苯胺的固相电致化学发光检测方法
【专利摘要】本发明是一种苯胺的固相电致化学发光检测方法，具体方法包括：1)光学复合纳米纤维Ru-AuNPs-PA6的制备；2)固相电致化学发光传感系统构建与优化；3)苯胺定量检测。经静电纺丝制备电致化学发光活性物联吡啶钌掺杂的纳米金胶/尼龙6光学复合纳米纤维Ru-AuNPs-PA6，利用Ru-AuNPs-PA6构建固相电致化学发光传感系统并进行相关参数优化，应用所构建的固相电致化学发光传感系统定量检测苯胺。本发明建立具有高灵敏度、高稳定性、宽线性范围、低检出限及传感系统可重复利用等特点的苯胺的固相电致化学发光检测方法。
【专利说明】苯胺的固相电致化学发光检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种苯胺的固相电致化学发光检测方法。属于芳香族胺分子检测领 域。
【背景技术】
[0002] 苯胺又称阿尼林油，分子式：C6H7N，是最重要的芳香族胺之一。苯胺是一种重要 的有机化工原料，环境中的苯胺主要来源于橡胶、印染、制药、塑料、陶器上釉等工艺生产过 程。苯胺属高毒性物质，与血红蛋白结合成高铁血红蛋白，而使血红蛋白与氧结合能力下 降导致动物中毒。通过吸入和吸收途径，苯胺可导致人体急性中毒或慢性中毒，产生头痛、 眩晕、疲倦、记忆力下降、呼吸不畅，甚至窒息死亡等症状，长期与苯胺接触还可引起癌症。 环境中苯胺的残余量已引起人们的极大关注，早已将其列入优先监测的污染物 [1'2]。因此， 建立简单、快速、有效的苯胺测定方法非常必要。
[0003] 目前，苯胺的测定方法主要有光度法和色谱法。传统的乙二胺光度法操作程序繁 琐，pH值调节困难，对显色反应的温度有较严格的要求，显色时间长，有众多的副反应产生 而影响测定结果 [3]。色谱法，如气相色谱法[4]、高效液相色谱法[5]、毛细管区带电泳 [6]等， 由于仪器价格等原因，难以广泛推广和使用。另外，还有采用荧光法[7]、电化学方法 [8'9]等 对苯胺进行测定。其中电化学法以体系稳定，影响因素少，灵敏度较高而受到青睐。在电 化学方法里面，电致化学发光（Electrochemiluminescence，ECL)-流动注射分析法具有装 置简单、重现性好、可进行原位检测及高灵敏度和高选择性等优点而颇具优势和潜力 [1°'11]。 然而在传统的ECL-流动注射的液相ECL检测应用中，由于昂贵的ECL活性物联吡啶钌 (Ru (bpy) 32+)或相关衍生物作为流动反应试剂被大量消耗，导致较高的分析成本，从而限制 了其应用。将Ru(bpy) 32+固定在固载表面制作成Ru(bpy)32+固相传感器，可达到节约试剂、 提高有效浓度和简化实验装置的目的，同时，被固定化的物质易与反应体系进行分离，不污 染测定样品 [12'13]。如能应用固相ECL系统方便、快速、准确测定苯胺，可解决苯胺测定过程 中存在的系列问题，具有良好的应用前景。
[0004] 参考文献：
[0005] [1] T. Spataru, N. Spataru, A. Fujishima, Talanta73 (2007) 404.
[0006] [2] L. M. Zhang, B. Li, Spectrochim. Acta A74 (2009) 1060.
[0007] [3]X. L. Chen, Z. B. Li, Y. X. Zhu, J. G. Xu, Anal. Chim. Acta505 (2004) 283.
[0008] [4] Y. Y. Han, L. Y. Wang, Y. Y. Zhao, Y. Q. Li, L. Y. Liu, Chromatographia76 (2013) 17 47.
[0009] [5] J. Xiong, S. Qian, Y. H. Xie, Z. ff. Xie, Η. X. Li, Chinese J Anal. Chem. 42(2014)93.
[0010] [6] S. H. Liu, ff. J. Wang, J. Chen, J. Z. Sun, Int. J. Mol. Sci. 13 (2012) 6863.
[0011] [7] R. Prasad, R. Kumar, S. Prasad, Anal. Chim. Acta646 (2009) 97.
[0012] [8]T. Sp'aiaru, N. Sp^alaru, A. Fujishima, Talanta73 (2007) 404.
[0013] [9]B. T. P. Quynh, J. Y. Byun, S. H. Kim, Sensor. Actuat. B-Chem. 193 (2014) 1.
[0014] [10] C. Q. Yi, M. J. Li, Y. Tao, X. Chen, Chinese J Anal. Chem. 32 (2004) 1421
[0015] [11]H. Cui, F. Li, M. J. Shi, Y. Q. Pang, X. Q. Lin, Electroanalysisl7 (2005) 589.
[0016] [12]ff. J. Miao, Chem. Rev. 108 (2008) 2506.
[0017] [13]M. Su, S. Q. Liu, Anal. Biochem. 402 (2010) 1.
【发明内容】
[0018] 技术问题：本发明的目的是提供一种苯胺的固相电致化学发光检测方法，本发明 经静电纺丝技术，获得具有多孔3D结构、导电性能良好、稳定性好、发光性能优良的光学复 合纳米纤维，利用此光学复合纳米纤维构建固相电致化学发光传感系统并进行相关参数优 化，应用所构建的固相电致化学发光传感系统定量检测苯胺。
[0019] 技术方案：本发明的苯胺的固相电致化学发光检测方法为：
[0020] 1)光学复合纳米纤维的制备：
[0021] 将联批陡钌、纳米金胶及尼龙6溶解于1:1?19: lv/v的间甲酚/甲酸的混合溶 剂中形成混合物，再将该混合物在室温下连续搅拌，制得均匀透明的前驱体静电纺丝溶液； 在静电纺丝时，将上述制备的均匀透明的前驱体静电纺丝溶液置于注射器中，高压静电发 生器的正极连接注射器针头，负极连接在洁净的裸电极上，采用微量注射泵供液，由高压静 电发生器产生的高压静电直接施加在注射器针头上，光学复合纳米纤维Ru-AuNPs-PA6收 集于裸电极上，获得光学复合纳米纤维修饰电极；
[0022] 2)固相电致化学发光传感系统构建与优化：
[0023] 将Ru-AuNPs-PA6光学复合纳米纤维修饰电极作为工作电极，Ag/AgCl或饱和KC1 电极作为参比电极，Pt丝电极作为对电极，构成三电极体系，经所述三电极体系构建光学复 合纳米纤维-固相电致化学发光传感系统；进行电位扫描范围、扫描速度、共反应物选择与 浓度、支持电解质、及检测溶液的pH值参数的优化；
[0024] 光学复合纳米纤维-固相电致化学发光传感系统主要参数设置：电位扫描范围 0?1. 25V，扫描速度100mV/S，共反应物为C2042_，支持电解质为ΚΝ0 3，检测液为50mmol/L PBS 含 3. 0mmol/L C2042'0. 4mol/L ΚΝ03(ρΗ6· 5)。
[0025] 3)苯胺定量检测：
[0026] 应用所构建的光学复合纳米纤维-固相电致化学发光传感系统，结合熄灭标准曲 线对苯胺进行定量检测包括线性范围、校准曲线、相关系数及检出限；所述熄灭标准曲线是 以系列苯胺标准溶液的浓度为横坐标，光信号强度差值为纵坐标绘制熄灭标准曲线；其中 光信号强度差值是检测液无苯胺的光信号强度减去检测液有苯胺的光信号强度。
[0027] 所述的传感系统包括所述三电极体系和检测液，所述检测液为50mmol/L PBS含 3. 0mmol/L C2042'0. 4mol/L ΚΝ03(ρΗ6· 5)。
[0028] 有益效果：
[0029] (1)光学复合纳米纤维制备简单、光电性能优良
[0030] 联吡啶钌、纳米金胶及尼龙6的前驱体静电纺丝溶液经一步电纺获得光学复合纳 米纤维（Ru-AuNPs_PA6)，制备简单方便。Ru-AuNPs_PA6在裸电极上无规取向形成多孔3D结 构的纳米纤维膜（见附图1)，展示了优良的电致化学发光性能（见附图2)。R U-AuNPs-PA6 修饰电极上每一根具有大比表面积的Ru-AuNPs-PA6纳米纤维作为一个独立的微电极，使 得Ru-AuNPs-PA6修饰电极的真实比表面积较裸电极明显放大，最终发光效率因Ru(bpy)32+ 的大量富集而显著提高（见附图2)。
[0031] (2)苯胺对固相电致化学发光传感系统响应灵敏
[0032] 将Ru-AuNP S-PA6修饰电极作为工作电极，利用三电极体系，构建光学复合纳米 纤维-固相电致化学发光传感系统（RU-AuNPs-PA6-C 2042〇。苯胺在酸性条件易被电氧 化为苯醌，苯醌经双分子能量转移可有效猝灭Ru(bpy) 32+激发态物质。从而使得苯胺对 Ru-AuNPs-PA6-C20 42_传感系统会产生灵敏响应（见附图3)。
[0033] (3)传感系统稳定性好、可重复利用
[0034] 尼龙6(PA6)的分子主链链段单位中含有酰胺基团和亚甲基，由于C-N存有部分 双键的性质，使得酰胺基团处于同一平面上，整个主链分子有序的排列，氨基和酰基之间的 亚甲基链段获得了最大的疏水性。柠檬酸稳定的带负电荷的纳米金（AuNPs)与Ru(bpy) 32+ 混合后，经正负电荷相吸形成混聚体从而将Ru (bpy) 32+大量、牢固的固载在以PA6为模板 高分子制备的复合纳米纤维里面。由Ru-AuNPs-PA6修饰电极构建的传感系统的ECL信号 经30次CV循环扫描，几乎没有变化，说明其具有非常好的稳定性。制备的传感系统在中性 缓冲液中有很好的电化学响应和稳定性，在磷酸缓冲液中保存2天后，ECL信号几乎不变。 所浸泡的磷酸缓冲液未观察到Ru (bpy) 32+的ECL信号，光学复合纳米纤维-传感系统中的 Ru (bpy) 32+几乎没有发生染料泄漏。传感系统经超纯水充分去除吸附的苯胺、C20广后，可重 复使用。重复使用8次后，ECL信号响应值能保持原信号的91. 8%。
[0035] (4)所述方法对苯胺检测的线性范围宽、检出限低
[0036] 应用所构建的光学复合纳米纤维-固相电致化学发光传感系统定量检测苯胺。 线性范围从l〇nmol/L、100nmol/L、1 μ mol/L到10 μ mol/L，跨越4个数量级，检出限达 5. 0nmol/L(见附图 4)。
【专利附图】
【附图说明】
[0037] 图 1 是 Ru-AuNPs_PA6 的 FESEM 图像。
[0038] 图2是不同电极的ECL强度曲线。
[0039] 图3是苯胺对Ru-AuNPs_PA6的ECL猝灭曲线。
[0040] 图4是苯胺定量检测曲线。
【具体实施方式】
[0041] 本发明提供的一种苯胺的固相电致化学发光检测方法为：（1)将一定量的联吡啶 钌、纳米金胶及尼龙6在合适的溶剂中室温连续搅拌，制得均匀透明的前驱体静电纺丝溶 液，利用静电纺丝技术，将其以无序排列的无纺布形式沉积在洁净的裸电极上，获得光学复 合纳米纤维修饰电极；（2)将（1)得到的电极作为工作电极，利用三电极体系，构建光学复 合纳米纤维-固相电致化学发光传感系统并进行相关参数优化；（3)应用（2)所构建的光 学复合纳米纤维-固相电致化学发光传感系统定量检测苯胺。所述苯胺的固相电致化学发 光检测方法简单方便、快速、准确，具有高灵敏度、高稳定性、宽线性范围、低检出限及传感 系统可重复利用等特点。可解决苯胺测定过程中存在的系列问题，具有良好的应用前景。
[0042] 相关简写说明如下：
[0043] 尼龙 6 (PA6)
[0044] 纳米金胶（AuNPs)
[0045] 联吡啶钌（Ru(bpy)32+)
[0046] 光学复合纳米纤维（Ru-AuNPs_PA6)
[0047] 电致化学发光（ECL)
[0048] 裸玻碳电极（GC)
[0049] 本发明的方法具体如下：
[0050] 1)光学复合纳米纤维的制备：
[0051] 将联批陡钌、纳米金胶及尼龙6溶解于1:1?19:1，v/v的间甲酚/甲酸的混合溶 剂中形成混合物，再将该混合物在室温下连续搅拌，制得均匀透明的前驱体静电纺丝溶液。 在静电纺丝时，将上述制备的均匀透明的前驱体静电纺丝溶液置于注射器中，高压静电发 生器的正极连接注射器针头，负极连接在洁净的裸玻碳电极上，采用微量注射泵供液，由高 压静电发生器产生的高压静电直接施加在注射器针头上，光学复合纳米纤维Ru-AuNPs-PA6 收集于裸玻碳电极上，获得光学复合纳米纤维修饰电极；
[0052] 2)固相电致化学发光传感系统构建与优化：
[0053] 将光学复合纳米纤维修饰电极作为工作电极，利用三电极体系，构建光学复合纳 米纤维-固相电致化学发光传感系统。进行电位扫描范围、扫描速度、共反应物选择与浓 度、支持电解质、及检测溶液的pH值等主要参数的系统优化；
[0054] 3)苯胺定量检测：
[0055] 应用所构建的光学复合纳米纤维-固相电致化学发光传感系统，结合熄灭标准曲 线法对苯胺进行定量检测。包括线性范围、校准曲线、相关系数及检出限等。
[0056] 对Ru-AuNPs-PA6进行微观形态的表征。由Ru-AuNPs-PA6的场发射扫描电镜图谱 (FESEM)(图1)可看出，Ru-AuNPs-PA6无规取向形成多孔3D结构的纳米纤维膜，纳米纤维 表面光滑、无突兀，直径范围从50nm到300nm。
[0057] 如图2所示为不同电极的ECL强度曲线。Ru-AuNPs-PA6修饰电极在50mmol/L PBS 含 0· 4mol/L ΚΝ03(ρΗ6· 5)，（a)不含 C2 042、（c)含有 3. Ommol/L C20广；(b)裸玻碳电 极在 50mmol/L PBS 含 100yg Ru(bpy)32+、3.0mmol/L C2042'0.4mol/L ΚΝ03(ρΗ6·5)。对 Ru-AuNPs-PA6修饰电极在有无C20 42_作为ECL共反应物质时的ECL强度进行对比检测，发现 Ru-AuNPs-PA6-C 2042-系统展示了优良的ECL性能（图2,曲线a和c ;)。对与Ru-AuNPs-PA6 修饰电极含同样质量的Ru (bpy) 32+的液相ECL系统进行ECL强度对比检测（图2,曲线b和 c)，发现Ru-AuNPs-PA6修饰电极因其多孔3D结构（有利于共反应物C 2042_的穿梭移动）、 大的比表面积及大量固载Ru (bpy) 32+，其ECL信号较液相ECL系统显著放大。
[0058] 图3是苯胺对Ru-AuNPs-PA6的ECL猝灭曲线。检测液为50mmol/L PBS含 3.0mmol/L C2042'0.4mol/L KN03(pH6.5)，（a)不含苯胺，（b)含有 lOOymol/L 苯胺。对 Ru-AuNPs-PA6修饰电极在有无猝灭剂苯胺存在时的ECL强度进行对比检测，发现苯胺对 Ru-AuNPs-PA6-C 2042_传感系统的ECL信号会产生高效猝灭（图3)。
[0059] 图4是苯胺定量检测曲线。苯胺浓度0mol/L(a)，10nmol/L(b)，lOOnmol/ L(c)，1 μ mol/L(d)，10 μ mol/L(e)，100 μ mol/L(f)和 1mmo1/T,(g)。插图为苯胺检测校准曲 线，苯胺浓度为 l〇nmol/L，100nmol/L，lymol/L, lOymol/L。应用 Ru-AuNPs-PA6_C2042 传 感系统对系列浓度的苯胺进行测定，发现线性范围从10nmol/L、100nmol/L、l μ mol/L到 1(^111〇1/1，跨越4个数量级，检出限达5.〇11111〇1/1(图4)。
[0060] 本发明的具体步骤为：
[0061] (1)光学复合纳米纤维的制备：
[0062] 将lmLlwt% (质量分数）的氯金酸溶液加入到100mL亚沸蒸馏水中，加热至沸， 在剧烈搅拌下快速加入2. 5mLlwt% (质量分数）的柠檬酸三钠溶液。在沸腾的情况下 剧烈搅拌30min，迅速移去热源，继续搅拌10min，即制得朽1檬酸稳定的带负电荷的纳米金 (AuNPs)。将制备得到的AuNPs置于棕色瓶中，4°C低温保存。
[0063] 将5mL上述制备的AuNPs、10mg Ru (bpy) 32+及3. 06g PA6溶解于10mL的混合溶剂 中（间甲酚：甲酸=6:4, v/v)，将混合物在室温下连续搅拌12h，制得均匀透明的前驱体静 电纺丝溶液。
[0064] 在静电纺丝时，将上述制备的均匀透明的前驱体静电纺丝溶液置于注射器中，高 压静电发生器的正极连接注射器针头，负极连接在洁净的裸玻碳电极上，采用微量注射泵 供液，由高压静电发生器产生的高压静电直接施加在注射器针头上，光学复合纳米纤维 (Ru-AuNPs-PA6)收集于裸玻碳电极上。
[0065] 静电纺丝条件设置：672?972号针头，电压17?23V，注射器流速0· 2?0· 8mL/ h，针头与电极距离15?20cm，纺丝时间3?5min，环境温度20?25°C，湿度控制在30? 40%。
[0066] (2)固相电致化学发光传感系统构建与优化：
[0067] 将光学复合纳米纤维修饰电极作为工作电极，利用三电极体系，构建光学复合纳 米纤维-固相电致化学发光传感系统。进行电位扫描范围、扫描速度、共反应物选择与浓 度、支持电解质、及检测溶液的pH值等主要参数的系统优化。
[0068] 光学复合纳米纤维-固相电致化学发光传感系统主要参数设置：电位扫描范围 0?1. 25V，扫描速度100mV/S，共反应物为C2042_，支持电解质为ΚΝ0 3，检测液为50mmol/L PBS 含 3. 0mmol/L C2042'0. 4mol/L ΚΝ03(ρΗ6· 5)。
[0069] (3)苯胺定量检测：
[0070] 应用所构建的光学复合纳米纤维-固相电致化学发光传感系统，结合熄灭标准曲 线法对苯胺进行定量检测。包括线性范围、校准曲线、相关系数及检出限等。
[0071] 熄灭标准曲线浓度范围：0mol/L, 10nmol/L，100nmol/L，1 μ mol/L, 10 μ mol/ L,100 μ mol/L 和 lmmol/L〇
[0072] 苯胺检测校准曲线浓度范围：10nmol/L, 100nmol/L，1 μ mol/L, 10 μ mol/L。
[0073] 苯胺检测校准曲线：y = 431gx+42,相关系数：0· 9992,检出限：5. 0nmol/L。
[0074] 本发明以裸玻碳电极为例，其它电极如金电极、石墨电极、钼盘电极等均可进行所 述材料修饰。
【权利要求】
1. 一种苯胺的固相电致化学发光检测方法，其特征在于所述的检测方法为： 1) 光学复合纳米纤维的制备： 将联吡啶钌、纳米金胶及尼龙6溶解于1:1?19:lv/v的间甲酚/甲酸的混合溶剂中 形成混合物，再将该混合物在室温下连续搅拌，制得均匀透明的前驱体静电纺丝溶液；在静 电纺丝时，将上述制备的均匀透明的前驱体静电纺丝溶液置于注射器中，高压静电发生器 的正极连接注射器针头，负极连接在洁净的裸电极上，采用微量注射泵供液，由高压静电发 生器产生的高压静电直接施加在注射器针头上，光学复合纳米纤维Ru-AuNPs-PA6收集于 裸电极上，获得光学复合纳米纤维修饰电极； 2) 固相电致化学发光传感系统构建与优化： 将Ru-AuNPs-PA6光学复合纳米纤维修饰电极作为工作电极，Ag/AgCl或饱和KC1电 极作为参比电极，Pt丝电极作为对电极，构成三电极体系，经所述三电极体系构建光学复合 纳米纤维-固相电致化学发光传感系统；进行电位扫描范围、扫描速度、共反应物选择与浓 度、支持电解质、及检测溶液的pH值参数的优化； 光学复合纳米纤维-固相电致化学发光传感系统主要参数设置：电位扫描范围〇? 1. 25V，扫描速度100mV/S，共反应物为C2042_，支持电解质为ΚΝ0 3，检测液为50mmol/L PBS含 3. Ommol/L C2042'0. 4mol/L ΚΝ03(ρΗ6· 5)。 3) 苯胺定量检测： 应用所构建的光学复合纳米纤维-固相电致化学发光传感系统，结合熄灭标准曲线对 苯胺进行定量检测包括线性范围、校准曲线、相关系数及检出限；所述熄灭标准曲线是以系 列苯胺标准溶液的浓度为横坐标，光信号强度差值为纵坐标绘制熄灭标准曲线；其中光信 号强度差值是检测液无苯胺的光信号强度减去检测液有苯胺的光信号强度。
2. 根据权利要求1所述的苯胺的固相电致化学发光检测方法，其特征在于所述的传 感系统包括所述三电极体系和检测液，所述检测液为50mmol/L PBS含3.0mmol/L C2042_、 0· 4mol/L ΚΝ03(ρΗ6· 5)。
【文档编号】G01N21/76GK104122255SQ201410337720
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】王晓英 申请人:东南大学