便携式电化学定量免疫层析滤纸及其试纸和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了便携式电化学定量免疫层析滤纸及其试纸和应用，免疫层析滤纸是在疏水打印滤纸上设置亲水性的通道，通道一端设置为加样区，另一端为吸水区，加样区与吸水区之间设置电化学检测区，所述吸水区放置有吸水纸，所述电化学检测区包被有检测目标物质的抗原或抗体，利用免疫层析滤纸与导电膜和底板制成便携式电化学定量免疫层析试纸，该试纸可将免疫反应定量化分析，并排除非特异性的干扰，具有结果准确、测量精准等优点。
【专利说明】便携式电化学定量免疫层析滤纸及其试纸和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物传感【技术领域】，涉及便携式电化学免疫层析滤纸，还涉及含有便携式电化学免疫层析滤纸的试纸和该试纸的应用。
【背景技术】
[0002]目前对生化样品，如血液、尿液中的病原体或食品检测中的牛奶、果汁中有害污染物的检测诊断技术主要包括:放射免疫法(RIA)，酶联免疫试验(ELISA)、化学发光(CLIA)等方法，但这些方法都有各自的特点及不足:放射免疫技术成熟，结果比较准确，线性范围较宽，但操作繁琐，耗时长，且放射性标记物会对操作者产生危害，并且会产生环境污染，目前已经逐渐被其他方法所替代。ELISA和化学发光原理类似，只在灵敏度方面有差异，目前大都已经实现自动化、大批量、定量检测，但是存在方法间结果差异大，线性范围较窄等缺点，另外，自动化检测目前由国外大厂商所垄断，仪器设备昂贵，并且不适合单人份和较小批量检测用，大大限制了它们在基层单位或家庭及个人的应用。
[0003]免疫层析法(immunochromatography)是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，来提供对样品的定量检测数据，从而实现特异性的免疫诊断。与常规诊断方法相比，该技术分析速度快，全部检测过程仅需5-30分钟。操作简便，不需要其它任何仪器，无需专业人员，为实时实地检测提供了条件。检测样品种类多，可用于医疗、卫生、食品安全、环境检测中的血液、唾液、食物、水质、土壤等制备的微量溶液。但是该方法只能实现半定量，只能指示一个大概范围，无法实现精确定量，而且因为胶体金灵敏度的限制，无法检测游离蛋白，异常标本需要使用其他方法复核检测，无形中增加了检测成本，在市场推广方面有较大难度，很难大面积使用。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种便携式电化学定量免疫层析滤纸，本发明的目的之二在于提供含有便携式电化学定量免疫层析滤纸的试纸；本发明的目的之三在于提供上述试纸的应用。
[0005]为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案:
[0006]1.便携式电化学定量免疫层析滤纸，所述免疫层析滤纸是在疏水打印滤纸上设置亲水性单向通道，通道一端设置为加样区，另一端为吸水区，加样区与吸水区之间设置电化学检测区，所述吸水区放置有吸水纸，所述电化学检测区包被有检测目标物质的抗原或抗体。
[0007]优选的，所述加样区与电化学检测区之间还设置有抗体包被区，所述包被有特异结合目标物质的抗原或抗体。本发明中抗体包被区与加样区的最佳距离为0.3-0.8cm，抗体包被区与电化学检测区的最佳距离为0.5cm。
[0008]更优选的，所述疏水打印滤纸为石蜡打印滤纸。
[0009]2.含有所述便携式电化学定量免疫层析滤纸的试纸。
[0010]优选的，所所述试纸包括设置于便携式电化学定量免疫层析滤纸底部的底板，并在所述底板与便携式电化学定量免疫层析滤纸之间的电化学检测区设置对电极，便携式电化学定量免疫层析滤纸上表面的电化学检测区设置工作电极，所述工作电极与电化学检测区接触部位沉积有电化学检测物质，所述工作电极的非接触部位和对电极表面涂刷疏水绝缘材料。接触部位面积设置为3X3mm2时效果最佳，疏水且绝缘材料可以为环氧树脂或聚四氟乙烯，也可以为其他材料。
[0011]更优选的，所述电化学检测物质为石墨烯或聚吡咯。
[0012]更优选的，所述工作电极和对电极的材料为导电膜，最佳为柔性导电膜，其制成试纸后能够折叠，便于携带。
[0013]本发明中导电膜优选为单面导电膜，所述导电膜的导电层与所述电化学检测区贴
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[0014]更优选的，所述底板为透明PET膜。
[0015]最优选的，所述沉积电化学检测物质的方法为，取重蒸吡咯和吡咯-1-丙酸加入浓度0.0lMPBS溶液中，加入后吡咯与吡咯-1-丙酸的质量比为4:1，吡咯终浓度为0.1M，吡咯-1-丙酸终浓度为0.012M，然后超声混匀后通氮气除氧，将工作电极接触部位置入溶液中，在恒电流为1.5mA/cm2条件下沉积300s，沉积完成后用水清洗电极，再用含2mM EDC-HCl和5mM NHS的混合溶液滴加在沉积好的工作电极上反应I小时，反应完后清洗电极，然后在电极上滴加10 μ g/mL的人IgG并在37 V反应30min，接着用TBS缓冲液清洗，再用质量分数为5%的BSA封闭30min，封闭完成后用TBS清洗电极，即得。
[0016]3.所述的试纸在电化学定量免疫层析中的应用。可用于检测待检样品中蛋白、小分子化合物、毒素等的含量。
[0017]本发明的有益效果在于:本发明通过疏水性打印方法，在滤纸上打印反应通道，并构建出免疫层析的加样区、抗体固定区及检测反应发生区等功能区，以完成传统试纸条中需叠加多种材质的薄膜，以实现样品的分析，免疫反应等，进一步简化了试纸条的制备，然后将滤纸与工作电极和对电极组成电化学免疫层析试纸，工作电极与电化学检测区接触部位沉积能够进行电化学检测的物质，如石墨烯，聚吡咯等纳米材料，还可以将选择导电膜为工作电极和对电极，其制成后可以折叠，方便携带，因此本发明公开的试纸结构简单，成本低廉，可实现直接法免疫检测和竞争法免疫检测待检样品中的物质，并能进行定量检测，其可靠性好，能够在医疗检测、食品安全、水质监测等方面均有广泛潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
[0019]图1为电化学免疫层析滤纸(a:电化学直接法检测免疫层析滤纸；b:电化学竞争法检测免疫层析滤纸)。
[0020]图2为工作电极和对电极结构图(a =PET-1TO电极；b:工作电极上沉积了聚吡咯导电聚合物纳米材料的扫描电镜结构)。[0021]图3为便携式定量检测电化学免疫层析试纸结构图(a:便携式定量检测电化学免疫层析试纸的示意图；b:便携式定量检测电化学免疫层析试纸的实物图)。
[0022]图4为直接法检测待测溶液中抗人免疫球蛋白抗体的阻抗图谱。
【具体实施方式】
[0023]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0024]实施例1
[0025](I)便携式电化学定量免疫层析滤纸的制备(直接法)，通过石蜡打印机在滤纸上形成亲水性的单向通道1，打印后的滤纸在120°C热板上烘烤10分钟，然后在室温(18-25°C)冷却，通道一端设置为加样区2，另一端叠加吸水纸设置为吸水区3，以控制液体在滤纸上的流动，并在加样区与吸水区之间设置电化学检测区4，在电化学检测区4包被能够与目标物质(蛋白、小分子化合物、毒素)进行特异性结合的抗原或抗体，制得免疫层析滤纸结构如图1a所示。
[0026](2)便携式电化学定量免疫层析滤纸的制备(竞争法)，通过石蜡打印机在滤纸上形成亲水性的单向通道1，打印后的滤纸在120°C热板上烘烤10分钟，然后在室温(18-25°C)冷却，通道一端设置为加样区2，另一端叠加吸水纸设置为吸水区3，以控制液体在滤纸上的流动，并在加样区与吸水区之间设置电化学检测区4和抗体包被区5，抗体包被区5位于加样区2和电化学检测区4之间，在电化学检测区4和抗体包被区5包被能够与目标物质(蛋白、小分子化合物、毒素)进行特异性结合的抗原或抗体，包被后在该部位样品中的待检目标物质可与固定的抗体进行反应。本发明中，抗体包被区5与加样区2的距离为0.3-0.8cm时效果最佳，抗体包被区5与电化学检测区4的最佳距离为0.5cm，制得免疫层析滤纸结构如图1b所示。
[0027](3)电极的制备:低阻抗ITO导电膜(PET-1TO)作为制备工作电极6和对电极7的材料。其中，工作电极6的与电化学检测区4接触部位通过电沉积方法将能够进行电化学检测的聚吡咯等物质沉积(图2a);而非接触部位和对电极表面涂刷一层疏水且绝缘的环氧树脂或聚四氟乙烯。对电极7直接采用PET-1TO为电极(图2a)。电沉积溶液的配制:取重蒸吡咯和吡咯-1-丙酸加入0.0lM PBS溶液中，至吡咯与吡咯-1-丙酸的质量比为4:1，吡咯的浓度为0.1M、吡咯-1-丙酸的浓度为0.012M，超声Imin混合均匀后通氮气2min除氧，然后在恒电流为1.5mA/cm2条件下沉积300s。沉积完成后用水清洗电极二次，将新配制含2mMEDC-HCl和5mM NHS的混合溶液滴在沉积好的电极上反应I小时，反应完后清洗电极在电极上滴加10 μ g/mL的人IgG后在37°C反应30min，然后用TBS缓冲液清洗，再用质量分数为5%的BSA封闭30min，封闭完成后用TBS清洗电极，扫描电镜结构如图2b所示。本发明中工作电极的工作区设置为面积为3X3mm2效果最佳。
[0028]本发明中，工作电极的反应区也可以使用石墨烯进行电沉积用于电化学检测。
[0029](4)便携式电化学定量免疫层析试纸的组装:选择柔性透明PET膜作为试纸条的底板8 JfPET-1TO (IOXlOmm2)对电极覆盖在底板上，导电层向上；然后将制备的便携式电化学定量免疫层析滤纸覆盖在对电极7上，对电极7正对滤纸上的检测反应区；最后将工作电极6的导电层面对滤纸贴在滤纸上，其中工作电极7的工作区正对滤纸上的检测反应区。通过组装电极和免疫层析滤纸，组装成电极-滤纸-电极的三明治结构的便携式定量检测电化学免疫层析试纸，如图3所示。制得的免疫层析试纸能够实现传统胶体金标记抗体试纸条中通过在底板上依次相互交错2mm地粘贴包被膜、抗体结合区、样品垫、吸水垫等功能。
[0030]实施例2
[0031 ] 便携式电化学定量免疫层析试纸直接法检测
[0032]按照实施例1的方法制备便携式电化学定量免疫层析滤纸，并在电化学检测区包被检测抗体人IgG，经组装后进行检测。检测中，将样品50μ L按1:1000 (体积比)稀释的HRP羊抗人IgG抗体滴加入加样区，通过滤纸纤维的毛细管作用进入到电化学检测区，5-10分钟后，在电化学检测反应区加入20?50 μ L磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液的浓度为
0.01?0.05Μ，ρΗ为7.2-7.4)进行电化学阻抗图谱检测，检测时电压选开路电位为-0.06V,频率范围为100000到1，同时向加样区中加入不含HRP羊抗人IgG抗体的样品为对照，其他条件相同，然后进行电化学阻抗图谱检测，检测结果如图4所示。
[0033]然后根据公式:Λ R=OT-RtlVRtl计算出检测试纸在样品进行检测的前后阻抗值的变化系数，其中R’为检测后阻抗值，R0为检测前阻抗值。
[0034]与样品进行反应后，阻抗变化值为Λ R=(11330-3831)/3831=l.957
[0035]而对照样品反应值为:ΛR= (3697-3160)/3160=0.1699
[0036]因此，通过变化值的差别，可以对样品中是否含有目标物质进行检测，变化值越大，说明样品中待检物浓度越高。所以，利用本发明公开的便携式定量检测电化学免疫层析试纸能够进行定量检测。
[0037]本发明中也可以在电化学检测区包被其他特异蛋白或抗体用于检测其他目标物质。
[0038]同理，可以将本实施例中的免疫层析滤纸更换为电化学竞争法检测免疫层析滤纸，便携式定量检测电化学免疫层析试纸采用竞争法检测目标物质。
[0039]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.便携式电化学定量免疫层析滤纸，其特征在于:所述免疫层析滤纸是在疏水打印滤纸上设置亲水性单向通道，通道一端设置为加样区，另一端为吸水区，加样区与吸水区之间设置电化学检测区，所述吸水区放置有吸水纸，所述电化学检测区包被有检测目标物质的抗原或抗体。
2.根据权利要求1所述的便携式电化学定量免疫层析滤纸，其特征在于:所述加样区与电化学检测区之间还设置有抗体包被区，所述包被有特异结合目标物质的抗原或抗体。
3.根据权利要求1-2任一项所述的便携式电化学定量免疫层析滤纸，其特征在于:所述疏水打印滤纸为石蜡打印滤纸。
4.含有权利要求1-3任一项所述便携式电化学定量免疫层析滤纸的试纸。
5.根据权利要求4所述的试纸，其特征在于:所述试纸包括设置于便携式电化学定量免疫层析滤纸底部的底板，并在所述底板与便携式电化学定量免疫层析滤纸之间的电化学检测区设置对电极，便携式电化学定量免疫层析滤纸上表面的电化学检测区设置工作电极，所述工作电极与电化学检测区接触部位沉积有电化学检测物质，所述工作电极的非接触部位和对电极表面涂刷疏水绝缘材料。
6.根据权利要求5所述的试纸，其特征在于:所述电化学检测物质为石墨烯或聚吡咯。
7.根据权利要求5所述的试纸，其特征在于:所述工作电极和对电极的材料为导电膜。
8.根据权利要求5所述的试纸，其特征在于:所述底板为透明PET膜。
9.根据权利要求5所述的试纸，其特征在于:所述沉积电化学检测物质的方法为，取重蒸吡咯和吡咯-1-丙酸加入浓度0.0lM PBS溶液中，加入后吡咯与吡咯-1-丙酸的质量比为4:1，吡咯终浓度为0.1M，吡咯-1-丙酸终浓度为0.012M,然后超声混匀后通氮气除氧，将工作电极接触部位置入溶液中，在恒电流为1.5mA/cm2条件下沉积300s，沉积完成后用水清洗电极，再用含2mM EDC-HCl和5mM NHS的混合溶液滴加在沉积好的工作电极上反应I小时，反应完后清洗电极，然后在电极上滴加10 μ g/mL的人IgG并在37V反应30min，接着用TBS缓冲液清洗，再用质量分数为5%的BSA封闭30min，封闭完成后用TBS清洗电极，即得。
10.权利要求4-9任一项所述的试纸在电化学定量免疫层析中的应用。
【文档编号】G01N33/558GK103777003SQ201410039921
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】余玲, 史转转, 李长明 申请人:西南大学