专利名称：：一种用化学发光法体外检测血液丙酮酸的方法
技术领域：
：本发明涉及一种医用试剂检测方法，特别是一种用化学发光法体外检测血液丙酮酸的方法。
背景技术：
：利用现代生物技术所开发的超微量测定方法，极大的推动了生物和医学各领域的各项临床和科研工作的快速发展，为人类的科学事业和社会进步作出了非凡的贡献。上世纪七十年代由Arakawa首先发表了应用鲁米诺——过氧化物酶的化学发光反应进行酶免分析的技术，这一技术由于灵敏度高(可达10-18mol)，快速(可在20分钟内出测定结果)、简便(可实现完全自动化)，有效期长(可达一年以上)，利于环保(无放射性和致畸物质)而受到普遍欢迎，是目前发展最迅速的检测技术。化学发光技术在免疫分析中已得到相当普及的程度，已发展为能检测多种生物活性物质的常规监床检测方法，从免疫反应方式分，该方法有两种基本类型，即化学发光免疫分析(CLIA)和免疫化学发光分析(ICMA);从发光方式上看，一是将发光物质直接标记到抗体或抗原上，免疫反应后，在起动剂的作用下而发光，另一种是用酶标记抗体或抗原，免疫反应后，加入化学发光底物，在酶催作用下而发光。该方法虽有突出的优点，但目前仅限于免疫分析，而在生化分析中还是空白，本发明就是要把化学发光这一高级技术推广到生化分析等领域。全血丙酮酸的测定主要用于维生素Bl缺乏症的诊断.维生素B1的焦磷酸酯是丙酮酸在细胞内进一步氧化分解为乙酰辅酶A时的脱羧辅酶，维生素Bl缺乏时，体内丙酮酸的氧化发生障碍，使丙酮酸含量增加。现在普遍使用的测定血液中丙酮酸的方法为比色法，该法是利用LD催化丙酮酸和NADH生成NAD+和L-乳酸。测定NADH来计算丙酮酸的含量。该法的不足之处主要有.'1.线性范围窄。由于检测光吸收，其分辨率不像化学发光那么敏感，线性范围不能完全满足临床检测的需要，对高浓度的样品需要经稀释后测定，带来一定不便。2.灵敏度不如化学发光。化学发光是测定光信号，灵敏度要比测光吸收高出许多。
发明内容本发明的目的在于提供一种灵敏、宽范围、成本低便于普及而又安全的体外检测血液丙酮酸的方法。本发明的目的是这样实现的一种用化学发光法体外检测血液丙酮酸的方法，其特征在于用丙酮酸氧化酶氧化丙酮酸得到过氧化氢，后者经HRP催化使鲁米诺发光，光信号大小与丙酮酸含量成正比，记录这种光信号即推测出丙酮酸的浓度。本发明的目的还可以这样实现利用丙酮酸与ADP在丙酮酸激酶(PK)催化下产生ATP，ATP与甘油，在GK催化下生成甘油-3-磷酸及ADP，而甘油-3-磷酸被GP0作用得到HA，H202经HPR催化使鲁米诺发光。光信号的大小与丙酮酸的浓度呈正相关，即丙酮酸浓度越大发出的光信号越强。记录这种光信号即可推测丙酮酸的浓度。用已知浓度的丙酮酸测出的光信号，作出剂量-反应曲线，未知样品的丙酮酸含量可从该曲线推算出来。本发明用化学发光物代替显色物，能够达到更灵敏、更稳定、范围宽、更安全的目的。用本发明的方法可以制备相应的定量测定血液中丙酮酸的商品试剂盒。具体来讲，本发明与传统的方法相比有如下优点1.灵敏度更高。传统方法是检测颜色深浅，而化学发光是测光信号，可一个一个光子计数，所测的最低限更小，因而灵敏度更高。2.线性范围宽。测颜色的深浅的分辨率比光子计数的精度要低得多，化学发光的检测范围高达105。3.安全适用。化学发光物如鲁米诺等很安全，整个检测过程无有害物出现，无论是检测或处理废物都很安全，有利于环境保护。4.便于普及。本发明所制备的试剂盒，可用于全自动测量，也可用于手工或半自动测量，适宜大、中、小各层次的医疗和研究机构使用。5.巨大的社会效益。用化学发光法测定生化指标或免疫物质，可同用一台化学发光仪，不再需要进口昂贵的生化仪，节省大量资金，不只降低了成本，对医疗机构、患者及社会均大有益处。具体实施例方式下面举例说明本发明的实施。方案一反应原理丙酮酸+磷酸盐(P0)—HA+乙酰磷酸盐+。。。仏02+鲁米诺(HRP)—发光1.试剂1.l.丙酮酸标准单一或系列浓度；1.2.底物液。2.测定程序，按下表进行，加样单位为W。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>混匀，室温或3037。C温育后测量RLU丙酮酸+ADP(PK)—ATP+。。。。甘油+ATP(GK)—甘油-3-磷酸+ADP方案二反应原理甘油-3-磷酸+02(GP0)—磷酸二羟丙酮+仏0:仏02+鲁米诺(HRP)—发光l.试剂1.l.丙酮酸标准单一或系列浓度；1.2.混合酶液，含ADP和甘油；1.3.发光底物液。2.测定程序，按下表进行，加样单位为W。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>混匀，室温或3037。C温育后测量RLU3.用适当方法处理作出剂量-反应曲线，根据样品的RLU值从该曲线求出其丙酮酸的浓度。或直接由公式求出丙酮酸浓度=(样品RLU/标准RLU)X标准浓度4.也可用双试剂两步法测定。权利要求1、一种用化学发光法体外检测血液丙酮酸的方法，其特征在于用丙酮酸氧化酶氧化丙酮酸得到过氧化氢，后者经HRP催化使鲁米诺发光，光信号大小与丙酮酸含量成正比，记录这种光信号即推测出丙酮酸的浓度。2、一种用化学发光法体外检测血液丙酮酸的方法，其特征在于利用丙酮酸与ADP在丙酮酸激酶催化下产生ATP，ATP与甘油，在GK催化下生成甘油-3-磷酸及ADP，而甘油-3-磷酸被GPO作用得到H202，H202经HPR催化使鲁米诺发光；光信号的大小与丙酮酸的浓度呈正相关，即丙酮酸浓度越大发出的光信号越强；记录这种光信号即可推测丙酮酸的浓度；用已知浓度的丙酮酸测出的光信号，作出剂量-反应曲线，未知样品的丙酮酸含量可从该曲线推算出来。全文摘要一种用化学发光法体外检测血液丙酮酸的方法，其特征在于利用丙酮酸与ADP在丙酮酸激酶催化下产生ATP，ATP与甘油，在GK催化下生成甘油-3-磷酸及ADP，而甘油-3-磷酸被GPO作用得到H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>，H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>经HPR催化使鲁米诺发光；光信号的大小与丙酮酸的浓度呈正相关，即丙酮酸浓度越大发出的光信号越强；记录这种光信号即可推测丙酮酸的浓度；用已知浓度的丙酮酸测出的光信号，作出剂量-反应曲线，未知样品的丙酮酸含量可从该曲线推算出来。本发明用化学发光物代替显色物，能够达到更灵敏、更稳定、范围宽、更安全的目的。用本发明的方法可以制备相应的定量测定血液中丙酮酸的商品试剂盒。文档编号G01N21/76GK101639445SQ20091016985公开日2010年2月3日申请日期2009年9月7日优先权日2009年9月7日发明者京王申请人:福建省洪诚生物药业有限公司