一种燕窝鉴定方法
【专利摘要】本发明提出了一种燕窝鉴定方法。其特征在于采用核磁共振检测。步骤为，前处理待鉴样品：将待鉴样品研磨成细粉，将细粉加含10%以上氘带水的1%磷酸水溶液，在沸水中水浴加热，冷却后离心；取上清液至5mm核磁管中，将核磁管加封；设置技术参数，通过核磁共振仪采集样品的1H-NMR谱图；通过燕窝和待鉴样品的1H-NMR谱图对比，判断燕窝的真伪。方法简单易于操作，对分析样品称量无需非常精确，前处理可以一批同时进行，将燕窝水解后直接对混合物进行核磁检测得到核磁共振氢谱；精确度高，速度快，采样时间短；数据分析简单。
【专利说明】一种燕窝鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及燕窝的鉴定方法，尤其涉及一种核磁共振检测燕窝的方法。
【背景技术】
[0002]核磁共振作为一种重要的现代科学技术手段，以强大的结构解析能力确定了其在现代仪器分析中的地位，被广泛应用于化学、医学、药学、环境科学、生物，食品科学等众多领域。但核磁共振一直以来因为相对其他化学分析仪器检测灵敏度不高而受人诟病。近年来，随着磁场强度的提高、高灵敏探头的出现、谱仪与实验方法的改进，核磁共振的检测灵敏度得到了大幅度提高，已不再是制约核磁共振应用的一个关键因素。Malz等就线性、稳定性、专属性、选择性和准确性等定量分析的基本问题对定量核磁共振方法(qNMR)进行了系统的考察分析，并组织了多家国际上高水平的实验室对3个实际样品进行了比对分析，结果表明以氢谱核磁共振(IHNMR)为基础建立的核磁共振定量分析方法的不确定度小于
1.5%，完全可以同HPLC等经典定量分析方法媲美。从实验原理、设备功能和方法学等角度分析，核磁共振技术均能满足定量分析要求，完全可作为日常食药真伪鉴定分析的一种常规检测手段。
[0003]利用核磁共振技术对食品和药品的真伪鉴定主要包括几个优势:1)样品前处理简便:核磁共振样品预处理环节少，操作简便，能大大缩短实验周期。2)实验高效快速:NMR实验可以同时提供物质结构和含量信息，因此鉴定和检测可同步进行。3)对有机物的普适性:核磁共振实验是一种无偏向性的测试方法，能同时分析鉴定混合物中的多种组分，为定量分析中基准物的选择提供了较为宽松的空间；4)异构体分析能力强:核磁共振对异构体独特的识别能力是许多测试技术所不能比拟的。
[0004]目前燕窝真伪鉴定方法主要是经验鉴别法、显微鉴别法(主要通过燕窝和常见掺假物如猪皮，琼脂，树胶，白木耳等的显微特征的不同来鉴别燕窝的真伪)和仪器鉴别法。仪器鉴别法主要包括了凝胶电泳法(根据天然燕窝特有的谱带来区别不同的燕窝)、红外光谱法(主要是通过红外光谱法来建立燕窝的特征谱图。不同的燕窝都有自己的特征图谱，可通过比较谱图吸收峰的波数位置和相对峰强度的差异来鉴定燕窝的真伪)、气相色谱法(通过测定燕窝中氨基酸的总含量、组成以及某些氨基酸在掺假物中比例的变化进行鉴别。)、液相色谱法(通过测定经水解后燕窝中特征物质-唾液酸来检测)、分光光度法(利用乙酸酸水解燕窝中的唾液糖蛋白成唾液酸来进行检测)等。这些方法中有的准确性不高，灵敏度低；有的提取纯化程序冗长，重现性不好，造假者在假燕窝中添加某一唾液酸，便可蒙混过关。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于以燕窝为研究对象，建立一种基于核磁共振氢谱(1H-NMR)与模式识别方法相结合的指纹识别分析方法，用于鉴别真假燕窝。
[0006]为实现上述目的，本发明提供一种燕窝鉴定方法，其特征在于，采用核磁共振检测。[0007]进一步的，所述鉴定方法为包括如下步骤，
前处理待鉴样品:将燕窝和待鉴样品研磨成细粉，将细粉加含10%以上氘带水的1%磷酸水溶液，在沸水中水浴加热，冷却后离心；取上清液至5 mm核磁管中，将核磁管加封；设置技术参数，通过核磁共振仪采集样品的IH-NMR谱图；
数据分析:通过燕窝和待鉴样品的IH-NMR谱图对比，判断燕窝的真伪。
[0008]进一步的，所述前处理为将燕窝和待鉴样品研磨成细粉，分别称取10到20mg细粉加含10%以上氘带水的1%磷酸水溶液I mL，在沸水中水浴加热20min，冷却后离心；各批样本离心后取上清液400到900 μ L，转移至5 mm核磁管中，将核磁管密封。
[0009]所述细粉的粒径为500微米以下。
[0010]所述离心条件为3000到20000rpm，5分钟。
[0011]所述技术参数为:以90% H2O + 10% D2O或D2O锁场,使用脉冲序列noesygpprld(654.7处压制水峰，试验温度为25°C ;谱宽SffH 15000.00Hz，采样数据点TD 32768，扫描次数NS 32次，延迟时间Dl 2 S，接收增益RG 203。
[0012]所述核磁共振仪为300兆以上的核磁共振波谱仪。
[0013]所述数据分析为对待鉴样品所得IH-NMR数据经傅立叶变换得到谱图，然后调整相位并进行基线校正；将d0.3^4.6范围内的谱按照每段0.004到0.04 ppm进行分段积分；将积分按每张谱的总积分强度归一化；所得数据输出并转换到Excel文件保存；然后输入到SMCA-P软件进行多元统计分析；分析前先对数据进行平均中心化处理和Pareto标度处理；采用主成分分析法PCA对数据进行分析处理；分段积分值作为自变量(X)，样本的分类变量作为因变量(Y);分析结果以前两个主成分(PC) t (I) /t (2)作得分图，与正品燕窝的数据聚在一起的就是正品燕窝，能明显区分开来`的就不是正品燕窝。
[0014]本发明应用核磁共振氢谱法测定燕窝中的总提取物，前处理方法简单，检测速度快，不同来源的燕窝样品的IHNMR指纹图谱具有很好的重现性和高度的特征性。
[0015]燕窝核磁共振指纹图谱是一种综合的、整体的鉴定手段，其应用在于鉴别真伪，并还可评价燕窝质量均一性和稳定性，其基本属性是“整体性”和“模糊性”。核磁共振具有高度的重现性和特征性，易于解析和进一步研究，这是其他光谱学方法无可比拟的。本发明运用核磁共振技术对燕窝进行指纹图谱研究，探索简便易行的指纹图谱分析方法。通过不同燕窝图谱相似度分析，表明工艺流程稳定，重现性良好。核磁共振技术可以作为燕窝指纹图谱研究的辅助方法来鉴别燕窝。
[0016]IHNMR是有机化合物结构鉴定的强有力手段之一，将其用于燕窝鉴定是继紫外和红外等光谱指纹图谱之后的新尝试。因燕窝是分子量较大的唾液糖蛋白，并不适合用核磁共振进行直接检测，若直接进行核磁检测则耗时并难以解析，本发明选择适当的水解分离方法，将唾液酸从唾液酸糖蛋白的结合状态游离出来，获取燕窝特征性化学成分水溶性总提取物(燕窝特定的小分子水解产物)，通过对燕窝水解产物进行整体分析，测定其IHNMR指纹图谱。图谱具有特征性，如人的指纹一样，没有混淆的余地，具有唯一性。若要将其特征物质衍生化或分离提纯进行分析，将增添繁重的前处理工作。本发明中将这些总提物进行整体分析，可以反映燕窝的更为全面的特征，使得前处理大大简化，加快了实验进程，准确性和灵敏度也有较大的提高。经过多次提取和多次测试，每次的谱图都十分吻合，说明重现性很好。得到的燕窝特征提取物核磁共振指纹图谱，可以成为燕窝产品的鉴定依据之一。
[0017]本发明燕窝的鉴定方法需要对样品进行简单的前处理，然后进行核磁谱图的采集，其特点是谱图采集(采样时间几分钟)及分析时间短，只需比对特征指纹谱便可知燕窝真伪。
[0018]燕窝所含主要特征成分唾液酸具有特定构型和种类，见图3，其中R为多种不同取代基团。唾液酸根据5位碳上R基团的不同可分为四类:即N-乙酰神经氨酸，N-羟乙酰神经氨酸，去氨基神经氨酸和神经氨酸。燕窝中唾液酸以N -乙磨神经氨酸和N -轻乙磨神经氨酸形式为主。通过核磁共振波谱的方法可以很好地反映化合物的结构信息，并非只针对其中一种唾液酸进行测定，这是其它仪器所不可比拟的。而核磁共振氢谱法对燕窝样品中总提取物进行整体分析，燕窝作为一个唾液糖蛋白混合物具有多种化学成分，所含的唾液酸也不是单一种的唾液酸，这些特征的化学成分相对之间的含量比例是基本固定的。因此提出以燕窝特征性总成分为基础的提取物鉴定方法，特征总提取物的IH NMR指纹图谱与燕窝间存在着严格的对应关系，通过IHNMR指纹图谱分析，可以达到快速准确鉴别真假燕窝的目的。
[0019]同现有技术比较，本法不仅省去了唾液酸衍生化的过程，实验操作简便，而且具有稳定性及重复性好、灵敏度高等特点，对所有组分的灵敏度一致，无偏向性。同时，IH-NMR指纹图谱还可以提供化学位移、偶合常数、峰裂分情况以及峰面积等大量重要的结构信息。能够准确地反映出燕窝中多种唾液酸的信息，可以用作燕窝质量标准的定性定量方法。
[0020]本发明建立了一种基于IH-NMR的指纹识别分析方法，旨在从化学组成方面快速、简单地区分真假燕窝，为燕窝的质量控制和鉴定提供新思路。
[0021]与传统检测方法相比，本方法具有以下优点:实验步骤简单:样品无需准确称量定量，归一化和标准化可以去除样品间的差别；将燕窝水解，得到几种唾液酸、柠檬酸等水溶性混合物，不分离直接对混合物进行核磁检测。得到核磁共振氢谱，谱图反映了水解产物的总体特征，从整体上，多组分来作为燕窝的鉴别标志。2.精确度高，图谱采集、处理以及数据分析均有计算机完成，避免人为误差的干扰。3.速度快，采样时间短，只需几分钟。检测时可以仅对检测样品进行测试，带入数据库进行比对，检测速度快，只需几分钟就可以完成，大大减小了工作量。4、方法简单易于操作，对分析样品称量无需非常精确，前处理可以一批同时进行。5、数据分析简单，主成分分析结果只需肉眼观察，与正品燕窝聚集在一起的是真燕窝，远离正品燕窝的为假燕窝。具有单一性、全面性、易辩性的特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为正品燕窝指纹IH氢谱图；
图2是10个样品的指纹IH氢谱图；
图3为唾液酸的结构式图；
图4为用PCA进行模式识别的得分图；
图5是中南马区毛燕的IHNMR谱图；
图6是东海岸毛燕的IHNMR谱图；
图7是东马区毛燕的IHNMR谱图；
图8是北马区毛燕的IHNMR谱图； 图9是印尼血燕的IHNMR谱图；
图10是印尼毛燕的IHNMR谱图；
图11是假白燕的IHNMR谱图；
图12是猪皮的IHNMR谱图；
图13是琼脂的IHNMR谱图；
图14是白木耳的IHNMR谱图。
【具体实施方式】
[0023]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0024]实施例1:核磁共振鉴定燕窝 材料与试剂:
氘代水(阿达玛斯，瑞士)，磷酸(分析纯，国药集团)，试验样品:中南马区毛燕、东海岸毛燕、东马区毛燕、北马区毛燕、印尼血燕、印尼毛燕、假白燕、假血燕均由厦门出入境检验检疫局提供；琼脂、白木耳和猪皮。试验样品均可以市面上购得。
[0025]仪器:
AVANCE III 600超导核磁共振波谱仪(布鲁克，瑞士)，电子天平(精确到0.0OOlg ；Sartorious,德国)，电热炉(朝凤CL-200,中国江苏)。
[0026]前处理:
将上述10种样品分别研磨成细粉(粒径500微米以下)，取10到20mg细粉于1.5mL离心管中，加I mLl%磷酸水溶液(含10%以上氘带水)，在沸水中水浴加热20min，冷却后离心(3000到20000rpm)。各批样本离心后取上清液600 μ L，转移至5 mm核磁管中，将核磁管加封，直接用于IH-NMR测试。
[0027]测定条件:
AVANCE III 600超导核磁共振波谱仪(质子激发频率:600.13 MHz )，配置BBO正相观察宽带探头和BVT3200数字控温仪(瑞士 Bruker公司)。氘带水(D2O,氘代度> 99.8%，美国Norell公司)
IH-NMR测试在所有样品测试中使用统一的实验参数。以90% H2O + 10% D2O锁场，使用脉冲序列noesygpprld在δ 4.7处压制水峰，试验温度为25°C ;主要参数:谱宽(SWH)15000.00Hz，采样数据点(TD) 32768，扫描次数(NS) 32次，延迟时间(Dl) 2 S，接收增益(RG) 203。
[0028]2.3谱图处理与分析
对上述所得NMR数据经傅立叶变换得到谱图，然后调整相位并进行基线校正。化学位移在0.3?4.6范围内的谱按照每段0.01 ppm进行分段积分。积分值按每张谱的总积分强度归一化。所得数据输出并转换到Excel文件保存，然后输入到SIMCA-P+12.0软件进行多元统计分析。分析前先对数据进行平均中心化处理和Pareto标度处理。采用主成分分析法(PCA)对数据进行分析处理。分段积分值作为自变量(X)，样本的分类变量作为因变量(Y)。分析结果以前两个主成分(PC)t(l)/t(2)作得分图(如图4)。
[0029]实验结果:
不同来源燕窝和假燕窝的区分
得到的指纹1H氢谱结果见图1、2，5-14。其中图1为正品燕窝指纹1H氢谱；在图1中，横坐标为化学位移；化学位移0.3到4.6ppm区间的峰为燕窝的特征指纹峰。图2自上而下分别为1,2,3、4、5、6、7、8、9、10号样品的指纹1H氢谱；横坐标为化学位移；1到6号正品燕窝指纹谱峰中化学位移0.3到4.6ppm区间的峰为燕窝的特征指纹峰。样品具体信息:1号(中南马区毛燕)，2号(东海岸毛燕)，3号(东马区毛燕)，4号(北马区毛燕)，5号(印尼血燕)，6号(印尼毛燕)，7号(假白燕)，8号(猪皮)，9号(琼脂)，10号(白木耳)。从10个IHNMR图谱(图5-14)可以看出，第1、2、3、4、5、6号样品具有较高的相似度，同时从图4中可以看到正品燕窝集聚一个小的范围内，7号样品假白燕、8号样品猪皮、9号样品琼脂、10号样品白木耳的共振峰差异性巨大，在图4中呈分散分布，且远离正品燕窝。可以作为辨别燕窝真假的依据。正品燕窝化学位移S 2.7-2.9的共振峰是柠檬酸的指纹图谱，可能是由于燕子唾液中本身含有少量柠檬，筑巢时混入燕窝中。因其在燕窝的水解产物中稳定存在，因此将其一并列为真假燕窝辨别的特征指纹。
[0030]实验比较了不同地区不同种类以及常用掺假材料共10个批次燕窝。PCA是采用线性投影将原来的多个变量空间转换转化成一组新的正交变量的模式识别分析方法，相互正交的新变量称为“主成分”，主要用于对高维数据空间进行降维，从而降低数据的复杂性。以PC1/PC2作图获得PCA得分矩阵图(图4)，获得好的分组信息，使10个燕窝样品中真假燕窝可以明显区分。
[0031]如图4，其中R2X[1]为第一主成分对变量的解释能力，即解释变量的46.18%;R2X[2]为第二主成分对变量的解释能力，即解释变量的33.45%。从图中可以看出，10个批次燕窝核磁氢谱PCA分析结果显示，不同来源的正品燕窝相似度很高，差异性非常小；而假燕窝的IH NMR数据差异性显著。通过PCA分析成功实现了真假燕窝的区分。从得分图可以看到正品燕窝组同假燕窝组能明显区分开来，红圈中是正品燕窝1、2、3、4、5、6，6组数据很好地聚集在一起，假燕窝组数据较为分散，反映了假燕窝取材不是单一品种的。
[0032]可以看出核磁共振结合模式识别的方法能鉴别出真假燕窝，是一种快捷简便的测试方法，且测试结果准确度高，为燕窝分析和品质检测提供了一种快捷的检测方法。
[0033]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【权利要求】
1.一种燕窝鉴定方法，其特征在于，采用核磁共振检测。
2.权利要求1所述的燕窝鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法为包括如下步骤， 前处理待鉴样品:将燕窝和待鉴样品研磨成细粉，将细粉加含10%以上氘带水的1%磷酸水溶液，在沸水中水浴加热，冷却后离心；取上清液至5 mm核磁管中，将核磁管加封； 设置技术参数，通过核磁共振仪采集样品的IH-NMR谱图； 数据分析:通过燕窝和待鉴样品的IH-NMR谱图对比，判断燕窝的真伪。
3.权利要求2所述的燕窝鉴定方法，其特征在于，所述前处理为将燕窝和待鉴样品分别研磨成细粉，分别称取10到20mg细粉加含10%以上氘带水的1%磷酸水溶液I mL，在沸水中水浴加热20min，冷却后离心；各批样本离心后取上清液400到900 μ L，转移至5 mm核磁管中，将核磁管密封。
4.权利要求2所述的燕窝鉴定方法，其特征在于，所述细粉的粒径为500微米以下。
5.权利要求2所述的燕窝鉴定方法，其特征在于，所述离心条件为3000到20000rpm，5分钟。
6.权利要求1所述的燕窝鉴定方法，其特征在于，所述技术参数为:以90%H2O + 10%D2O或D2O锁场,使用脉冲序列noesygpprld在δ 4.7处压制水峰,试验温度为25°C ;谱宽SffH 15000.00Hz，采样数据点TD 32768，扫描次数NS 32次，延迟时间Dl 2 S，接收增益RG 203。
7.权利要求1所述的燕窝鉴定方法，其特征在于，所述核磁共振仪为300兆以上的核磁共振波谱仪。
8.权利要求1所述的燕窝鉴定方法，其特征在于，所述数据分析为对待鉴样品所得IH-NMR数据经傅立叶变换得到谱图，然后调整相位并进行基线校正；将d0.3^4.6范围内的谱按照每段0.004到0.04 ppm进行分段积分；将积分按每张谱的总积分强度归一化；所得数据输出并转换到Excel文件保存；然后输入到SIMCA-P软件进行多元统计分析；分析前先对数据进行平均中心化处理和Pareto标度处理；采用主成分分析法PCA对数据进行分析处理；分段积分值作为自变量(X)，样本的分类变量作为因变量(Y);分析结果以前两个主成分(PC) t (I)/t (2)作得分图，与正品燕窝的数据聚在一起的就是正品燕窝，能明显区分开来的就不是正品燕窝。
【文档编号】G01N24/08GK103698353SQ201310742605
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】徐敦明, 黄慧英, 高志亮, 吴敏, 周昱 申请人:厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心