基于纳米金化学发光快速灵敏检测心得安的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于纳米金化学发光快速灵敏检测心得安的方法，包括以下步骤：1）纳米金溶液制备，采用硼氢化钠还原法制备纳米金溶液；2）采用流动注射化学发光分析系统分析测定心得安，具体流路为：鲁米诺溶液和H2O2先混合后，二次去离子水作为载流将纳米金和心得安溶液带入分析体系中，鲁米诺溶液、H2O2和二次去离子水通过蠕动泵进入流通池，纳米金和心得安的混合溶液通过进样阀注入，化学发光信号通过邻近流动注射化学发光池的光电倍增管检测，然后输入电脑进行数据的记录和采集。本发明检出限达到8.2×10-12g/mL，较以前化学发光分析方法的灵敏度提高1个数量级，分析测试时间缩短为10分钟以内。
【专利说明】基于纳米金化学发光快速灵敏检测心得安的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物检测【技术领域】，具体的说，本发明涉及一种基于纳米金化学发光快速灵敏检测心得安的方法。
【背景技术】
[0002]心得安是一种0肾上腺素受体阻滞剂，化学名称为1-异丙氨基-3-(1-萘氧基)-2_丙醇盐酸盐，广泛用于心血管疾病的治疗，属于抗高血压类的药物。近年来这种药物被用作兴奋剂以提高运动员在比赛中的成绩，而国际奥林匹克委员会将其列为违禁药品。因此，对其灵敏的测定显得很重要。另外，药品抽检是药品监督的一种重要手段，每年国家要花费大量的经费和时间进行抽验工作。目前我国基层药品监督部门工作量大，人手少，大多缺少靶向抽验的技术设备和信息资源。而心得安性质的测定方法已有不少报道，如其溶解度、亚稳态区域宽度、外消旋性质的测定及用质谱测定在水中心得安的弱自缔合系统的聚集性质等。但定量地测定心得安的方法报道却很少，只有分光光度法、荷移反应法和化学发光方法以及荧光分析法等。荧光分析法对几种荧光光谱严重重叠的物质需要同时测定时，常常无能为力。Pulgarin等利用非线性变角度同步荧光法解决了这一问题，但该法对实验条件的选择较为苛刻，其角度的寻找和最优点的选择都需要极其丰富的经验。而分光光度法等别的分析方法均存在灵敏性低、操作麻烦等缺陷。因此，在不增加经济和时间成本的前提下，研究和应用新的方法解决这类问题具有价值。
[0003]化学发光分析因具有灵敏度高、线性范围宽、试剂便宜及仪器操作简单等优点已广泛应用于药物分析中。近年来，纳米粒子尤其贵金属纳米粒子具有许多优点，首先，在纳米尺寸范围内，各种各样具有独特性能的纳米粒子很容易合成；其次，纳米粒子具有较好的生物相容性，不会影响生物活性。因此，金属纳米粒子尤其贵金属纳米粒子作为生物标记引起了研究者很大的关注。近几年来，将贵金属纳米粒子作为标记物用于化学发光分析测定一些药物越来越膨胀。2010年Haghighi等利用纳米银催化的化学发光体系，采用流动注射的方式实现了对抗结核药物-异烟肼的测定。2012年刘等利用纳米银催化的化学发光体系实现了食品中硝基呋喃类药物的分析测定。杜等利用纳米金催化的化学发光体系测定用于治疗心肌梗塞疾病的药物马来酸噻吗洛尔。Rezaei等利用纳米氧化铁催化鲁米诺-高碘酸银钾化学发光反应测定氨茶碱。卢等利用三角纳米金催化鲁米诺化学发光体系测定卡托普利。2013年杜等利用纳米金催化化学分析测定曲美他嗪。Amjadi发现卡托普利能够抑制纳米银催化的高锰酸钾-溴化物化学发光反应，实现了对卡托普利药物的分析测定。Lee等发现纳米钼能够引发鲁米诺-硝酸银化学发光反应，基于此实现了微流控化学发光分析测定维生素B。此外，有报道金银核壳纳米粒子能够催化鲁米诺化学发光反应，从而实现对抗癌药物氟他米特的分析测定。
[0004]我们之前对纳米金由于团聚这一形态的改变影响其对化学发光反应催化效应进行了深入而系统的研究。能否将纳米金的团聚直接用于化学发光分析测定心得安关键在于心得安能否诱导纳米金的团聚，从而进一步影响其催化化学发光性能。有文献报道心得安能够诱导纳米金发生团聚，同时我们的研究也证实了这一结果，且将其应用于化学发光分析测定心得安。本发明所建立的基于纳米金化学发光分析测定心得安的分析方法简单灵敏，快速。整个分析测定将会在10分钟之内完成。
【发明内容】
[0005]本发明解决了传统药物测定方法存在的局限性:使用大型昂贵的仪器，分析成本高；灵敏度不能满足各方面的需求；操作麻烦且对分析人员的要求较高；分析测定时间较长。利用心得安能够诱导纳米金的团聚，从而影响其对鲁米诺化学发光的催化活性，建立一种全新的简单灵敏化学发光测定心得安的方法。
[0006]本发明针对目前心得安检测方法存在的不足，利用心得安能够引起纳米金的团聚，从而导致其对鲁米诺化学发光催化性能的改变，建立了一种简单、灵敏快速化学发光测定心得安的新方法。测定原理:当心得安不存在时，分散态的纳米金催化鲁米诺-过氧化氢体系，产生一个较弱的化学发光信号；而当心得安存在时，心得安导致纳米金发生团聚，团聚态的纳米金大大地增强鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光信号，从而实现对心得安的测定。
[0007]本发明提供的技术方案是:一种基于纳米金化学发光快速灵敏检测心得安的方法，包括以下步骤:
[0008]I)纳米金溶液制备，采用硼氢化钠还原法制备纳米金溶液，具体为:室温条件下，将IOOmL0.01%w/w的HAuCl4水溶液、ImL的1%柠檬酸三钠溶液和ImL的0.075%NaBH4/l%柠檬酸三钠溶液完全混合，混合后溶液强力搅拌30分钟，完全反应后，放于4°C冰箱保存待用；选用的纳米金的粒径为2.6nm，浓度为6.0 X 10_7mOl/L
[0009]2)采用流动注射化学发光分析系统分析测定心得安，流动注射化学发光分析系统包括一个IFFM-D流动注射系统、一个IFFS-A发光检测器和一台控制电脑，具体流路为:鲁米诺溶液和H2O2先混合后，二次去离子水作为载流将纳米金和心得安溶液带入分析体系中，鲁米诺溶液、H2O2和二次去离子水通过蠕动泵进入流通池，纳米金和心得安的混合溶液通过进样阀注入，化学发光信号通过邻近流动注射化学发光池的光电倍增管检测，然后输A电脑进行数据的记录和采集。
[0010]所述的步骤2)中，选择鲁米诺的浓度为5X 10_4mol/L，过氧化氢浓度为
5X102mol/L。
[0011]所述的步骤2)中，鲁米诺溶液、H2O2和二次去离子水通过蠕动泵进入流通池的流速为 2.6mT ,/mi n。
[0012]所述的步骤2)中，心得安的浓度范围为2.1XKT9?6.0Xl(T7g/mL。
[0013]所述的步骤2)中，化学发光体系的pH值优化为12.0。
[0014]本发明的有益效果是:
[0015]本发明具有以下优点:(I)检出限达到8.2X10_12g/mL，较以前化学发光分析方法的灵敏度提高I个数量级；(2)该方法的分析测试时间缩短为10分钟以内；(3)整个操作实验的条件较温和，且完成在一均相的体系中，有利于自动化的分析操作。
【专利附图】
【附图说明】[0016]当结合附图考虑时，通过参照下面的详细描述，能够更完整更好地理解本发明以及容易得知其中许多伴随的优点，但此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定，其中:
[0017]图1流动注射化学发光分析测试的流路图；
[0018]图2纳米金浓度的优化；
[0019]图3鲁米诺浓度的优化；
[0020]图4过氧化氢浓度的优化；
[0021]图5体系pH的选择；
[0022]图6化学发光检测心得安的灵敏度分析；
[0023]图7心得安加入前后纳米金的紫外可见光谱，图a为纳米金；图b为纳米金+心得安;
[0024]图8心得安加入前后纳米金的透射电镜图片，图a为加入前的；图b为加入后的。【具体实施方式】
[0025]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0026]所用到的主要仪器设备和试剂:
[0027]IFFL-D流动注射化学发光分`析仪及其配套设备(西安瑞迈分析仪器有限公司)，TU-1901型紫外-可见分光光度仪(北京普析通用仪器有限公司)，透射电子显微镜(日立公司，规格型号:H_600)。
[0028]氯金酸(HAuCl4 ? 4H20, AR，Au含量>47.8%，国药集团化学试剂有限公司)；将氯金酸固体溶于二次去离子水中制备氯金酸储备溶液，放于4°C冰箱中保存。将4.43g鲁米诺固体粉末溶解在20mL0.1OM NaOH溶液中并稀释至1L，制备得到2.5 X IO2M鲁米诺储备溶液。使用之前避光保存一星期以确保试剂性质的稳定。鲁米诺的工作溶液通过储备溶液的稀释而得到。H2O2的工作溶液在每次使用时从30% (WZV)H2O2 (上海化学试剂公司)稀释得到。心得安购于中国药物和生物制品管理局，实验用水为二次去离子水。
[0029]实验条件的优化:
[0030]实验中选用2.6nm的纳米金，考查了金的浓度的影响。如图2，金的浓度越大，体系的发光强度也越大，本发明选用纳米金的粒径为2.6nm，浓度为6.0X 10_7mol/L。
[0031]考察了化学发光试剂的影响，如图3和4，发现随着鲁米诺和过氧化氢浓度的增加，体系的发光强度越大。考虑到化学发光强度和试剂的消耗，选择鲁米诺的浓度为
5X 10 4mol/L,过氧化氢浓度为 5X10 2mol/L。
[0032]考察了体系pH值的影响，如图5，当体系的pH值小于12时，随着pH值的增加化学发光强度增大；而当体系的PH值大于12时，随着pH值的增加化学发光强度减弱。本发明所用体系的pH值优化为12.0。
[0033]2.6nm纳米金的制备:
[0034]制备过程中所用的玻璃器皿均使用王水清洗(1:3 HNO3-HCl),然后用二次去离子水彻底冲洗干净，烘干备用。2.6nm纳米金的制备方法为硼氢化钠还原法。制备过程简述如下:在室温、强力搅拌的条件下，将IOOmL的HAuCl4 (0.01%w/w)水溶液、ImL的1%柠檬酸三钠溶液和ImL的0.075%NaBH4/l%柠檬酸三钠溶液完全混合。混合后溶液搅拌30分钟，完全反应后，放于4 C冰箱保存待用。
[0035]基于纳米金流动注射化学发光分析测定心得安:
[0036]流动注射化学发光分析系统包括一个IFFM-D流动注射系统、一个IFFS-A发光检测器和一台控制电脑。采用的流路如图1所示，在载流二次水携带下，纳米金与鲁米诺和H2O2的混合溶液进行混合。本发明将鲁米诺和H2O2先混合后，二次去离子水作为载流将纳米金溶液带入分析体系中，鲁米诺溶液、H2O2和二次去离子水通过螺动泵进入流通池,流速为2.6mL/min。纳米金及纳米金和心得安的混合溶液(团聚的纳米金溶液)通过进样阀注入，体积约为150 yL。化学发光信号通过邻近流动注射化学发光池的光电倍增管(PMT)检测，然后输入电脑进行数据的记录和采集。
[0037]心得安化学发光的分析性能:
[0038]在上述优化的实验条件下，实现了对心得安化学发光分析的测定。结果表明，随着心得安浓度的增加，化学发光信号逐渐增强。且在2.1XlO-9~6.0X 10_7g/mL的浓度范围内，心得安的浓度与化学发光信号的强度成良好的相关性，线性曲线如图6所示，其检出限为8.2 X 1012g/mL (S/N=3)。并对6.2 X 108g/mL的心得安进行五次重复测定，相对标准偏差(R.S.D.)为4.6%。实验结果表明该方法检出限低，精密度好。和仅有的一种化学发光分析测定心得安的方法相比较，本发明建立的方法检出限要低一个数量级。
[0039]样品分析的结果:
[0040]取市售的盐酸普萘洛尔片剂10片，置于研钵中仔细研细。将粉末样品于小烧杯中加入少量水溶解，而后定容于IOOmL容量瓶中，静置过滤。上述溶液经稀释后进行发光分析。平行测定5次，并按药典法(紫外分光光度法)对盐酸普萘洛尔样品进行对照分析，分析结果列于表1。结果表明两种方法测得结果没有明显的差别。
[0041]表1样品分析的结果。
[0042]
【权利要求】
1.一种基于纳米金化学发光快速灵敏检测心得安的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)纳米金溶液制备，采用硼氢化钠还原法制备纳米金溶液，具体为:室温条件下，将IOOmL0.01%w/w的HAuCl4水溶液、ImL的1%柠檬酸三钠溶液和ImL的0.075%NaBH4/l%柠檬酸三钠溶液完全混合，混合后溶液强力搅拌30分钟，完全反应后，放于4°C冰箱保存待用； 2)采用流动注射化学发光分析系统分析测定心得安，流动注射化学发光分析系统包括一个IFFM-D流动注射系统、一个IFFS-A发光检测器和一台控制电脑，具体流路为:鲁米诺溶液和H2O2先混合后，二次去离子水作为载流将纳米金和心得安溶液带入分析体系中，鲁米诺溶液、H2O2和二次去离子水通过蠕动泵进入流通池，纳米金和心得安的混合溶液通过进样阀注入，化学发光信号通过邻近流动注射化学发光池的光电倍增管检测，然后输入电脑进行数据的记录和采集。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米金化学发光快速灵敏检测心得安的方法，其特征在于，所述的步骤I)中，选用的纳米金的粒径为2.6nm，浓度为6.0X 10_7mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米金化学发光快速灵敏检测心得安的方法，其特征在于，所述的步骤2)中，选择鲁米诺的浓度为5 X 10_4mol/L，过氧化氢浓度为5 X 10_2mol/L0
4.根据权利要求1所述的一种基于纳米金化学发光快速灵敏检测心得安的方法，其特征在于，所述的步骤2)中，鲁米诺溶液、H2O2和二次去离子水通过蠕动泵进入流通池的流速为 2.6mT ,/mi n。
5.根据权利要求1所述的一种基于纳米金化学发光快速灵敏检测心得安的方法，其特征在于，所述的步骤2)中，心得安的浓度范围为2.1X10_9?6.0X10_7g/mL。
6.根据权利要求1所述的一种基于纳米金化学发光快速灵敏检测心得安的方法，其特征在于，所述的步骤2)中，化学发光体系的pH值优化为12.0。
【文档编号】G01N35/08GK103760149SQ201410015916
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月14日 优先权日:2014年1月14日
【发明者】齐莹莹, 修福荣 申请人:福建工程学院