步骤(1)交联透明质酸凝胶样品预处理中所得的上清液适量加入蒸馏水、氯化钡溶液和碘液反应，反应时间为15min以内，于波长535nm处测定光密度值，根据步骤(5)制作的PEG浓度与相应光密度值之间的标准对应关系曲线或按步骤(6)的计算公式确定待测交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量。
[0023] 实施例6:
主要仪器:FA1204B型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；SW-CJ-1FD洁净工作台，苏净安泰有限公司；722N型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；TGL-16C型菲恰尔离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司；涡旋振荡仪，北方同正有限公司；移液器，德国Eppendorf公司；
(T〗样品预处理
交联透明质酸钠凝胶的样品预处理:将制备的交联透明质酸钠凝胶用13倍体积的无水乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将部分粉碎后的颗粒或粉末在124°C复溶lOmin，精密称取复溶后的凝胶1.0g，加入2 mL无水乙醇，密封，经漩涡振荡器振荡，使凝胶沉淀，然后于18000r/min离心3min，取上清液待测；
非交联透明质酸钠凝胶的样品预处理:将制备的非交联透明质酸钠凝胶用13倍体积的95%乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将粉碎后的颗粒或粉末在124°C复溶lOmin，精密称取复溶后的全部凝胶于1000mL烧杯内，加入2倍体积(g:mL)无水乙醇，用玻璃棒搅拌使凝胶沉淀，然后将上清液分装于IOOmL离心管中在18000r/min离心3min，取上清液备用；
⑵PEG标准溶液的配制
PEG16000标准贮存液:精密称取50mg的PEG16000，加入非交联透明质酸钠凝胶的样品经预处理所制得的上清液中溶解，在IOOmL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存备用； PEG16000标准工作液:吸取PEG16000标准贮存液5mL于50mL容量瓶中，用非交联透明质酸钠凝胶的样品经预处理所制得的上清液定容，质量浓度为50|ag/mL ；
(3)氯化钡溶液的配制
精确称取5g氯化钡，加蒸馏水定容至100ml，得到5%的氯化钡溶液；
(T)碘液的配制
精确称取碘化钾2.0g和碘1.3g，加蒸馏水定容至100ml，得到0.05mol/L的碘液；
(5)PEG溶液标准曲线的制作分别取9组具有不同浓度的PEG标准溶液1.0ml，浓度范围在0_50 μ g/ml之间，加入5ml蒸馏水，5%的氯化钡溶液和碘液各200 μ 1，反应lOmin，于波长535nm处测定光密度值；每个浓度做三个平行样；以上加量可按比例增减；根据每组PEG浓度与测得的光密度值之间的关系，以PEG浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线；
(6)交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的计算
本发明的用于计算交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的计算公式如下:
Y=0.0108X+0.2047 (R2=0.9994)
式中:X——PEG的质量浓度(μ g/ml)； Y——碘-氯化钡-PEG (1:1:1)复合物在535nm处的光密度值；
(7)交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的测定方法步骤
按步骤(5)，取步骤(1)交联透明质酸凝胶样品预处理中所得的上清液适量加入蒸馏水、氯化钡溶液和碘液反应，反应时间为15min以内，于波长535nm处测定光密度值，根据步骤(5)制作的PEG浓度与相应光密度值之间的标准对应关系曲线或按步骤(6)的计算公式确定待测交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量。
[0024] 本发明不限于上述操作，所有在本发明的实质范围内作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种测定交联透明质酸钠凝胶中聚乙二醇残留量的方法，包括以下工艺步骤: (I)样品预处理 交联透明质酸钠凝胶的样品预处理:将PEG交联的透明质酸钠凝胶用7-14倍体积的95%乙醇或无水乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将部分粉碎后的颗粒或粉末在108-124°C下复溶10-30min，精密称取复溶后的凝胶1.0g，加入2 mL无水乙醇，密封，经漩涡振荡器振荡，使凝胶沉淀，然后于5000-1800()r/min离心3_30min，取上清液待测； 非交联透明质酸钠凝胶的样品预处理:将非交联透明质酸钠凝胶用7-14倍体积的95%乙醇或无水乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将粉碎后的颗粒或粉末在108-124°C复溶10-30min,精密称取复溶后的全部凝胶于1000mL烧杯内，加入2倍体积(g:mL)无水乙醇，用玻璃棒搅拌使凝胶沉淀，然后将上清液分装于IOOmL离心管中在5000-18000r/min离心3-30min,取上清液备用； (2)PEG标准溶液的配制 PEG600-20000标准贮存液:精密称取50mg的PEG600-20000，加入非交联透明质酸钠凝胶样品经预处理所制得的上清液中溶解，在IOOmL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存备用； PEG600-20000标准工作液:吸取PEG600-20000标准贮存液5mL于50mL容量瓶中，用非交联透明质酸钠凝胶样品经预处理所制得的上清液定容，质量浓度为50|ag/mL ； (3)氯化钡溶液的配制 精确称取5g氯化钡，加蒸馏水定容至100ml，得到5%的氯化钡溶液； (4)碘液的配制 精确称取碘化钾2.0g和碘1.3g，加蒸馏水定容至100ml，得到0.05mol/L的碘液； (5)PEG溶液标准曲线的制作 分别取6-15组具有不同浓度为0,0.5、10.5,20.5,30.5,40.5 l^g/mL的PEG标准溶液1.0ml,浓度范围在0-50ii g/ml之间，加入5ml蒸馏水，5%的氯化钡溶液和碘液各50-1000 iil，反应8-15min，于波长535nm处测定光密度值；每个浓度做三个平行样；以上加量可按比例增减；根据每组PEG浓度与测得的光密度值之间的关系，以PEG浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线； (6)交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的计算 本发明的用于计算交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的计算公式如下:
Y=0.0108X+0.2047 (R2=0.9994) 式中:X——PEG的质量浓度(U g/ml)； Y——碘-氯化钡-PEG (1:1:1)复合物在535nm处的光密度值； (7)交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量的测定方法步骤 按步骤(5)，取步骤(1)交联透明质酸凝胶样品预处理中所得的上清液适量加入一定量的蒸馏水、氯化钡溶液和碘液反应，反应时间为15min以内，于波长535nm处测定光密度值，根据步骤(5)制作的PEG浓度与相应光密度值之间的标准对应关系曲线或按步骤(6)的计算公式确定待测交联透明质酸钠凝胶中PEG残留量。
2.据权利要求1所述的测定交联透明质酸钠凝胶中聚乙二醇残留量的方法，其特征是:所述步骤0)中对交联凝胶所进行的预处理是用95%的乙醇或无水乙醇醇沉交联凝胶，用离心后所得到的上清液来检测交联透明质酸钠凝胶中的PEG残留量。
3.据权利要求1所述的测定交联透明质酸钠凝胶中聚乙二醇残留量的方法，其特征是:所述步骤?中所配制的PEG标准溶液的溶剂为步骤—V中非交联凝胶经与交联凝胶相同体积份数的95%乙醇或无水乙醇醇沉得到的上清液，非交联凝胶除了在制备过程中未加入交联剂PEG外，其他步骤均相同，所以，所配制的PEG标准溶液与所要检测残留量的上清液除了 PEG含量有所不同外，其他的组分都一样。
4.据权利要求1所述的测定交联透明质酸钠凝胶中聚乙二醇残留量的方法，其特征是:所述步骤5: PEG溶液标准曲线的制作中的空白对照为步骤1:中非交联透明质酸钠凝胶经95%乙醇或无水乙醇醇沉并离心所得的上清液，但步骤?中标准PEG溶液要依次加入5ml蒸馏水，5%的氯化钡溶液和碘液，而空白对照则是对非交联透明质酸钠凝胶经95%乙醇醇沉并离心所得的上清液补加蒸馏水至体积与标准PEG溶液梯度系列相等。
5.根据权利要求1所述的测定交联透明质酸钠凝胶中聚乙二醇残留量的方法，其特征是:所述的可测定的PEG的分子`量范围为600-20000Da。
【文档编号】G01N1/28GK103630536SQ201310657504
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】赵永亮, 王卫国, 王化鹏, 孟甜甜, 丁金聚, 弯家立, 贾柯, 张鹏, 穆甲俊, 陶宜辰 申请人:河南工业大学, 赵永亮