免疫荧光法检测hla-dr表达量评估pbmc抗原呈递能力的方法
【专利摘要】本发明涉及临床检测领域，旨在提供一种免疫荧光法检测HLA-DR表达量评估PBMC抗原呈递能力的方法。该方法包括：从感染甲型H7N9的患者外周血中分离出外周血单个核细胞；通过免疫荧光检测HLA-DR的表达量；当HLA-DR占外周血单个核细胞PBMC的比例为27.56%～37.10%时，表示外周血单个核细胞抗原呈递能力处于正常范围；当HLA-DR占外周血单个核细胞PBMC的比例低于27.56%时，表示外周血单个核细胞呈递能力弱。本发明通过检测感染甲型H7N9的患者外周血液内HLA-DR的表达量来指示患者外周血单个核细胞的抗原提呈能力，能够更直观精准地提示患者感染的严重程度，为后期的诊治工作提供数据支持。
【专利说明】免疫荧光法检测HLA-DR表达量评估PBMC抗原呈递能力的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及临床检测领域，具体为检测外周血单个核细胞表面的HLA-DR表达量来评估其抗原呈递能力。
【背景技术】
[0002]外周血单个核细胞，PBMC(peripheralblood mononuclear cell),指外周血中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和其它少量细胞(造血干细胞等)。
[0003]HLA-DR是MHC-1I类分子，含有2个分子量分别为36kD和27kD的亚基(α亚基和β亚基)，该分子主要表达于B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、活化T淋巴细胞、活化NK淋巴细胞和人祖细胞上，是淋巴细胞抗原提呈的重要标志。HLA-DR用于外周血B淋巴细胞及单核细胞的计数；鉴定淋巴瘤及白血病；活化T淋巴细胞上HLA-DR抗原的表达及外周血、淋巴组织中树突状细胞亚群的研究。
[0004]免疫荧光技术是标记免疫技术中发展较成熟的一种。它是结合免疫学、生物化学和显微镜技术建立起来的一项技术。该技术通过将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫学的基本反应是抗原-抗体反应，具有高度的特异性。所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
[0005]根据检测目的不同，免疫荧光技术可分成两种:用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。但在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。该技术的主要特点是:特异性强、敏感性高、速度快。与放射免疫法相比，荧光免疫法还具有无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广等优点。
[0006]在脓毒血症等重度感染患者的外周血中HLA-DR随感染严重程度急剧下降。在感染和病原体清除过程中，抗原提呈是免疫应答激活的中心环节，包括抗原的吞噬，处理加工，呈递给效应细胞等过程。因此，找到与患者重度感染时抗原提呈能力相关的中心点，将会为临床治疗重度感染提供帮助。
[0007]现有技术中，对外周血单个核细胞抗原呈递能力的检测主要是通过普通流式细胞术实现的，多用于脓毒血症等细菌引起的感染性疾病。但该方法尚未得到确切的量化，在病毒感染的疾病中的应用也尚未明确提出。另外由于流式细胞术抽象，结果报告不易理解，检测方法的直观性也尚待进一步加强。因此，寻找一套替代方案是十分必要的。
【发明内容】
[0008]本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种免疫荧光法检测HLA-DR表达量评估PBMC抗原呈递能力的方法。[0009]为解决技术问题，本发明提供以下技术方案:
[0010]提供一种利用检测HLA-DR表达量评估外周血单个核细胞抗原呈递能力的方法，包括以下步骤:
[0011](I)从感染甲型H7N9的患者外周血全血中分离出外周血单个核细胞，即PBMC ；
[0012](2)通过免疫荧光检测HLA-DR的表达量；
[0013](3)当HLA-DR占PBMC的比例为27.56%?37.10% (是指平均值32.33%的95%可信区间)时，表示外周血单个核细胞抗原呈递能力处于正常范围；当HLA-DR占外周血单个核细胞PBMC的比例低于27.56%时，表示外周血单个核细胞呈递能力弱。
[0014]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0015]本发明通过检测感染甲型H7N9的患者外周血液内HLA-DR的表达量来指示患者外周血单个核细胞的抗原提呈能力，能够更直观精准地提示患者感染的严重程度，为后期的诊治工作提供数据支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为免疫荧光检测患者外周血分离的PBMC中HLA-DR的表达水平图。
[0017]图2为免疫荧光检测患者外周血单个核细胞吞噬细菌后PBMC中HLA-DR的表达水平图。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
[0019]本发明实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0020]图像处理软件:ImagePro Plus6.0
[0021]统计学方法:采用SPSS19.0统计分析软件分析，各样本均数的比较采用Studentttest分析。
[0022]全血样本采集管购自BD公司，ant1-HLA-DR —抗和FITC 二抗均购自BDPharmingen,抗体孵育冰箱购于青岛海尔公司，离心管和离心机购自Thermo公司，淋巴细胞分离液，多聚赖氨酸，多聚甲醛等生化试剂均购自上海盛兆生物科技有限公司。荧光显微镜购自Olympus。有关血样均由供血机构采集并提供，本发明不涉及采血行为本身。
[0023]具体实施例1:
[0024]免疫荧光法检测HLA-DR表达量评估PBMC抗原呈递能力的方法，包括以下步骤:
[0025](I)从感染甲型H7N9的患者外周血中全血分离出外周血单个核细胞PBMC ；
[0026]该步骤具体包括:
[0027]A、H7N9患者血的收集:
[0028]收集重症H7N9患者的外周血全血样本至少10例、轻症H7N9患者的外周血全血样本至少10例；(患者已通过年龄，体温等指标及根据临床表现评估的APACHE II和PMEWS评分明确诊断患有重症或轻症H7N9病毒感染)；另外收集国际健康保健中心健康体检对照者全血。[0029]B、患者PBMC的分离:
[0030]将收集到的全血样本，置于离心机中3000rpm离心5分钟。吸出血浆后，将剩余血细胞液加入到已放入等体积PBS的15毫升离心管中充分混匀。将混匀后的液体沿离心管壁缓慢加入到已放入与PBS等体积的人淋巴细胞分离液，注意不要与淋巴细胞分离液混合。上述操作完成后，将离心管置入离心机2000rpm离心20分钟,取出后，吸取中间“白毛”层到已放入PBS的离心管中，洗去多余杂质。
[0031 ] (2)通过免疫荧光检测HLA-DR的表达量；
[0032]该步骤具体包括:
[0033]A、细胞涂片的制备:将收集的PBMC配成浓度为106/ml的细胞悬液，吸出20微升液体滴于多聚赖氨酸处理过的载玻片的中间，做好相应标记。置于烘箱37度烘干后，PBS洗3遍，洗的过程注意轻柔。随后将玻片置于4%多聚甲醛固定20分钟，PBS洗5遍，烘干。随后向载破片上滴约20微升已配制好的一抗液体，室温孵育30分钟，PBS洗5遍，烘干。滴上二抗液体20微升，室温孵育20分钟，PBS洗5遍，烘干。滴上封片液，只需盖过涂有细胞的部分，盖上盖玻片，封片。
[0034]B、荧光显微镜下观察被荧光抗体染上颜色的细胞，拍照，处理图像。
[0035](3)当HLA-DR占外周血单个核细胞PBMC的比例为27.56%~37.10% (是指平均值32.33%的95%可信区间)时，表示外周血单个核阳性细胞抗原呈递能力处于正常范围；当HLA-DR占外周血单个核细胞PBMC的比例低于27.56%时，表示外周血单个核细胞呈递能力弱。并且，该比例数据与患者的感染严重程度呈负相关。
[0036]该步骤中，据以判断的数据来源是--丛2013年4月到2014年2月共收集健康人、感染科病人(包括除患有甲型H7N9禽流感的病人)共148例，两组群体年龄呈正态分布，实验比较，两组间特异性指标后归纳总结得出具有正常呈递能力外周血单个核细胞的HLA-DR表达量:平均32.33% (95%可信区间:27.56%~37.10%)，低于范围最低值的视为呈递能力弱。
[0037]具体实施例2:
[0038]免疫荧光法检测HLA-DR表达量评估PBMC抗原呈递能力的方法，包括以下步骤:
[0039](I)从感染甲型H7N9的患者外周血中分离出外周血单个核细胞PBMC ；
[0040]该步骤与具体实施例1的内容相同。
[0041 ] (2)通过免疫荧光检测HLA-DR的表达量；
[0042]该步骤具体包括:
[0043]A、细菌悬液的制备和细菌核的染色:将大肠杆菌菌株接种至LB培养板，于37摄氏度孵箱培养24小时后收集细菌，洗去杂质和死菌,弃去上清液体,加入配置好的4%多聚甲醛固定20min，洗去固定液后配置成109/ml细菌悬液，每毫升细菌悬液中加3微升DAPI染色液染色lOmin，随后待PBS洗净染色液后，制备成浓度为109/ml的细胞悬液。
[0044]B、单核细胞对细菌抗原的吞噬作用:将上述分离的PBMC以106/ml的浓度与细菌以1:10的比例按需加入培养板中，置于37摄氏度培养3小时。
[0045]C、单核细胞吞噬细菌后的抗原呈递能力的免疫荧光检测:将培养板的PBMC和细菌混合液取出，PBS洗去多余杂质，吸出20微升液体滴于多聚赖氨酸处理过的载玻片的中间，做好相应标记。置于烘箱37度烘干后，PBS洗3遍，洗的过程注意轻柔。随后将玻片置于4%多聚甲醛固定20分钟，PBS洗5遍，烘干。随后向载破片上滴约20微升已配制好的一抗液体，室温孵育30分钟，PBS洗5遍，烘干。滴上二抗液体20微升，室温孵育20分钟，PBS洗5遍，烘干。滴上封片液，只需盖过涂有细胞的部分，盖上盖玻片，封片。
[0046]D、荧光显微镜下观察被荧光抗体染上颜色的细胞，拍照，处理图像。
[0047](3)当HLA-DR占外周血单个核细胞PBMC的比例为27.56%?37.10%(是指平均值32.33%的95%可信区间)时，表示外周血单个核细胞抗原呈递能力处于正常范围；当HLA-DR占外周血单个核细胞PBMC的比例低于27.56%时，表示外周血单个核细胞呈递能力弱。并且，该比例数据与患者的感染严重程度呈负相关。
[0048]该步骤中，据以判断的数据来源与具体实施例1中一致。
[0049]应用实施1:
[0050]该实施例采用具体实施例1的操作步骤，收集浙江大学医学院附属第一医院感染科就诊的重症H7N9患者10例、轻症H7N9患者10例的全血样本。经检测，感染甲型H7N9病毒的重症病人的外周血单个核细胞中HLA-DR表达量在10.43%-14.42%之间，其数据显著低于感染甲型H7N9病毒的轻症患者的19.55%-31.46%这一数据(结果如图1所示)。
[0051]基于该分析结论，可以对病人感染严重程度加以判断，为后续采取相应减轻病人感染的措施提供量化依据。
[0052]应用实施2:
[0053]该实施例采用具体实施例2的操作步骤，收集浙江大学医学院附属第一医院感染科就诊的重症H7N9患者10例、轻症H7N9患者10例的全血样本。经检测，感染甲型H7N9病毒的重症病人的外周血单个核细胞中HLA-DR表达量均值为15.43%，其数据显著低于感染甲型H7N9病毒的轻症患者的25.42%这一数据(结果如图2所示)。
[0054]基于该分析结论，可以对病人感染严重程度加以判断，为后续采取相应减轻病人感染的措施提供量化依据。
【权利要求】
1.免疫荧光法检测HLA-DR表达量评估PBMC抗原呈递能力的方法，其特征在于，包括以下步骤: Cl)从感染甲型H7N9的患者外周血中分离出外周血单个核细胞，即PBMC ； (2)通过免疫荧光检测HLA-DR的表达量； (3)当HLA-DR占外周血单个核细胞PBMC的比例为27.56%~37.10%时，表示外周血单个核细胞抗原呈递能力处于正常范围；当HLA-DR占外周血单个核细胞PBMC的比例低于27.56%时，表示外周血单个核细胞呈递能力弱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括: A、H7N9患者血的收集: 收集重症H7N9患者的外周静脉血全血样本至少10例、轻症H7N9患者的外周静脉血全血样本至少10例；患者已通过年龄、体温指标及根据临床表现评估的APACHE II和PMEWS评分明确诊断患有重症或轻症H7N9病毒感染；另外收集健康体检对照者全血； B、患者PBMC的分尚: 将收集到的全血样本置于离心机中，3000rpm离心5分钟；吸出血浆后，将剩余血细胞液加入到已放入等体积PBS的15毫升离心管中充分混匀；将混匀后的液体沿离心管壁缓慢加入到已放入与PBS等体积的人淋巴细胞分离液，注意不要与淋巴细胞分离液混合；上述操作完成后，将离心管置入离心机2000rpm离心20分钟，取出后，吸取中间“白毛”层到已放入PBS的离心管中，洗去多余杂质。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括: A、细胞涂片的制备: 将收集的PBMC配成浓度为106/ml的细胞悬液，吸出20微升液体滴于多聚赖氨酸处理过的载玻片的中间，做好相应标记；置于烘箱37度烘干后，PBS洗3遍，洗的过程注意轻柔；随后将玻片置于4%多聚甲醛固定20分钟，PBS洗5遍，烘干；随后向载破片上滴约20微升已配制好的一抗液体，室温孵育30分钟，PBS洗5遍，烘干；滴上二抗液体20微升，室温孵育20分钟，PBS洗5遍，烘干；滴上封片液，只需盖过涂有细胞的部分，盖上盖玻片，封片； B、荧光显微镜下观察被荧光抗体染上颜色的细胞，拍照，处理图像。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括: A、细菌悬液的制备和细菌核的染色: 将大肠杆菌菌株接种至LB培养板，于37摄氏度孵箱培养24小时后收集细菌，洗去杂质和死菌,弃去上清液体,加入配置好的4%多聚甲醛固定20min，洗去固定液后配置成IO9/ml细菌悬液，每毫升细菌悬液中加3微升DAPI染色液染色lOmin，随后待PBS洗净染色液后，制备成浓度为109/ml的细胞悬液； B、单核细胞对细菌抗原的吞噬作用: 将上述分离的PBMC以106/ml的浓度与细菌以1:10的比例按需加入培养板中，共分成两孔，置于37摄氏度培养3小时； C、单核细胞吞噬细菌后的抗原呈递能力的流式检测: 将前一步骤中培养板一孔的PBMC和细菌混合液取出，PBS洗去多余杂质，定容成500微升加入流式管置于流式细胞仪上样架，选择相应通道上机检测CD14和大肠杆菌指标的表 达量;D、单核细胞吞噬细菌后的抗原呈递能力的免疫荧光检测: 将培养板另一孔的PBMC和细菌混合液取出，PBS洗去多余杂质，吸出20微升液体滴于多聚赖氨酸处理过的载玻片的中间，做好相应标记；置于烘箱37度烘干后，PBS洗3遍，洗的过程注意轻柔；随后将玻片置于4%多聚甲醛固定20分钟，PBS洗5遍，烘干；随后向载破片上滴约20微升已配制好的一抗液体，室温孵育30分钟，PBS洗5遍，烘干；滴上二抗液体20微升，室温孵育20分钟，PBS洗5遍，烘干；滴上封片液，只需盖过涂有细胞的部分，盖上盖玻片，封片； E、荧光显微镜下观察被 荧光抗体染上颜色的细胞，拍照，处理图像。
【文档编号】G01N33/68GK103869082SQ201410098829
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】刁宏燕, 陈佳宁, 魏应凤, 崔光莹, 丁玉龙 申请人:浙江大学