作为标记物用于预测骨折延迟愈合的cd8+t细胞亚群的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于诊断骨折延迟愈合的方法，包括在从个体获得的样品中，测定选自由CD8+CD57+、CD8+CD28-和CD8+CD28-/CD57+组成的第一组的CD8+细胞亚群的频率。本发明还涉及用于预测骨折延迟愈合的系统和成套试剂盒和由此所得的用于预防骨折延迟愈合的选项。
【专利说明】作为标记物用于预测骨折延迟愈合的CD8+T细胞亚群
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于预测和预防骨折延迟愈合的方法、系统和试剂盒。
【背景技术】
[0002]骨折愈合是具有连续的重叠阶段的生理过程，并导致骨组织的修复。然而由于某些风险因素，如严重骨折、高龄、类固醇治疗或糖尿病，这个过程会被延迟或甚至不完整(骨折不愈合)，带来差的长期疗效和高社会经济影响。在长骨骨折的患者中可以观察到约5-10%的患者愈合延迟或不完整。
[0003]在有关不良愈合背后的机制方面只有有限的认识。有越来越多的证据表明，炎症和T细胞应答在伤后骨修复过程中起到关键作用，其中T细胞应答影响如趋化性、导致刺激血管生成的其他免疫和间充质细胞的募集以及最终细胞外基质合成的增强的一系列过程(Schmidt-Bleek et al., J Orthop Res.；27 (9):1147-51 ；Kolar et al., Tissue Eng PartB Rev.;16(4):427-34 ;Toben et al.J Bone Miner Res.，Jan ;26 (I):113-24)。
[0004]最近的数据显示，虽然矿化作用不如对照组有效，但缺乏适应性免疫的小鼠出人意料地表现出增强的骨愈合(Colburn et al.Arthritis Rheum.;60 (6): 1694-703 ;Schmidt-Bleek et al.Cell Tissue Res ；D0I10.1007/s00441-011-1205_7)。此外，由于用具有高旋转不稳定性的机械临界外固定器(mechanically critical external fixator)进行处理，与严格固定的动物相比，在经历延迟/受损愈合的羊中发现血肿内细胞毒性T细胞百分比明显更高。
[0005]已对骨钙素和骨碱性磷酸酶作为预测标记物用于骨折延迟愈合进行了研究。然而，不早于骨折发生后42天内，只有骨钙素显示出了患者正常愈合和骨折延迟愈合之间的细微差别。此外，已讨论转化生长因子β UTGF-β I)作为另一种潜在的生物标记物。检查显示，骨折4周后，骨折延迟愈合的患者的TGF-β I水平比显示正常愈合的患者的水平低。然而，由于高的内-间患者变异性(intra-1nter patients variability)、细胞因子的短半衰期和在骨折愈合过程中迟的预测时间点，这些参数对骨愈合的预测仅具有有限的效度。
[0006]对于预测骨折后结果以尽可能早地实施支持疗法的生物标记物如生长因子如BMP(骨形态发生蛋白)有未满足的需求，这些生物标记物是昂贵的且并非没有副作用。
[0007]本发明的目的是提供用于预测延迟的骨折的装置和方法。
[0008]本发明是在评估在愈合过程中临床相关性的典型时间点上胫骨近端骨折患者的外周血中炎症反应和免疫细胞组成的研究过程中完成的。对在涉及延迟愈合的骨折愈合过程中外周血中免疫细胞组成的相关差异进行了鉴定。
[0009]总T细胞计数(⑶3+)或主要亚群分布(⑶3+4+和⑶3+8+)没有表现出组(正常与延迟愈合)之间的差异。然而，令人惊奇地发现，延迟愈合与表达表型⑶8+1 la++28-和/或CD8+lla++57+和/或CD8+lla++CD28_57+的终末分化CD8+效应T细胞的显著提高的频率有很大关联，CD8+效应T细胞对应于在受伤/手术后不同的时间点上(〈I周至>18周)的⑶8+TEMRA细胞(⑶57+8+延迟愈合相对于正常情况:1.6-1.8倍，⑶28-8+延迟愈合相对于正常情况:1.5-1.6倍1++8+延迟愈合相对于正常情况:1.2-1.3倍)。CD8+TEMRA细胞也表达了标记表型CCR7-⑶45RA+⑶45R0-。这种差异在18周的跟踪调查期间是稳定的，反映出对于骨折的个体免疫经历而非创伤后反应。
[0010](D8+TEMRA细胞的特点在于其(炎症)组织返回性能(tissue homing property)和强大的旁观者反应(bystander responsiveness)。它们也可以通过细胞因子,如IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、IL-23或TNFa，独立于其T细胞受体(TCR)以抗原非依赖性方式触发。由于toll样受体分子(TLR)和损伤相关分子模式(DAMP)之间的相互作用，这些细胞因子通过在骨折血肿中触发的先天免疫系统的细胞传递。此外，巨噬细胞和树突状细胞可通过这些⑶8+TEMRA细胞触发炎症细胞因子(如IFN-Y)的释放，这些细胞因子支持了压倒性的炎症和纤维变性，并抑制骨生成。此外，这些细胞在慢性免疫激活状态中，例如在感染性疾病，如HIV，结核病或巨细胞病毒疾病中被上调。
[0011]另一个惊人的发现是，在外周血中⑶3+T细胞的另一个小亚群，即所谓的双阳性⑶4+8+T细胞的频率也在延迟愈合的患者中提高。
[0012]根据本发明的第一个方面，提供了用于对骨折延迟愈合进行预后的离体方法，包括在从个体获得的样品中，测定选自由CD8+CD57+细胞、CD8+CD28-细胞和/或⑶8+⑶28-⑶57+细胞所组成的第一组的⑶8+T细胞亚群的频率。
[0013]根据本发明所述第一方面的一种替代方案，提供了用于对骨折延迟愈合进行预后的离体方法，包括在从个体获得的样品中，测定选自由CD8+CD1 la+CD57+细胞、⑶8+⑶IIa+⑶28-细胞和/或⑶8+⑶IIa+⑶28-⑶57+细胞所组成的第一组的⑶8+T细胞亚群的频率。
[0014]在一些实施方案中，所述样品是血液样品，特别是从外周血中，或者从一个骨折附近区域中获得的活检样品中，特别是从炎症性骨折血肿周围获得的血液样品。
[0015]在一些实施方案中，本发明的方法用于预测骨折后的结果或用于将来自个体的样品分级，其中所述样品被指定为骨折后可能的结果。
[0016]在本发明意义上的频率指的是相对于全部可定义的群的细胞数，通过呈现于这些细胞的表面上的某些标记分子定义的细胞数目。例如，⑶3+细胞的⑶8+⑶4+亚群的5%的频率表示全部⑶3+细胞的5%属于⑶8+⑶4+亚群。
[0017]在一些情况下，在本文中，细胞可通过以缩写形式表示分化阳性/阴性群集的方式来表征:⑶4+8+与⑶4+⑶8+含义相同。
[0018]通常，对于本文所公开的方法，一个给定的亚群的频率是相对于样品中亲本群(如在每个表中分别表示的CD3+或CD8+细胞)的总数确定的。
[0019]如果任何细胞群相对于本文的某些标记分子被指定为“阳性”，则该指定是指，所述细胞群可以通过针对该标记分子的一个常见的荧光染料标记的抗体进行染色，并且相对于未标记的细胞或用相同的抗体标记但通常认为不表达所述标记分子的细胞或用同种型控制抗体标记的细胞，其会给出至少一个，两个或三个对数更高强度的荧光信号。反之亦然，相对于某些标记分子被指定为“阴性”的任何细胞群不能被针对该标记分子的上述荧光染料标记的抗体染色。相对某些标记分子被指定为“双阳性”或“++”的细胞是指，表现出高表达该特定标记分子的细胞，其通过电子栅(electronic gating)可被分离作为一个独特的亚群。“++”细胞给出的荧光信号明显强于在单一阳性“ + ”栅下端的细胞给出的荧光信号。“++”事件通常可以作为独特的群集被区分。对于给定的标记物，双阳性“++”细胞是该标记物的阳性“ + ”群的一部分。图12显示出⑶8/⑶11阳性和双阳性细胞的直方图:在两个示例直方图中环绕的所有⑶Ila阳性细胞中，那些在垂直条右边的细胞构成了 “++”群。
[0020]在一些实施方案中，本发明的方法包括:测定选自由⑶8+⑶11a++、CD8+CDlla++CD28-、CD8+CDlla++CD57+ 和 CD8+CDlla++CD28_CD57+T 细胞所组成的第二组的亚群的频率。
[0021]在一些实施方案中，本发明的上述方面和实施方案的方法还包括测定⑶3+细胞的⑶8+/⑶4+亚群的频率。
[0022]本发明方法的预测值或判别值可通过如上所述测定额外的亚群的频率进行增强。额外的亚群的频率可以连续或同时测定。优选同时测定。
[0023]在一些实施方案中，所述方法还包括测定外周血中IL-6的水平。因此，上述方面和实施方案的方法的预测值还可以通过测定作为全身性炎症的免疫学标记物的IL-6得到进一步加强。根据上述实施方案，所述水平可表示为浓度，并可以以如pg/ml或mol/Ι的单位测定。
[0024]在一些实施方案中，本发明的方法通过以下方式进行:使样品与第一配体接触，并测定呈递标有第一配体的所述标记分子的细胞的频率或测定结合到所述标记分子的第一配体的频率，所述第一配体与选自由⑶4(Uniprot ID P01730)、Q)lla(Uniprot IDP20701)、CD28 (Uniprot ID P10747)、CD57 和 IL-6 (Uniprot ID P05231)所组成的标记物组的标记分子特异性反应。
[0025]在一些实施方案中，第一配体选自由抗体、抗体片段、抗体样分子、6-30个氨基酸的寡肽和长度为10-75个核苷酸的核酸适体分子所组成的组，其中所述配体能够以10_8mol/l或更小的解离常数结合前述段落中描述的标记物组中的成员。
[0026]在一些实施方案中，所述抗体片段是抗体的Fab结构域(抗体的抗原结合区)或单链抗体(scFv)、由通过肽连接体连接的抗体的轻链或重链的可变区所组成的融合蛋白。抗体片段或抗体样分子可以通过合适的方法，例如重组蛋白质表达来制备。
[0027]第一配体也可以通过演化方法，如噬菌体展示，核糖体展示或SELEX方法开发，其中多肽或寡核苷酸根据它们对目的靶标的结合亲和力来选定。此外，较高的亲和力的抑制剂可以通过重复演化和选择氨基酸序列或核苷酸序列的循环来识别。
[0028]在一些实施方案中，如上面提到的6-30个氨基酸的寡肽是衍生自部分配体的肽，其被上述的标记物组的成员识别。
[0029]在一些实施方案中，被上述的标记物组的成员识别的配体选自⑶80 (UNIPROT编号 P33681)或 CD86 (UNIPROT 编号 P42081)，其是 CD28 或 CD54 的配体(UNIPROT 编号P05362)，⑶54的配体是⑶IIa配体。
[0030]在一些实施方案中，第一配体是对⑶4、⑶I la、⑶28、⑶57有反应性的抗体，并且进一步包括用于光学检测的荧光部分，其中，前述段落中的标记分子结合至该抗体，并且呈递该标记分子的细胞可以通过基于荧光的流式细胞术方法如荧光激活细胞分选进行计数。
[0031]在一些实施方案中，第一配体是对IL-6有反应性的抗体，并且可以包含酶活性，其中，这种酶活性是可利用光谱观察到的催化反应。
[0032]在一些实施方案中，第一配体被第二配体特异性结合，其中所述第二配体包含酶活性或荧光部分。
[0033]多个不同的标记分子可通过使用多个不同的第一配体来测定，其中，每个配体特异性结合特定的标记分子。
[0034]在一些实施方案中，多个第一配体中的每个都包含如上所述的某种酶活性或荧光部分，从光谱上可以将其与多个第一配体中的每个其他第一配体的酶活性或荧光部分区分。
[0035]在一些实施方案中，每个第一配体结合特定的具有某种酶活性或荧光部分的第二配体，从光谱上可以将其与每个其他第二配体的酶活性或荧光部分区分。
[0036]在一些实施方案中，一个第一和第二配体或多个第一和第二配体是抗体，并用于酶联免疫吸附试验中。
[0037]在一个实施方案中，本发明的前述方面的亚群频率是通过在流式细胞术检测中对标有针对选自⑶4、⑶8、⑶11a、⑶28和⑶57的标记分子的荧光抗体的细胞进行计数来测定。
[0038]在一个实施方案中，所述方法进一步包括根据本发明的上述方面测定个体的Calori 分数。
[0039]就本发明的意义而言Calori分数是骨折不愈合即骨折后愈合的永久性失败的度量，并且可以通过评价相关骨折愈合因素如骨质量、骨校准、初级干预的侵入力和临床感染状态的方法来测定。显示比标准至少高5%的Calori分数的个体被归为骨折延迟愈合概率提高的组。该方法的详细说明见于Calori et al.，Injury, 39，Supp2, S59-63, 2008。
[0040]在一个实施方案中，所述方法还包括相对于标准来比较测定的频率、水平或Calori 分数。
[0041]就本发明的意义而言标准指个体呈现出骨折正常愈合或骨折愈合不延迟的样品。可替换地，该标准可以是呈现出正常骨折愈合的个体。特别是，如果下列标准均不符合，则个体的骨折愈合被认为是正常的:
[0042]i)基于骨痂形成，术后12周后骨折愈合不完全，
[0043]ii)术后12周后骨折愈合不完全，并具有大于Imm的骨折缝隙，
[0044]iii)存在吸收区或骨痂形成不完全，
[0045]iv)桥接不完全,这意味着1-3个皮层桥接，
[0046]V)没有桥接,这意味着未桥接皮层。
[0047]根据优选的实施方案，相比显示正常骨折愈合的患者数(回顾性)测定的标准，显示两倍高频率的CD8+/CD4+细胞的样品被归为骨折延迟愈合概率提高的组。
[0048]在一些实施方案中，相比显示正常骨折愈合的患者数(回顾性)测定的标准，显示T细胞⑶I la++、⑶28-或⑶57+的频率至少高出10%的样品被归为骨折延迟愈合概率提高的组。
[0049]在一些实施方案中，对于⑶8+T细胞的⑶28-或⑶57+细胞，显示至少30%的频率的样品被归为骨折延迟愈合概率提高的组，对于⑶8+T细胞的⑶IIa++细胞，显示至少65%的频率的样品被归为骨折延迟愈合概率提高的组，以及CD8+T细胞的CD4+细胞，显示至少5%的频率的样品被归为骨折延迟愈合概率提高的组。
[0050]在一些实施方案中，本发明的方法还包括测定⑶4+T细胞亚群的频率，其中该亚群选自⑶4+⑶57+细胞和⑶4+⑶28-细胞。
[0051]根据本发明的另一方面，提供了诊断骨折延迟愈合的系统，包括:
[0052]-用于测定个体的样品中细胞群或IL-6的频率的装置，以及
[0053]-程序化微处理器，
[0054]其中配备程序化微处理器装配并指定其运行本发明上述方面和实施方案的方法。
[0055]在一些实施方案中，所述装置是流式细胞分析仪，其包括用于运输和调整细胞的流通池、光源如激光，和适用于测量光或其他生物物理参数如阻抗的检测器。该装置可用于根据本发明的以上方面和实施方案测定CD8+细胞亚群的频率。
[0056]在一些实施方案中，所述装置可以是分光光度计或酶标仪，其包括保持样品的腔室如小池或微量滴定板、光源和适用于测量荧光吸收率的UV/Vis检测器，如二极管。
[0057]在一些实施方案中，该装置用于根据本发明的以上方面或实施方案测定IL-6的水平。
[0058]在一些实施方案中，将程序化的微处理器集成于前面段落中所述的装置中，或者其是用于操作装置的控制单元或计算机的一部分。
[0059]在一些实施方案中，配备上述装置并指定其根据本发明的上述方面和实施方案测定⑶8+T细胞亚群的频率。
[0060]根据发明的另一方面，提供了用于诊断骨折延迟愈合的成套试剂盒，其包括抗CD8抗体、抗CD4抗体、抗CDlla抗体和抗CD28抗体，其中上述抗体适用于基于荧光的流式细胞术。
[0061]在一个实施方案中，所述试剂盒还包括抗⑶57抗体。
[0062]在一些实施方案中，本发明的上述方面的抗体为鼠源单克隆抗体，并包括用于在流式细胞术中光学检测的荧光部分，如APC (别藻蓝素)、FITC (异硫氰酸荧光素)或PE (藻红蛋白)。
[0063]在一些实施方案中，所述抗体选自包括以下的组:PE_Cy7缀合的小鼠抗人CD4IgGl (缀合PE-Cy7(花青染料)串联荧光体的鼠单克隆抗体)、APC_Cy7标记的鼠抗人CD8IgGl (缀合串联荧光体APC-Cy7的鼠单克隆抗体)、FITC标记的小鼠抗人CD57IgM(鼠单克隆抗体)、APC-H7小鼠抗人CD28IgGl (缀合串联荧光体APC-H7 (其为APC_Cy7的类似物，并具有相同的光谱特性)的鼠单克隆抗体)，以及FITC标记的小鼠抗人CDlla(抗LFA-1 α，白血球功能相关的抗原-1，α多肽)IgG2a(鼠单克隆抗体)。
[0064]根据本发明的另一方面，提供了用于治疗骨折延迟愈合的方法的IFN-y (UniprotP01579)和 TNF-a (UniprotP01375)抑制剂，其中该抑制剂为 IFN-Y 或TNF-α的配体，并选自包括以下的组:抗体、抗体片段、抗体样分子、可溶受体构建体、6-30个氨基酸的寡肽、和长度为10-75个核苷酸的适体分子、IFN-y或TNF_a分泌抑制剂(例如s1-RNA或小分子，如钙调神经磷酸酶抑制剂)，并且其中该配体(抑制剂)能够以1-Smol/I或更低的解离常数选择性地结合IFN-Y或TNF-α，并且其中IFN-Y或TNF-α的配体(抑制剂)另外能够消除或抑制IFN-Y或TNF-α的生物作用。
[0065]在本发明这一方面的一些实施方案中，该抑制剂是抗IFN-Y或TNF-α的单克隆抗体。在一个实施方案中，该抑制剂是抗IFN-Y或TNF-α的嵌合、人源化或人的单克隆抗体。
[0066]在本发明这一方面的抑制剂为抗体片段的一些实施方案中，抑制剂为抗IFN-Y或TNF- α的抗体的Fab结构域(抗体的抗原结合区)，或者是单链抗体(scFv)，即由肽连接体连接的抗体的轻链和重链的可变区组成的融合蛋白。抗体片段或抗体样分子可以通过合适的方法，例如重组蛋白质表达来制备。
[0067]在一个实施方案中，该抑制剂是连接选择性结合IFN- Y或TNF- α的抗原结合结构域与人免疫球蛋白的Fe结构域的嵌合构建体。该构建体的一个实例为药物依那西普(CAS N0.185243-69-0)。
[0068]本发明的这一方面的抑制剂也可以通过演化方法，如噬菌体展示、核糖体展示或SELEX方法进行研发，其中根据对IFN-Y或TNF-α的结合亲和力来选择多肽或寡肽。在一些实施方案中，如上面提到的6-30个氨基酸的寡肽是衍生自IFN-Y或TNF-α的生理结合伴侣的一部分的肽，其选择性地被IFN-Y或TNF-α识别。在一些实施方案中，通过s1-RNA或小分子药物，如钙调神经磷酸酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂，可以阻断IFN-Y或TNF-a的合成。
[0069]根据本发明的另一方面，提供了用于处理或治疗骨折延迟愈合的方法中的⑶8+细胞抑制剂。在一种替代方案中，这种CD8+细胞抑制剂是CD8的配体，并选自包括以下的组:抗体、抗体片段、抗体样分子、6-30个氨基酸的寡肽，和长度为10-75个核苷酸的适体分子，并且其中该配体(抑制剂)能够以10-Smol/l或更低的解离常数选择性地结合CD8，并且其中CD8的配体(抑制剂)另外能够消除或抑制CD8+T细胞的生物作用，特别是能够抑制通过所述⑶8+T细胞分泌的IFN- Y或TNF- α。
[0070]在本发明的这一方面的一些实施方案中，所述抑制剂是抗CD8的单克隆抗体。在一个实施方案中，该抑制剂是抗CD8的嵌合、人源化或人单克隆抗体，包括抗胸腺细胞的球蛋白。
[0071]在本发明的这一方面的一个实施方案中，该抑制剂是抗⑶I Ia/⑶18 (LFA-1)的抗体。在本发明的这一方面的一个实施方案中，该抑制剂是抗CD49d(VLA-4)的抗体。在本发明的这一方面的一个实施方案中，该抑制剂是抗⑶137 (4-1BB)的抗体。
[0072]在本发明的这一方面的一个实施方案中，该抑制剂是抗活化CD8上的分子如(以非限制方式举例)^113/^18(1^4-1)、^49(1(￥1^-4)或⑶137(4_1BB)的单克隆抗体。在一个实施方案中，该抑制剂是嵌合、人源化或人单克隆抗体。在本发明这一方面的一个实施方案中，该抑制剂是连接选择性结合⑶8或⑶8特异性激活抗原如⑶IIa/⑶18 (LFA-1)、⑶49d(VLA-4)、⑶137(4-1BB)的抗原结合结构域与人免疫球蛋白的Fe结构域的嵌合构建体。该构建体的一个实例为药物阿法赛特(alefac印t) (CAS N0.222535-22-0)。
[0073]根据本发明的又一方面，提供了用于治疗骨折延迟愈合的药物组合物，其包括本发明以上方面的任一项的IFN- Y或TNF- α或⑶8的抑制剂(或配体)。
[0074]在一些实施方案中，将该药物组合物配制用于肠胃外给药，如皮下给药、静脉给药、肝内给药、肌肉内给药或局部骨折内给药。
[0075]在一些实施方案中，该药物组合物包含约0.1%至约10%的活性成分。在一些实施方案中，该药物组合物包含约10%至约100%的活性成分(冻干)。
[0076]在一些实施方案中，该药物组合物包含IFN-Y抑制剂和TNF-α抑制剂。在一些实施方案中，该药物组合物包含CD8抑制剂。在一些实施方案中，该药物组合物包含抗IFN-y的单克隆抗体或其他中和剂和抗TNF-α的单克隆抗体或中和剂(例如针对TNF-α的Fc-1g构建体，如依那西普)。
[0077]根据本发明的另一方面，提供了用于治疗骨折延迟愈合的剂型，包括本发明以上方面的任一项的IFN- Y或TNF- α或的抑制剂(或配体)。
[0078]剂型可以用于肠内给药，如鼻腔给药、口腔给药、直肠给药、经皮给药或口服给药，或作为吸入形式或栓剂给药。或者，可以使用肠胃外给药，如皮下、静脉、肝内或肌肉内注射形式。任选地，可以存在药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0079]用于治疗患骨折延迟愈合的患者的方法也在本发明的范围内，其包括对所述患者施用本发明以上方面的任一项的IFN- Y或TNF- α的抑制剂(或配体)，或药物组合物或剂型。同样，预期到用于治疗患骨折延迟愈合的患者的方法，其包括对所述患者施用能够实现消耗所述患者的⑶8+Τ细胞的药剂，如⑶8的抗体。
[0080]根据本发明的另一方面，提供了用于制备治疗骨折延迟愈合的药物的方法，包括使用本发明以上方面的任一项的IFN- Y或TNF- α的抑制剂(或配体)。
[0081]因此，涉及本发明的治疗应用的目的(object)公开如下:
[0082]1、用于处理或治疗骨折延迟愈合的方法中的IFN- Y (UniprotP01579)或TNF-α (UniprotP01375)的抑制剂，其中该抑制剂
[0083]a.是IFN-Y或TNF-α的配体，其能够以10_8mol/l或更低的解离常数选择性地结合IFN- Y或TNF- α，并且其中该抑制剂
[0084]b.能够消除或抑制IFN-Y或TNF-α的生物作用。
[0085]2、根据目的I的IFN- Y或TNF- α的抑制剂，其中所述抑制剂选自包括下列的组:抗体、抗体片段、抗体样分子、可溶受体构建体、衍生自IFN-Y或TNF-α的受体的6_30个氨基酸的寡肽，以及长度为10-75个核苷酸的核酸适体分子。
[0086]3、根据目的I或2的IFN- Y或TNF- α的抑制剂，其中所述抑制剂是抗IFN- Y或TNF-α的单克隆抗体。
[0087]4、根据以上目的中任一项的IFN-Y或TNF-α的抑制剂，其中所述抑制剂是嵌合的(部分来自人)、人源化或人的单克隆抗体。
[0088]5、根据以上目的的任一项的IFN-Y或TNF-α的抑制剂，其中所述抑制剂是连接选择性结合IFN-Y或TNF-α的抗原结合结构域与人免疫球蛋白的Fe结构域的嵌合构建体。
[0089]6、根据对象5的IFN-Y或TNF-α的所述抑制剂，其中所述抑制剂是依那西普(CAS N0.185243-69-0)。
[0090]7、用于治疗骨折延迟愈合的方法中的IFN-Y或TNF-α的抑制剂，其中所述抑制剂是靶向编码IFN- Y或TNF- α的mRNA的抑制型RNA或DNA分子。
[0091]8、用于处理或治疗骨折延迟愈合的方法中的活化CD8+细胞的抑制剂，其中所述抑制剂能够选择性结合活化CD8T细胞的细胞表面，并且其中所述抑制剂另外能够消除或抑制活化CD8+T细胞的生物作用，特别是抑制通过所述CD8+T细胞分泌的IFN-Y或TNF- α。
[0092]9、根据目的8的活化⑶8+T细胞的抑制剂，其中所述抑制剂是包括在⑶8标记物组中的成员的配体，所述⑶8标记物组包括⑶8、⑶IIa/⑶18 (LFA-1)、⑶49d(VLA_4)、CD137(4-1BB)，并且所述抑制剂能够以10_8 mol/Ι或更低的解离常数选择性结合所述标记物组的所述成员。
[0093]10、根据目的8或9的活化⑶8+T细胞的抑制剂，其中所述抑制剂选自包括下列的组:抗体、抗体片段、抗体样分子、可溶受体构建体、衍生自IFN-Y或TNF-α的受体的6_30个氨基酸的寡肽，以及长度为10-75个核苷酸的核酸适体分子。
[0094]11、根据目的8-10中任一项的抑制剂，其中所述抑制剂是抗⑶8、CDlla/CD18 (LFA-1)、CD49d(VLA-4)或 CD137 (4-1BB)的单克隆抗体。
[0095]12、根据目的8-10中任一项活化⑶8+T细胞的抑制剂，其中所述抑制剂是嵌合的(部分来自人)、人源化或人的单克隆抗体。
[0096]13、根据目的12的所述活化CD8+细胞抑制剂，其中所述抑制剂是阿法赛特(alefacept)(CAS N0.222535-22-0)。
[0097]14、用于治疗骨折延迟愈合的方法中的活化CD8+T细胞的抑制剂，其中所述抑制剂是靶向编码 CD8、CDlla/CD18 (LFA-1)、CD49d (VLA-4)或 CD137 (4-1BB)的 mRNA 的抑制型RNA 或 DNA 分子(s1-RNA、m1-RNA, sh-RNA、反义 DNA)。
[0098]15、用于治疗骨折延迟愈合的药物组合物，其包括根据以上目的中任一项的IFN- Y或TNF- α的抑制剂，或活化⑶8Τ细胞的抑制剂。
[0099]16、根据目的15所述的药物组合物，其中所述组合物包括IFN- Y或TNF- α的抑制剂。
[0100]17、根据目的15所述的药物组合物，其中所述组合物包括目的8-14中任一项的活化⑶8Τ细胞的抑制剂。
[0101]18、治疗患有骨折延迟愈合的患者的方法,包括向所述患者施用:
[0102]a.以上目的I至7中任一项的IFN- Y或TNF- α的抑制剂，或
[0103]b.目的8至14中任一项的活化⑶8+T细胞的抑制剂，或
[0104]c.以上目的15至17中任一项的药物组合物或剂型。
[0105]19、用于制备治疗骨折延迟愈合的药物的方法，包括使用以上目的中任一项的IFN- Y或TNF- α的抑制剂或活化T细胞的抑制剂。
[0106]无论在何种情况下，单一分离特征的替代物例如标记分子或抑制剂在此均列为“实施方案”，其均应理解为该替代物可以自由结合形成本发明在此公开的分立的实施方案。
[0107]通过以下实施例和附图进一步说明本发明，通过它们可以引出其他实施方案和优势。这些实施例意在说明本发明，而不是限制其范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0108]图1示出正常愈合和延迟愈合患者的Calori分数(中值、下四分位数和上四分位数)。
[0109]图2不出了术后6、12和18周后正常愈合和延迟愈合患者的最大地面反作用力(A)和平均步行速度(B)(中值、下四分位数和上四分位数)。
[0110]图3示出了正常愈合和延迟愈合患者的⑶3+Τ细胞群中⑶8+⑶4+细胞的频率(上标中值、下四分位数和上四分位数、下标平均值)。
[0111]图4示出了正常愈合和延迟愈合患者以及未骨折健康对照组的⑶8+T细胞群中CDlla++细胞的频率(中值、下四分位数和上四分位数)。
[0112]图5示出了正常愈合和延迟愈合患者以及未骨折健康对照组的⑶8+Τ细胞群中CD57+细胞的频率(中值、下四分位数和上四分位数)。
[0113]图6示出了正常愈合和延迟愈合患者以及未骨折健康对照组的⑶8+Τ细胞群中CD28-细胞的频率(中值、下四分位数和上四分位数)。
[0114]图7示出了正常愈合和延迟愈合患者血液样品中细胞因子的表达(AIL6 ;BIL_8)(中值、下四分位数和上四分位数)。
[0115]图8示出了⑶8+TEMRA向骨折血肿的迁移(率)。
[0116]图9示出了外周血单核细胞(PBMC)和人骨髓间充质干细胞(BM-MSC)中CD4+细胞、⑶8+细胞和⑶8+⑶57+⑶28-细胞的IFN- Y生成细胞的分数(平均值)。
[0117]图10示出了通过TNF-α和IFN-Y对骨髓间充质干细胞的骨生成的抑制。
[0118]图11示出了小鼠模型的⑶8+消耗和骨折愈合的改善。
[0119]图12示出了用于测定⑶IIa++细胞的实例。
[0120]图13示出了术前与术后的血液中以及骨折血肿(FH)中骨折患者的⑶8+T细胞群中⑶57+细胞的频率。
[0121]图14示出了术前与术后的血液中以及骨折血肿(FH)中骨折患者的⑶8+T细胞群中⑶28-细胞的频率。
[0122]图15示出了术前与术后的血液中以及骨折血肿(FH)中骨折患者的⑶4+T细胞群中CD57+细胞(上图)和CD28-细胞(下图)的频率。
[0123]材料与方法
[0124]个体与研究流程
[0125]2008年7月至2010年8月期间，15名患有分离的封闭近端胫骨骨折的患者参加本项研究(年龄:23-64岁，9名男性和8名女性)。
[0126]由于生物力学功能和免疫参数的评价，患有任何慢性疾病(例如骨质疏松症、糖尿病、风湿性关节炎、慢性心力衰竭、肾衰竭)、特别是人免疫缺陷病毒感染或肝炎感染的患者排除在本研究外。此外，患有几处骨折或涉及髋关节、肩关节、踝关节保养的患者也排除在本研究外。
[0127]本研究按照优质临床规范协调指导的国际会议和赫尔辛基宣言(theInternat1nal Conference on Harmonisat1n Guidelines for Good ClinicalPractice and the Declarat1n of Helsinki)进行。所有患者提交了书面同意书，并且该研究经桕林查利特医科大学的伦理委员会(the Ethics Committee of the
Charite - Ulliversitatsmedizin Berlin (Nr.EA1/006/08))批准。
[0128]流程与评价方案
[0129]为了评价骨折愈合的初期阶段并在骨折愈合期间协调建立临床检验点，在术后3-5天(后文称之为“第一周”)、两周、四周、六周、十二周和十八周后，对患者进行调查。在每个测试点，所有患者都经历以下方法。
[0130]血液样品
[0131 ] 在每个测试日，上午9:00至12:00期间在仰卧位休息15分钟后采集血液样品。将所有血液样品立即移到黑暗空调房间内，并在两小时内送往实验室。另外，采集小份血浆和血清样品，并在_80°C下冷冻。
[0132]根据实验标准操作程序(SOP)测定血浆和血清样品中的全血计数和标准临床变量(红细胞、血红蛋白、红细胞压积、血小板、肌酸酐、钠、钾、尿酸、骨泌素、CRP)。将用于骨钙蛋白血清评价的血清样品立即离心(3500rpm/15分钟)，并储存在预冷冻的小份中，并在三小时内送往实验室。
[0133]使用半自动系统测定血浆样品中的细胞因子(TNFa、IL_6、总IL_8、IL_10)。抗体和用于胞内细胞因子染色的各个试剂购自BD Pharmingen0
[0134]检测T细胞相关的分化群集，以评价包括⑶3、⑶4、⑶8、⑶I la+、⑶57+和⑶28+的宿主防御的适应性免疫。通过使用BD FACSAria II流式细胞分析仪进行细胞分选，并在BD LSRII流式细胞分析仪上测定获得部分的纯度。
[0135]用于MSC分化的⑶8+TEMRA细朐备件培养某
[0136]T细胞受体活化⑶8+TEMRA细胞(⑶62L-⑶45RA+)的条件培养基是在签署同意书并经当地人类研究伦理委员会的批准后从两种不同供体获得的。在耗尽CD62L+和CD45R0+细胞后，进行从⑶62L-⑶45R0-部分中对⑶8+细胞进行阳性选择。用⑶3⑶28⑶2包衣珠刺激 CD8+T 细胞(1x106 细胞 /ml DMEM+10% FCS) 24 小时。
[0137]来自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)的分离与培养
[0138]如前所述，从经历髋部手术的五名患者(供体年龄:39-90岁、平均=73岁；性别:2名女性、3名男性)的股骨骨髓洗出液中分离BM-MSC。使用流式细胞分析术通过分析细胞表面标记表达来确认 BM-MSC 的同种群(homogeneous populat1n) [Glaeser, J.D., S.Geisslerj A.0de, C.J.Schippj G.Matz1lisj W.R.Taylor, P.Knausj C.Perkaj G.N.Dudaj andG.Kasper,Modulat1n of matrix metalloprotease-2 levels by mechanical loadingof three-dimens1nal mesenchymal stem cell constructs:1mpact on in vitro tubeformat1n.Tissue Eng Part A.16 (10):p.3139-48 (2010)]。下述的所有细胞试验用来自至少4个不同供体的3-4代BM-MSC以三个技术重复来进行。
[0139]成骨分化试验
[0140]通过使用分别补充有不同浓度的IFN- Y或TNF α的成骨培养基(OM)诱导融合的BM-MSC的成骨分化。对于用离体次级分选的CD+TEMRA的CM的实验，将CM用双倍浓度的OM按1:2稀释。用茜素红染色使基质的矿化作用可视化。用10%氯化十六烷基吡啶萃取后，通过测定茜素红(ODAR)的吸收实现定量。将获得的值标准化为通过阿尔玛蓝测定的活细胞的数量。
[0141]BM-MSC存活与活力检测
[0142]为进行细胞活力检测，在实验前一天将2400BM_MSC/cm2接种于96孔板上。次日，更换培养基，并将细胞培养于含有不同浓度的IFN-Y或TNF-a (O、1、10和100ng/ml)的EM中。使用阿尔玛蓝细胞活性检测测定细胞活力。在接种一天后，使用CyQuant检测根据制造商指南确认均等的细胞接种。
[0143]BM-MSC细朐凋亡检测
[0144]为进行细胞凋亡检测，将2400BM-MSC/cm2接种在24孔板中。用分别含有指定浓度的IFN- Y或TNF- α的培养基培养BM-MSC两天。随后，移除培养基，使用Caspase-Glo?3/7检测根据制造商指南测定半胱天冬酶3和半胱天冬酶7的活性，并将值标准化为通过CyQuant检测测定的细胞数量。
[0145]小鼠实验
[0146]根据由动物福利法(Animal Welfare Act)、实验动物护理和使用NIH指南以及国家动物福利指导方针制定的政策和原则，用12周龄的C57BL/6小鼠(η = 19)进行小鼠实验。用抗体(mCD8(YTS169.4) ,B1XCell)注射(连续四日，最后一日为手术日，每次注射200 μ g mCD8)实现⑶8_T细胞组中⑶8+免疫细胞消耗。
[0147]通过FACS分析(LSR II流式细胞分析仪)，使用特定的抗⑶3、⑶8a和⑶4的抗体监测⑶8+细胞的消耗。⑶8+T细胞组在手术前一天在尾静脉接受200 μ I具有2.5 X 10tD8+细胞的静脉注射。使用MouseExFix系统在左股骨上进行截骨。股骨进行了体素尺寸为
10.5ym、55keVp、145yA的μ CT分析(Viva μ CT40)，并且目标体积(VOI)在中心处具有包括2mm的截骨缝隙。截骨21天后，在盲法评价中由三个独立的矫形外科医师将愈合结果评定为桥接或未桥接。
[0148]愈合分级与数据采集
[0149]每名患者经历数次X射线分析，以评价研究期间植入物和骨折缝隙的稳定性。三个独立的、来自不同方向(骨科、放射科)的不知情的医生进行X射线检测，以确保正确的愈合结果和患者分级。此外，完成功能数据(步态分析)以在术后12周后评价无痛完全负重。为了满足延迟愈合过程的定义，患者必须满足以下一个或多个标准。如文献所确定的和临床所使用的，对于延迟愈合过程有依时性和放射学标准。
[0150]骨折延迟愈合的依时性标准:
[0151]基于骨痂形成，术后12周后骨折愈合不完全。
[0152]骨折延迟愈合的放射学标准:
[0153]I)术后12周后骨折愈合不完全,并具有>lmm的骨折缝隙。
[0154]2)存在吸收区或骨痂形成不完全。
[0155]3)桥接不完全,这意味着1-3个皮层桥接。
[0156]4)没有桥接，这意味着未桥接皮层。
[0157]为了量化患者个体术后状况，使用了 Calori的骨折不愈合评分系统。
[0158]此外，患者的人口统计数据、ASA分级、主要诊断、手术和植入物的类型、伴发病和微生物数据来自于图表，并收集在数据库中。所有患者的特征显示于表1中。
[0159]
【权利要求】
1.用于对骨折延迟愈合进行预测/预后的方法，其中所述方法包括，在从个体获得的样品中，测定选自由⑶8+⑶57+、⑶8+⑶28-和⑶8+⑶28-⑶57+组成的第一组的⑶8+细胞亚群的频率。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括，在所述样品中，测定选自由CD8+CDlla++、CD8+CDlla++CD28-、CD8+CDlla++CD57+ 和 CD8+CDlla++CD28_CD57+ 组成的第二组的⑶8+细胞亚群的频率。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是血液样品。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，还包括测定所述样品中CD3+细胞的⑶8+⑶4+亚群的频率。
5.如权利要求1-4中之一所述的方法，还包括测定外周血样品中IL-6的水平。
6.如权利要求1-4中之一所述的方法，还包括测定所述个体的Calori分数。
7.如权利要求1-6所述方法，包括将所述CD8+细胞亚群的频率、所述IL-6的水平或所述Calori分数与标准相比较。
8.如权利要求1-7中之一所述的方法，其中相比对大群体的骨折正常愈合的患者测定的标准值，显示出高两倍频率的CD8+CD4+细胞的样品被归为骨折延迟愈合概率提高的组。
9.如权利要求1-7中之一所述的方法，其中相比对大群体的骨折正常愈合的患者测定的标准值，显示细胞⑶I la++、⑶28-或⑶57+的频率至少高出10%的样品被归为骨折延迟愈合概率提高的组。
10.如权利要求1-7中之一所述的方法，其中 -对于⑶8+细胞的⑶28-或⑶57+细胞，显示至少30%的频率的样品被归为骨折延迟愈合概率提高的组， -对于⑶8+细胞的⑶IIa++细胞，显示至少65%的频率的样品被归为骨折延迟愈合概率提闻的组，以及 -⑶3+细胞的⑶4+细胞，显示至少5%的频率的样品被归为骨折延迟愈合概率提高的组。
11.用于诊断骨折延迟愈合的系统，其包括 -用于测定从个体获得的样品中细胞群的频率或IL-6水平的装置，以及 -程序化微处理器， 其中 配备所述程序化微处理器并指定其运行上述权利要求之一所述的方法。
12.如权利要求11所述的系统，其中配备所述装置并指定其根据上述权利要求中的任一项测定所述亚群的频率。
13.用于诊断骨折延迟愈合的成套试剂盒，其包括抗⑶8抗体、抗⑶4抗体和抗⑶IIa抗体，其中所述抗体适用于基于荧光的流式细胞术。
14.如权利要求13所述的试剂盒，还包括抗⑶57抗体和/或抗⑶28抗体。
【文档编号】G01N33/50GK104081205SQ201380007559
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年2月4日 优先权日:2012年2月3日
【发明者】格奥尔格·杜达, 汉斯·迪特尔·沃尔克, 西蒙·赖因克, 克里斯蒂安·梅塞尔, 克里斯蒂安·克莱贝尔, 斯文·盖斯勒, 凯瑟琳娜·施密特·布雷克 申请人:柏林查利特医科大学