一种人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法
【专利摘要】本发明公开了一种人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法，属于蛋白质定量分析【技术领域】，包括：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离人血清中转铁蛋白、白蛋白，开发的“电泳后同位素稀释”方法向蛋白条带上加入富集同位素34S稀释剂，LA-ICP-MS检测蛋白条带中32S+/34S+比值，对人血清中转铁蛋白、白蛋白进行定量分析。本发明建立的电泳后同位素稀释定量方法试剂配制简单、过程简便快捷、无需制备特异性稀释剂，而且定量方法在PAGE-LA-ICP-MS联用技术中的应用克服了目前蛋白质定量技术中特异性稀释剂种类有限带来的只能对某些蛋白质定量的难题，可推广应用到复杂样品中大多数蛋白质的定量分析。
【专利说明】一种人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白质定量分析【技术领域】，涉及一种人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法，尤其涉及聚丙烯酰胺凝胶电泳-激光烧蚀进样的电感耦合等离子体质谱联用技术结合电泳后同位素稀释法(PAGE-LA-1D-1CP-MS)定量人血清蛋白质的方法。
【背景技术】
[0002]随着蛋白质组学的迅速发展，蛋白质定量分析【技术领域】成为各国研究的热点，保证蛋白质定量结果的准确可比性是目前研究的难点。传统的蛋白质定量方法常采用凝胶电泳分离样品中待测蛋白质后，对凝胶上蛋白质点进行酶解处理，然后用电喷雾电离质谱或基质辅助激光解吸质谱等有机质谱进行定性、定量分析。然而定量分析中有机质谱的信号响应与蛋白质含量关系复杂，不能直接进行定量。
[0003]激光烧蚀进样的电感耦合等离子体质谱联用技术(LA-1CP-MS)是近年来迅速发展起来的一种固体微区原位分析技术，不仅具有ICP-MS的检测限低、信号响应与分子环境无关等优点，而且可对固体样品直接进行分析，还能对生物组织及细胞中的元素分布进行成像。LA-1CP-MS与凝胶电泳联用，可对分离的蛋白质直接进行定量分析，无需酶解、衍生等处理。其中硫(S)由于在蛋白质中普遍存在、含量大、稳定性高，常被作为蛋白质定量分析的元素。但是ICP-MS测定硫容易受到同量异位素1602+、多原子离子14N18O+等多种离子的谱线干扰，目前基于硫来定量蛋白质的PAGE-LA-1CP-MS文献研究较少，且主要涉及标准蛋白。
[0004]同位素稀释法(ID)是国际公认的权威性化学计量方法，如果能将PAGE-LA-1CP-MS与ID结合，将为无机质谱定量蛋白质技术提供新的思路。目前，基于ID技术的PAGE-LA-1CP-MS蛋白质定量分析中，主要是特异性同位素稀释法(Species-specificisotope dilution)，制备的特异性金属蛋白同位素稀释剂直接加入到待测样品中，具有传统同位素稀释法的优点，但是可人工合成的稀释剂仅有转铁蛋白、超氧化物歧化酶、铜蓝蛋白、铁蛋白等有限的蛋白质，不能用于人血清中多种蛋白质同时定量。而非特异性同位素稀释法(Species-unspecific isotope dilution),以某元素的简单离子作为同位素稀释剂，基本都有商品化的产品，但是主要应用在高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-1CP-MS)联用定量蛋白质中，在PAGE-LA-1CP-MS的应用很少，其中定量分析存在的两个主要技术难点是如何实现同位素稀释剂的加入、如何确定激光烧蚀气溶胶中样品与稀释剂的质量。因此，将非特异性同位素稀释法应用到PAGE-LA-1CP-MS，对人血清中含硫蛋白进行定量分析还未见报道。
【发明内容】
[0005]为解决现有技术中出现的问题，本发明提供了一种人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法，尤其涉及聚丙烯酰胺凝胶电泳-激光烧蚀进样的电感耦合等离子体质谱联用技术结合电泳后同位素稀释法(PAGE-LA-1D-1CP-MS)定量人血清蛋白质的方法。本发明克服了特异性稀释剂种类有限带来的只能对某些蛋白质定量的难题，可对大多数蛋白质进行定量分析，效果理想，具有良好的应用前景。
[0006]本发明的目的是提供一种人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法，包括:非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离人血清中转铁蛋白、白蛋白；开发的“电泳后同位素稀释”方法向蛋白条带上加入富集同位素34S稀释剂；LA-1CP-MS检测蛋白条带中32S+/34S+比值，对人血清中转铁蛋白、白蛋白进行定量分析。
[0007]本发明所述的方法，具体步骤包括:
[0008](I)待测样品的前处理:包括人血清蛋白标准物质(CRM)的重构，标准转铁蛋白、白蛋白样品溶液的配制，及样品(CRM、标准转铁蛋白溶液、正常人血清样品)的Fe富集处理；
[0009](2)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离待测样品:采用垂直板微型凝胶电泳系统对待测样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳使用溶液中不含蛋白质变性剂，待测样品不经变性处理。根据转铁蛋白、白蛋白标准品的电泳条带位置确定CRM、正常人血清中的转铁蛋白、白蛋白位置；
[0010](3)电泳后同位素稀释:电泳、染色、脱色处理后，切取待测蛋白条带，浸泡在25?50 μ g/g的富集同位素34S稀释剂中2?lOmin，取出转移到甘油中浸泡2?5min，再将凝胶转移到载玻片上，室温过夜干燥，待测备用；
[0011](4) LA-1CP-MS检测:采用激光烧蚀仪LSX213，对待测蛋白条带进行脉冲激光烧蚀进样，产生的气溶胶直接输送到ICP炬管；ICP-MS采用Element2扇形磁场电感耦合等离子体质谱仪，对蛋白条带上的32S+、34S+信号进行检测，得到以烧蚀时间/s为横坐标，硫元素信号强度/cps为纵坐标的谱图；
[0012](5)待测蛋白样品的定量计算:
[0013]以已知浓度的转铁蛋白、白蛋白标准品作为样品，根据同位素稀释法公式得出mz/my值(激光烧蚀气溶胶中样品和稀释剂的质量比)，然后将转铁蛋白、白蛋白的mz/my值分别应用到人血清中转铁蛋白、白蛋白的定量分析，结合LA-1CP-MS检测的相应蛋白中32S+/34S+比值，再次利用同位素稀释法公式计算得到人血清转铁蛋白、白蛋白中硫元素浓度，根据相应蛋白质中硫的化学计量比，即可计算出人血清中转铁蛋白、白蛋白的浓度。
[0014]所述步骤(4)中激光烧蚀仪LSX213的工作条件为:激光能量2.0?4.0mJ/脉冲，扫描频率10?20Hz，光斑尺寸100?200 μ m，扫描速度30?60 μ m/s，烧蚀方式:线扫描。
[0015]所述步骤(4)中电感耦合等离子体质谱仪Element2的分辨率为4000，消除同量异位素1602+、多原子离子14N18O+等对32S+的谱线干扰；工作条件为:功率1100?1400W，样品气流速0.90?1.20L/min,辅助气流速1.0O?1.40L/min,冷却气流速15?20L/min，扫描次数 700X1。
[0016]采用上述技术方案，本发明可以达到的技术效果是:
[0017](I)开发的“电泳后同位素稀释”方法操作简便、容易实现，成功在转铁蛋白、白蛋白条带上加入富集同位素34S稀释剂，无需针对待测蛋白制备特异性稀释剂。
[0018](2)将非特异性同位素稀释法(即电泳后同位素稀释)应用到PAGE-LA-1CP-MS联用技术，克服了特异性同位素稀释法只能对某些蛋白质定量的难题，可对大多数蛋白质进行定量分析。[0019](3)采用电泳后同位素稀释电感耦合等离子体质谱基准方法对人血清中转铁蛋白、白蛋白含量进行测定，保证了定量结果的准确性。
[0020](4)采用Tris-HAc缓冲液溶解标准蛋白(转铁蛋白、白蛋白)、人血清蛋白标准物质、人血清样品，提高了待测蛋白的溶解度。
【专利附图】
【附图说明】
[0021 ]图1为实施例1人血清蛋白标准物质(CRM)、标准转铁蛋白、白蛋白的凝胶电泳图；
[0022]图2为实施例1人血清蛋白标准物质(CRM)中转铁蛋白的LA_ID_ICP_MS谱图；
[0023]图3为实施例1人血清蛋白标准物质(CRM)中白蛋白的LA_ID_ICP_MS谱图；
[0024]图4为实施例2基体样品正常人血清中转铁蛋白的LA-1D-1CP-MS谱图；
[0025]图5为实施例2基体样品正常人血清中白蛋白的LA-1D-1CP-MS谱图。
【具体实施方式】
[0026]为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明:
[0027]实施例1
[0028]实施例样品为人血清蛋白标准物质(CRM)。
[0029](I)待测样品的预处理:
[0030]I)人血清蛋白标准物质(CRM)的重构:编号为ERM-DA470/IFCC的人血清蛋白标准物质在使用前一天，从_18°C冰箱中取出，室温放置Ih后移去样品瓶的螺栓帽。分析天平称重样品瓶及橡胶塞并清零，慢慢提升橡胶塞直到空气进入其中，用移液器通过橡胶塞的凹槽小心加入ImL超纯水，将橡胶塞放回原位，称重m=l.0185g。室温放置lh，在之后的Ih中小心倒置至少5次，室温下过夜放置。使用当天，Ih里至少倒置5次。
[0031]2)标准转铁蛋白、白蛋白样品溶液的配制:分析天平准确称取3.3mg标准转铁蛋白、6.5mg标准白蛋白，分别溶解在25mmol/Kg Tris-HAc缓冲液中，得到样品溶液。
[0032]3)标准转铁蛋白溶液、人血清蛋白标准物质的Fe富集处理:分别向100 μ L标准转铁蛋白溶液、IOOyL重构的人血清蛋白标准物质(CRM)中加入300 μ L25mmol/KgTris-HAc 缓冲液,5 μ L500mmol/Kg Na2CO3溶液,5 μ LIOmmoI/Kg FeCl3溶液,室温下孵育 2h,备用。
[0033](2)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离待测样品:分离胶浓度为7%，浓缩胶浓度为4%，所有电泳使用溶液中均不含蛋白质变性剂，待测样品不经变性处理。具体电泳参数为:电泳缓冲液:25mmol/Kg TrisU92mmol/Kg Gly缓冲液pH8.8，使用时超纯水稀释10倍；上样量16yL，其中待测样品:上样缓冲液(体积比)=4: 1，为避免相邻泳道间蛋白质交叉污染，间隔一个空白泳道进行上样，空白泳道中加入上样缓冲液；室温下保持恒压100V电泳IOOmin左右。电泳后，取下凝胶玻璃板，用考马斯亮蓝染色液(0.25%考马斯亮蓝R-250，40%甲醇，10%醋酸)染色15min。然后，凝胶在脱色液(40%甲醇，10%醋酸，50%超纯水)中多次脱色直到蛋白条带清晰。人血清蛋白标准物质CRM、标准转铁蛋白、标准白蛋白的凝胶电泳图见图1，从标准转铁蛋白、标准白蛋白的电泳条带位置可以确定CRM中转铁蛋白、白蛋白位置。[0034]非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的7%分离胶组成为:胶贮液2.33mL、分离胶缓冲液2.5mL、10%过硫酸铵35yL、四甲基乙二胺15yL、超纯水5.12mL ;4%浓缩胶组成为:胶贮液0.67mL、浓缩胶缓冲液1.25mL、10%过硫酸铵35 μ L、四甲基乙二胺15 μ L、超纯水3.03mL。其中，所述的胶贮液为:称取29g丙烯酰胺和Ig甲叉双丙烯酰胺，去离子水溶解至IOOmL,用滤器(0.45μηι孔径)过滤后置于容量瓶,4°C保存；分离胶缓冲液为:称取18.2g三羟甲基氨基甲烷Tris，溶于80mL超纯水中，加浓盐酸调节pH值，pH计随时监测pH值变化，调节pH值到8.8，加超纯水定容至100mL，4°C保存；浓缩胶缓冲液为:称取6.0g三羟甲基氨基甲烷Tris，溶于80mL超纯水中，加浓盐酸调节pH值，pH计随时监测pH值变化，调节pH值到6.8，加超纯水定容至100mL，4°C保存；上样缓冲液:取浓缩胶缓冲液(0.5mol/LTris-HCl, pH6.8) 3.lmL、甘油5mL、0.4%溴酚蓝溶液L 25mL及超纯水0.65mL,混合均匀。
[0035](3)电泳后同位素稀释:电泳、染色、脱色处理后，分别切取标准转铁蛋白、标准白蛋白、CRM中转铁蛋白、CRM中白蛋白条带，浸泡在31.52 μ g/g的富集同位素34S稀释剂中lOmin，取出转移到甘油中浸泡2min，再将凝胶转移到载玻片上，室温过夜干燥，待测备用。
[0036]分别切取标准转铁蛋白、标准白蛋白、CRM电泳条带中的空白条带，不经稀释剂浸泡处理，直接在甘油中浸泡2min，转移到载玻片上，室温过夜干燥，待测备用。
[0037](4) LA-1CP-MS检测:采用激光烧蚀仪LSX213，对待测蛋白条带及空白条带进行脉冲激光烧蚀进样，产生的气溶胶直接输送到ICP炬管。ICP-MS采用Element2扇形磁场电感耦合等离子体质谱仪，在分辨率m/ Δ m=4000条件下消除同量异位素1602+、多原子离子14N18O+等对32S+的谱线干扰，ICP-MS分别对蛋白条带及空白条带上的32S+、34S+信号进行检测，得到以烧蚀时间/s为横坐标，硫元素信号强度/cps为纵坐标的谱图。
[0038]激光烧蚀仪LSX213的工作条件为:激光能量3.0mJ/脉冲，扫描频率20Hz，光斑尺寸200 μ m，扫描速度30 μ m/s，烧蚀方式:线扫描。
[0039]电感耦合等离子体质谱仪Element2的工作条件为:功率1233W，样品气流速
1.llL/min，辅助气流速0.96L/min，冷却气流速16.0OL/min，分辨率m/Λ m4000 ;扫描次数700X1。
[0040](5)血清样品中转铁蛋白、白蛋白的定量计算:
[0041]根据下面的同位素稀释公式
【权利要求】
1.一种人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法，其特征在于所述方法包括:非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离人血清中转铁蛋白、白蛋白；开发的“电泳后同位素稀释方法”向蛋白条带上加入富集同位素34S稀释剂；LA-1CP-MS检测蛋白条带中32S+/34S+比值，对人血清中转铁蛋白、白蛋白进行定量分析。
2.如权利要求1所述的人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法，其特征在于所述方法包括: (1)待测样品的前处理:包括人血清蛋白标准物质(CRM)的重构，标准转铁蛋白、白蛋白样品溶液的配制，及样品(CRM、标准转铁蛋白溶液、正常人血清样品)的Fe富集处理； (2)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离待测样品:采用垂直板微型凝胶电泳系统对待测样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳使用溶液中不含蛋白质变性剂，待测样品不经变性处理。根据转铁蛋白、白蛋白标准品的电泳条带位置确定CRM、正常人血清中的转铁蛋白、白蛋白位置； (3)电泳后同位素稀释:电泳、染色、脱色处理后，切取待测蛋白条带，浸泡在25?50 μ g/g的富集同位素34S稀释剂中2?lOmin，取出转移到甘油中浸泡2?5min，再将凝胶转移到载玻片上，室温过夜干燥，待测备用； (4)LA-1CP-MS检测:采用激光烧蚀仪LSX213，对待测蛋白条带进行脉冲激光烧蚀进样，产生的气溶胶直接输送到ICP炬管；ICP-MS采用Element2扇形磁场电感耦合等离子体质谱仪，对蛋白条带上的32S+、34S+信号进行检测，得到以烧蚀时间/s为横坐标，硫元素信号强度/cps为纵坐标的谱图； (5)待测蛋白样品的定量计算: 以已知浓度的转铁蛋白、白蛋白标准品作为样品，根据同位素稀释法公式得出mz/my值(激光烧蚀气溶胶中样品和稀释剂的质量比)，然后将转铁蛋白、白蛋白的mz/my值分别应用到人血清中转铁蛋白、白蛋白的定量分析，结合LA-1CP-MS检测的相应蛋白中32S+/34S+比值，再次利用同位素稀释法公式计算得到人血清转铁蛋白、白蛋白中硫元素浓度，根据相应蛋白质中硫的化学计量比，即可计算出人血清中转铁蛋白、白蛋白的浓度。
3.根据权利要求2所述的人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法，其特征在于:所述步骤⑷中激光烧蚀仪LSX213的工作条件为:激光能量2.0?4.0mJ/脉冲，扫描频率10?20Hz，光斑尺寸100?200 μ m,扫描速度30?60 μ m/s，烧蚀方式:线扫描。
4.根据权利要求2所述的人血清蛋白质电泳后同位素稀释质谱定量方法，其特征在于:所述步骤(4)中电感耦合等离子体质谱仪Element2的分辨率为4000，消除同量异位素1602+、多原子离子14N18O+等对32S+的谱线干扰；工作条件为:功率1100?1400W，样品气流速.0.90?1.20L/min,辅助气流速1.0O?1.40L/min,冷却气流速15?20L/min,扫描次数700X1。
【文档编号】G01N27/62GK103837593SQ201410098779
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】冯流星, 张丹, 王军, 熊金平 申请人:中国计量科学研究院