一种藏药材塞北紫堇的鉴定方法
【专利摘要】本发明提供了一种塞北紫堇药材的鉴定方法，包括对照品制备、供试品制备、并采用高效液相色谱法获取所述塞北紫堇药材的指纹图谱的步骤，其中，所述色谱条件与系统适用性试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以含体积份数比0.2%冰醋酸和体积份数比0.5%三乙胺的水溶液为流动相B，所述流动相B的pH值为6.0，进行梯度洗脱，检测波长为285nm，理论板数按原阿片碱峰计算应不低于3000，本发明所述塞北紫堇的鉴定方法简便、重现性好，准确率高，只要供选择的药材中出现本申请所指定的指纹图谱，即可确认药材为塞北紫堇，确保了药材选择的准确性，保证了成药的质量。
【专利说明】一种藏药材塞北紫堇的鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种药材的鉴定方法，具体地说，涉及一种藏药材塞北紫堇的鉴定方法。
【背景技术】
[0002]紫堇属全球约320种，主要产于亚洲，我国约200余种，全国均有分布，以西南部种类分布最多，其中青藏高原约120余种，仅西藏就多达94种。塞北紫堇为罂科紫堇属植物塞北紫堇(别名赛北紫堇)的干燥全草，分布在青海、西藏、甘肃、四川等地，为藏成药中的常用药，数据显示有25%的藏成药中含有该药材，用于治疗各种出血、肝炎、胆囊炎、流感等疾病，也有将其用于治疗跌打损伤或其它外伤、发烧、肠胃炎等。
[0003]从目前对该属植物的化学成分研究结果来看，本属植物主要含原托品碱类、原小檗碱类、苯酚异喹啉类、苯骈菲啶类、卞基异喹啉类、阿朴碱类、螺苄异喹啉类、枯拉灵类等结构类型的生物碱。该属植物及其提取物大多具有广泛的药理活性，如调节心血管系统、抗菌等。李吉昌等人发表的《赛北紫堇的生物碱成分研究》对采自云南省迪庆藏族自治州香格里拉县的赛北紫堇的根进行了提取分离和结构鉴定，首次报道了从其中分离并鉴定出7种生物碱。该文献的主要目的是对塞北紫堇植株中的有效成分进行鉴定，确定其中所含生物碱的具体种类，其对采摘植株是否是塞北紫堇的质量控制是由迪庆自治洲藏医院扎西泽仁医师凭经验确定的，并没有具体的检测方法，而塞北紫堇标准收载于《青海省藏药炮制规范》2010年版第60页，现行质量标准相对落后，仅有性状、薄层鉴别项，没有任何含量测定指标，并且由于紫堇属植物种类繁多，性状结构基本类似，面对大量的备选紫堇属药材植物，不能准确的鉴别出塞北紫堇，有效的控制成药的质量。此外藏成药中多将生长于西藏的塞北紫堇作为原料药入味，但是根据植物生长机理可知，即使是同一种植物，由于其使用的部位不同，生成的环境不同，则植株中有效成分及其含量也会存在一定的差异，造成塞北紫堇质量参差不齐，因此需要对该种植物进行严格筛选，保证以其为原料的成药的安全性、有效性。
【发明内容】
[0004]本发明的所要解决的技术问题是现行的塞北紫堇质量标准相对落后，仅有性状、薄层鉴别项，没有任何含量测定指标，不能准确有效的鉴别塞北紫堇，控制成药质量的问题，进而提供一种藏药材塞北紫堇的质量检测方法。
[0005]为此，本发明采取的技术方案为:
[0006]一种塞北紫堇药材的鉴定方法，包括对照品制备、供试品制备、并采用高效液相色谱法获取所述塞北紫堇药材的指纹图谱的步骤；
[0007]所述高效液相色谱法获取指纹图谱的步骤中，所述色谱条件与系统适用性试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以含体积份数比0.2%冰醋酸和体积份数比0.5%三乙胺的水溶液为流动相B，所述流动相B的pH值为6.0，进行梯度洗脱，所述洗脱程序具体为:0分钟至60分钟内，流动相A由体积比例20%渐变至体积比例40%，流动相B由体积比例80%渐变至体积比例60% ；60分钟至90分钟内，流动性A保持体积比例40%，流动相B保持体积比例60% ;检测波长为285nm，理论板数按原阿片碱峰计算应不低于3000 ；
[0008]对照品溶液的制备，取原阿片碱、黄紫堇明碱和α -枯枯灵为对照品，加入甲醇，制成每Iml溶液中含20 μ g原阿片碱、30 μ g黄紫堇明碱和10 μ g α -枯枯灵的对照品溶液；
[0009]供试品溶液的制备，取Ig所述塞北紫堇药材粉末，加25ml甲醇回流提取2小时，过滤，取滤液25ml，减压回收至干，得到残渣，所述残渣使用15ml体积浓度10%硫酸溶液溶解，并用石油醚洗涤2次，每次20ml，弃去石油醚部分，剩余水层使用氨水调节pH值至9-10，以氯仿萃取3次，每次20ml，减压回收至干，再用甲醇溶液溶解并定容至IOml ；
[0010]测定法，分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
[0011]上述塞北紫堇药材的鉴定方法中，对所述塞北紫堇药材指纹图谱中的9个特征峰进行对比鉴定，其中按照出峰先后顺序计，1、7和9号峰分别与对照品溶液的峰保留时间一致，I号峰为原阿片碱、7号峰为黄紫堇明碱、9号峰为α -枯枯灵，参照峰S为原阿片碱参照峰，其余特征峰的相对保留时间为:1号峰1.00,2号锋1.39、3号峰1.79、4号峰2.65、5号峰3.41、6号峰3.74、8号峰5.23，其相对保留时间在上述值的±10%之内。
[0012]上述塞北紫堇药材的鉴定方法中，所述方法还包括采用反滴定法对所述塞北紫堇药材中的总生物碱含量进行测定的步骤，具体包括:
[0013](I)取所述塞北紫堇药材细粉8-12重量份，加入50体积份的氯仿-氨水混合溶液，其中所述氯仿-氨水混合溶液中氯仿与氨水的体积份数比为100:1，称定塞北紫堇药材细粉和氯仿-氨水混合溶液的总重量，超声30min，放置10-15h，过滤，得到第一残渣和第一滤液；
[0014](2)向所述第一残渣中加入40-60体积份的所述氯仿-氨水混合溶液，振摇I小时，过滤得到第二残渣和第二滤液，所述第二残渣使用所述氯仿-氨水混合溶液洗涤若干次，其中若干次洗涤后的所有洗液备用，每次洗涤使用的所述氯仿-氨水混合溶液为15体积份；
[0015](3)合并步骤(I)和(2)中得到的第一滤液、第二滤液及所有洗液，低温减压蒸干得到第三残渣，向所述第三残渣中加入10体积份的乙醇使溶解，并加入I重量份的活性炭，振摇脱色lOmin，过滤后，得到最终滤液；
[0016](4)量取5个体积份的所述最终滤液至锥形瓶中，加入15体积份的浓度为
0.01mol/l硫酸滴定液、15体积份的水与3滴甲基红指示液,使用浓度为0.02mol/l氢氧化钠滴定液滴定至黄色，其中每Iml浓度为0.01mol/l硫酸滴定液相当于7.07mg的原阿片碱(C20H19N05)；
[0017]所述重量份与体积份的关系为g/ml的关系。
[0018]优选地，上述塞北紫堇药材的鉴定方法中，所述塞北紫堇药材中的总生物碱含量测定，包括如下步骤，
[0019](I)取所述塞北紫堇药材细粉10g，加入50ml的氯仿-氨水混合溶液，其中所述氯仿-氨水混合溶液中氯仿与氨水的体积份数比为100:1，称定塞北紫堇药材细粉和氯仿-氨水混合溶液的总重量，超声30min，放置过夜，过滤，得到第一残渣和第一滤液；
[0020](2)向所述第一残渣中加入50ml的所述氯仿-氨水混合溶液，振摇I小时，过滤得到第二残渣和第二滤液，所述第二残渣使用所述氯仿-氨水混合溶液洗涤3次，其中3次洗涤后得到的3次洗液备用，每次洗涤使用的所述氯仿-氨水混合溶液为15ml ；
[0021](3)合并步骤(I)和(2)中得到的第一滤液、第二滤液及所有洗液，低温减压蒸干得到第三残渣，向所述第三残渣中加入IOml的乙醇使溶解，并加入Ig活性炭，振摇脱色IOmin,过滤后,得到最终滤液；
[0022](4)量取5ml的所述最终滤液至锥形瓶中，加入15ml的浓度为0.01mol/l硫酸滴定液、15ml水与3滴甲基红指示液,使用浓度为0.02mol/l氢氧化钠滴定液滴定至黄色,其中每Iml浓度为0.01mol/l硫酸滴定液相当于7.07mg的原阿片碱(C20H19N05)。
[0023]优选地，上述塞北紫堇药材的鉴定方法中，干燥的塞北紫堇药材中，以原阿片碱(C20H19N05)计，其总生物碱的含量不小于1.9mg/g。
[0024]与现有技术相比，本发明具有如下优点，
[0025]( I)现行《青海省藏药炮制规范》中，对塞北紫堇的鉴别辨认方法准确率低，本发明所述塞北紫堇的鉴定方法简便、重现性好，准确率高，只要供选择的药材中出现本申请所指定的指纹图谱，即可确认药材为塞北紫堇，确保了药材选择的准确性，保证了成药的质量。
[0026](2)采用高效液相色谱法确定塞北紫堇的指纹图谱的过程中，选用乙腈为流动相A、体积份数比0.2%冰醋酸和体积份数比0.5%的三乙胺为流动相B (PH为6.0)，利用冰醋酸进行调节峰前沿，采用三乙胺调节峰拖尾。同时三乙胺与冰醋酸可形成盐类，有利于保持流动性的稳定性，从而得到更加准确的相对保留时间。同时塞北紫堇中生物碱的测定过程中，流动性对保留时间的影响较大，使用体积份数比0.2%冰醋酸和体积份数比0.5%的三乙胺为流动相B后，PH值约为6左右，能保持一个相对稳定弱酸性条件，有利于生物碱的分离，冰醋酸为有机酸，对色谱柱的伤害较小。从而选择体积份数比0.2%冰醋酸和体积份数比0.5%的三乙胺可很好的完成色谱的分离。
[0027](3)本发明通过流动相、分离条件及参数的选择，最终选择乙腈为有机相，可减少由于梯度变化引起的梯度峰，通过具体的时间程序改变流动相比例，同时结合供试品的处理，提取出主要生物碱的同时，去除了大量杂质。以上过程的具体参数相互配合，使目标峰均能与杂质峰有很好的分离，同时能有很好的相应及相对稳定的保留时间，从而得到一个良好的特征图谱。
[0028](4)本发明所述塞北紫堇药材的鉴定方法中，还包括对该药材中的总生物碱含量进行测定的步骤，通过本申请所述步骤检测出来的总生物碱含量准确，进一步以干燥品计，采用本申请所述方法检测出来的总生物碱含量不低于1.9mg/g时，将其作为原料入药，进一步保证了成药的质量。
[0029]实验例I塞北紫堇总生物碱的含量测定
[0030]1.仪器、试药和供试样品
[0031]仪器:电子天平:岛津AUW220D型；滴定管(北京玻璃仪器厂，25ml)。
[0032]对照品:原阿片喊对照品(中国药品生物制品检定所)，批号:0853-200201。
[0033]样品:塞北紫堇(青海金诃藏药药业股份有限公司提供)，批号分别为:110801、110802、110803。[0034]总生物碱的含量测定
[0035]取本品药材细粉10g，置具塞锥形瓶中，加入体积份数比100:1的氯仿-氨水混合溶液50ml,称定重量,超声30min,放置过夜,滤过,残洛加入体积份数比100:1的氯仿-氨水混合溶液50ml，振摇I小时，滤过，残渣使用体积份数比100:1的氯仿-氨水混合溶液洗涤3次，每次15m，滤过；合并上述滤液及洗液，低温减压(40°C以下)蒸干，残渣加入乙醇IOml使溶解，加入活性炭lg，振摇脱色lOmin，滤过，精密量取续滤液5ml至锥形瓶中，精密加入硫酸滴定液(0.01mol/l) 15ml、水15ml与甲基红指示液3滴,使用氢氧化钠滴定液(0.02mol/l)滴定至黄色。每Iml硫酸滴定液(0.01mol/l)相当于7.07mg的原阿片碱(C20H19N05)。
[0036]生物碱总含量以原阿片碱(C20H19N05)计，
[0037]含量％=[ (V硫酸*C硫酸)_ (V魏化钠*C魏化钠)]/0.01*A/M样100%
[0038]其中Α=7.07，M为药材细粉的质量。
[0039]干燥的塞北紫堇药材中，以原阿片碱(C20H19N05)计，其总生物碱的含量不小于
1.9mg/g0
[0040]2空白试验
[0041]精密量取乙醇5ml， 置250ml锥形瓶中，精密加入15ml硫酸滴定液(0.0116mol/I), 15ml水与3滴甲基红指示液,用氢氧化钠滴定液(0.0205mol/l)滴定滴至黄色。结果消耗碱液16.93ml，表明该溶剂系统未对测定结果产生干扰。
[0042]3重现性试验
[0043]取110801批号塞北紫堇药材样品6份，按总生物碱含量测定项下方法测定，计算总生物碱含量及其相对标准偏差。结果表明:该方法重复性良好。结果见表1。
[0044]表1总生物碱含量测定重现性试验结果
【权利要求】
1.一种塞北紫堇药材的鉴定方法，其特征在于，包括对照品制备、供试品制备、并采用高效液相色谱法获取所述塞北紫堇药材的指纹图谱的步骤； 所述高效液相色谱法获取指纹图谱的步骤中，所述色谱条件与系统适用性试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以含体积份数比0.2%冰醋酸和体积份数比0.5%三乙胺的水溶液为流动相B，所述流动相B的pH值为6.0,进行梯度洗脱，所述洗脱程序具体为:0分钟至60分钟内，流动相A由体积比例20%渐变至体积比例40%，流动相B由体积比例80%渐变至体积比例60% ；60分钟至90分钟内，流动性A保持体积比例40%，流动相B保持体积比例60% ;检测波长为285nm，理论板数按原阿片碱峰计算应不低于3000 ； 对照品溶液的制备，取原阿片碱、黄紫堇明碱和α-枯枯灵为对照品，加入甲醇，制成每Iml溶液中含20 μ g原阿片碱、30 μ g黄紫堇明碱和10 μ g α -枯枯灵的对照品溶液； 供试品溶液的制备，取Ig所述塞北紫堇药材粉末，加25ml甲醇回流提取2小时，过滤，取滤液25ml，减压回收至干，得到残渣，所述残渣使用15ml体积浓度10%硫酸溶液溶解，并用石油醚洗涤2次，每次20ml，弃去石油醚部分，剩余水层使用氨水调节pH值至9_10，以氯仿萃取3次，每次20ml，减压回收至干，再用甲醇溶液溶解并定容至IOml ； 测定法，分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
2.根据权利要求1所述的塞北紫堇药材的鉴定方法，其特征在于， 对所述塞北紫堇药材指纹图谱中的9个特征峰进行对比鉴定，其中按照出峰先后顺序计，1、7和9号峰分别与对照品溶液的峰保留时间一致，I号峰为原阿片碱、7号峰为黄紫堇明碱、9号峰为α-枯枯灵，参照峰S为原阿片碱参照峰，其余特征峰的相对保留时间为:1号峰1.00、2号锋1.39、3号峰1.79、4号峰2.65、5号峰3.41、6号峰3.74、8号峰5.23，其相对保留时间在上述值的±10%之内。
3.根据权利要求1或2所述的塞北紫堇药材的鉴定方法，其特征在于，所述方法还包括对所述塞北紫堇药材中的总生物碱含量进行测定的步骤，具体包括: (1)取所述塞北紫堇药材细粉8-12重量份，加入50体积份的氯仿-氨水混合溶液，其中所述氯仿-氨水混合溶液中氯仿与氨水的体积份数比为100:1，称定塞北紫堇药材细粉和氯仿-氨水混合溶液的总重量，超声30min，放置10-15h，过滤，得到第一残渣和第一滤液； (2)向所述第一残渣中加入40-60体积份的所述氯仿-氨水混合溶液，振摇I小时，过滤得到第二残渣和第二滤液，所述第二残渣使用所述氯仿-氨水混合溶液洗涤若干次，其中若干次洗涤后的所有洗液备用，每次洗涤使用的所述氯仿-氨水混合溶液为15体积份； (3)合并步骤(1)和(2)中得到的第一滤液、第二滤液及所有洗液，低温减压蒸干得到第三残渣，向所述第三残渣中加入10体积份的乙醇使溶解，并加入I重量份的活性炭，振摇脱色lOmin，过滤后，得到最终滤液； (4)量取5个体积份的所述最终滤液至锥形瓶中，加入15体积份的浓度为0.01mol/I硫酸滴定液、15体积份的水与3滴甲基红指示液,使用浓度为0.02mol/l氢氧化钠滴定液滴定至黄色，其中每Iml浓度为0.01mol/l硫酸滴定液相当于7.07mg的原阿片碱(C20H19N05)；所述重量份与体积份的关系为g/ml的关系。
4.根据权利要求3所述的塞北紫堇药材的鉴定方法，其特征在于，所述塞北紫堇药材中的总生物碱含量测定，包括如下步骤， (O取所述塞北紫堇药材细粉10g，加入50ml的氯仿-氨水混合溶液，其中所述氯仿-氨水混合溶液中氯仿与氨水的体积份数比为100:1，称定塞北紫堇药材细粉和氯仿-氨水混合溶液的总重量，超声30min，放置过夜，过滤，得到第一残渣和第一滤液； (2)向所述第一残渣中加入50ml的所述氯仿-氨水混合溶液，振摇I小时，过滤得到第二残渣和第二滤液，所述第二残渣使用所述氯仿-氨水混合溶液洗涤3次，其中3次洗涤后得到的3次洗液备用，每次洗涤使用的所述氯仿-氨水混合溶液为15ml ； (3)合并步骤(1)和(2)中得到的第一滤液、第二滤液及所有洗液，低温减压蒸干得到第三残渣，向所述第三残渣中加入IOml的乙醇使溶解，并加入Ig活性炭，振摇脱色lOmin，过滤后，得到最终滤液； (4)量取5ml的所述最终滤液至锥形瓶中，加入15ml的浓度为0.01mol/l硫酸滴定液、15ml水与3滴甲基红指示液,使用浓度为0.02mol/l氢氧化钠滴定液滴定至黄色,其中每Iml浓度为0.01mol/l硫酸滴定液相当于7.07mg的原阿片碱(C20H19N05)。
5.根据权利要求3或4所述的塞北紫堇药材的鉴定方法，其特征在于，干燥的塞北紫堇药材中，以原阿片碱(C20H19N05)计，其总生物碱的含量不小于1.9mg/g。
【文档编号】G01N30/06GK103630637SQ201310680124
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】孙绪丁, 李怀平, 赵艳霞, 杨文钰 申请人:山东阿如拉药物研究开发有限公司