一种同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，包括如下步骤：(1)合成同位素标记的胰岛素B链并配制成溶液作为内标；(2)制备胰岛素标准和胰岛素样品溶液；(3)取胰岛素标准溶液和样品溶液并分别加入同位素标记的胰岛素B链；(4)将所述预处理后的胰岛素标准溶液和胰岛素样品进行质谱分析；(5)计算所述胰岛素样品溶液中胰岛素含量。本发明同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法具有准确度高，结果可靠的优点。
【专利说明】一种同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种测定胰岛素含量的方法，尤其涉及一种同位素稀释质谱法测定胰 岛素含量的方法。
【背景技术】
[0002] 目前，胰岛素的定量检测方法有电化学发光免疫分析法、化学发光免疫分析法、酶 联免疫吸附法、流式免疫微球技术、高效液相色谱法、质谱方法等。其中，电化学发光免疫分 析法由于其并非开放性试剂系统，因此试剂价格过高；化学发光免疫分析法在分析过程中 工作曲线会随时间飘移；酶联免疫吸附法对操作要求较高，每一步操作环节都会对实验结 果产生影响；流式免疫微球技术对免疫试剂要求高、试剂制备难度大；高效液相色谱法的 仪器成本高，分析时间较长；质谱方法的检测时间较快，特别是与液相色谱法相比较，大大 节省了液相分离的时间，并且具有高灵敏度和准确度。
[0003] 同位素稀释质谱法是一种权威的利用同位素丰度比来检测推算化合物含量的方 法，主要是利用质谱测定加入了同位素标记的待测物的样品中标记及非标记待测物峰面积 或峰高的比值来推算待测物在样品中的浓度。该方法具有绝对测量、灵敏度高、准确性好、 分析的准确度在±2%左右、动态测量范围宽、样品制备没有定量分离的严格要求并且其测 量值的溯源性好的特点。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种安全可靠的胰岛素含量的方法，本发明方法 可以对样品中的胰岛素含量直接进行测定。
[0005] -种同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，包括如下步骤：
[0006] (1)合成同位素标记的胰岛素B链肽段并配制成同位素标记的胰岛素B链肽段溶 液作为内标；
[0007] (2)制备胰岛素标准溶液和胰岛素样品溶液；
[0008] (3)将所述胰岛素标准溶液和所述胰岛素样品溶液进行预处理：取所述胰岛素样 品溶液lmL并称重，加入lmL所述同位素标记的胰岛素B链肽段溶液并称重，混匀得到加标 溶液，然后还原，得到还原后的胰岛素样品溶液，根据所述胰岛素样品溶液中胰岛素的质量 分数进行预处理；所述预处理步骤如下：将所述还原后的胰岛素样品溶液进行固相萃取后 用MALDI-T0F基质混匀后点在靶板上，自然晾干；当所述胰岛素样品溶液中胰岛素质量分 数> 10_7g/g时，将所述还原后的胰岛素样品溶液用MALDI-T0F基质混匀后点在靶板上，自 然晾干；或将其进行固相萃取后用MALDI-T0F基质混匀后点在靶板上，自然晾干；取所述胰 岛素标准溶液lmL按照与上述步骤同样的步骤进行预处理；
[0009] (4)将预处理后的所述胰岛素标准溶液和所述胰岛素样品溶液进行质谱分析；
[0010] (5)计算所述胰岛素样品溶液中胰岛素含量。
[0011] 本发明所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，其中，所述步骤（1)具体 包括如下步骤：以氘标记的两个缬氨酸合成胰岛素B链FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT形成同位素标记的胰岛素B链肽段，准确称取lmg所述同位素标记的胰岛素B链，溶解 于0. 1%甲酸水中，准确配制成质量分数为lmg/g的所述同位素标记的胰岛素B链母液并 分装至0. 2mL的离心管中，每管分装10yL，所述分装好的同位素标记的胰岛素B链母液 在-80°C冰箱中保存，将所述分装好的同位素标记的胰岛素B链母液移入15mL的离心管中 并用浓度为〇.lmg/mL的BSA溶液稀释至1(T8?l(T6g/g，得到作为内标的同位素标记的胰 岛素B链肽段溶液，现用现配，在定量中作为内标。
[0012] 本发明所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，其中，所述步骤（2)具体 包括如下步骤：
[0013] 准确称取lmg人胰岛素，溶解于0. 1%甲酸水中，准确配制成人胰岛素质量分数 为lmg/g的人胰岛素母液并分装至0. 2mL的离心管中，每管分装lOiiL，分装好的人胰岛素 母液在-80°C冰箱中保存，将所述分装好的人胰岛素母液移入15mL的离心管中并用浓度为 0.lmg/mL的BSA溶液稀释至1(T8?l(T6g/g，得到所述胰岛素标准溶液，现用现配；制备所 述胰岛素样品溶液的步骤与制备所述胰岛素标准溶液的步骤相同。
[0014] 本发明所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，其中，所述还原步骤如下： 向所述加标溶液中加入相当于所述加标溶液体积3. 5% -6. 5%的还原剂溶液，所述还原剂 溶液为用50mmol/L的碳酸氢铵溶液溶解二硫苏糖醇得到的溶液，所述还原剂溶液中所述 二硫苏糖醇的浓度为lmol/L;涡旋混匀后在55°C-65°C水浴锅中加热13min-17min。
[0015] 本发明所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，其中，所述步骤（3)具体 包括如下步骤：
[0016] 将所述还原后的胰岛素样品溶液冷却至室温，加入相当于所述加标溶液体积 3. 5% -6. 5%的浓度为lmol/L烷基化试剂溶液，所述烷基化试剂为碘乙酰胺，所述烷基化 试剂溶液由50mmol/L的碳酸氢铵溶液溶解碘乙酰胺得到，涡旋混匀后暗反应40min，再加 入相当于所述加标溶液体积13. 5% -16. 5%的浓度为lmol/L的所述还原剂溶液来终止烷 基化反应，根据所述胰岛素样品溶液中胰岛素的质量分数进行预处理；所述预处理步骤如 下：将终止烷基化的所述胰岛素样品溶液进行固相萃取后用MALDI-T0F基质混匀后点在靶 板上，自然晾干；当所述胰岛素样品溶液中胰岛素质量分数>l(T7g/g时，将所述终止烷基 化的胰岛素样品溶液用MALDI-T0F基质混匀后点在祀板上，自然晾干；或将其进行固相萃 取后用MALDI-T0F基质混匀后点在靶板上，自然晾干；所述胰岛素标准溶液按照与上述步 骤同样的步骤进行预处理。
[0017] 本发明所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，其中，所述质谱分析参数 为：选用反射正离子检测模式，m/z采集范围为600Da-6000Da，每个样品点设激光随机射 击39900个点进行叠加，每次射击300次，监测还原后的胰岛素B链的信号强度，即m/z= 3429-3433时的信号强度；检测同位素标记的B链的信号强度，即m/z= 3445-3449时的信 号强度。
[0018] 本发明所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，其中，所述质谱分析参数 为：选用线性正离子检测模式，m/z采集范围为600Da-6000Da，每个样品点设激光随机射击 39900个点进行叠加，每次射击300次，监测还原后的胰岛素B链的还原烷基化肽段的信号 强度，即m/z= 3543-3547时的信号强度；检测同位素标记的胰岛素烷基化肽段的信号强 度，即m/z= 3557-3561时的信号强度。
[0019] 本发明所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，其中，所述计算所述胰岛 素样品溶液中胰岛素含量的计算方法如下：
[0020] 按照公式（1)计算样品溶液中胰岛素的含量：
【权利要求】
1. 一种同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 合成同位素标记的胰岛素B链肽段并配制成同位素标记的胰岛素B链肽段溶液作 为内标； (2) 制备胰岛素标准溶液和胰岛素样品溶液； (3) 将所述胰岛素标准溶液和所述胰岛素样品溶液进行预处理：取所述胰岛素样品溶 液ImL并称重，加入ImL所述同位素标记的胰岛素B链肽段溶液并称重，混匀得到加标溶 液，然后还原，得到还原后的胰岛素样品溶液，根据所述胰岛素样品溶液中胰岛素的质量分 数进行预处理；所述预处理步骤如下：将所述还原后的胰岛素样品溶液进行固相萃取后用 MALDI-TOF基质混匀后点在靶板上，自然晾干；当所述胰岛素样品溶液中胰岛素质量分数 >l(T7g/g时，将所述还原后的胰岛素样品溶液用MALDI-T0F基质混匀后点在靶板上，自然 晾干；或将其进行固相萃取后用MALDI-T0F基质混匀后点在靶板上，自然晾干；取所述胰岛 素标准溶液ImL按照与上述步骤同样的步骤进行预处理； (4) 将预处理后的所述胰岛素标准溶液和所述胰岛素样品溶液进行质谱分析； (5) 计算所述胰岛素样品溶液中胰岛素含量。
2. 根据权利要求1所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，其特征在于，所述 步骤（1)具体包括如下步骤：以氘标记的两个缬氨酸合成胰岛素B链形成同位素标记的胰 岛素B链肽段，准确称取Img所述同位素标记的胰岛素B链，溶解于0. 1 %甲酸水中，准确配 制成质量分数为lmg/g的所述同位素标记的胰岛素B链母液并分装至0. 2mL的离心管中， 每管分装10μL，所述分装好的同位素标记的胰岛素B链母液在-80°C冰箱中保存，将所述 分装好的同位素标记的胰岛素B链母液移入15mL的离心管中并用浓度为0.lmg/mL的BSA 溶液稀释至1〇_8?l〇_6g/g，得到作为内标的同位素标记的胰岛素B链肽段溶液，现用现配， 在定量中作为内标。
3. 根据权利要求1所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，其特征在于，所述 步骤（2)具体包括如下步骤： 准确称取Img人胰岛素，溶解于0. 1 %甲酸水中，准确配制成人胰岛素质量分数为lmg/g的人胰岛素母液并分装至0. 2mL的离心管中，每管分装10μL，分装好的人胰岛素母 液在-80°C冰箱中保存，将所述分装好的人胰岛素母液移入15mL的离心管中并用浓度为 0.lmg/mL的BSA溶液稀释至KT8?l(T6g/g，得到所述胰岛素标准溶液，现用现配；制备所 述胰岛素样品溶液的步骤与制备所述胰岛素标准溶液的步骤相同。
4. 根据权利要求1所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，其特征在于，所述 还原步骤如下：向所述加标溶液中加入相当于所述加标溶液体积3. 5% -6. 5%的还原剂 溶液，所述还原剂溶液为用50mmol/L的碳酸氢铵溶液溶解二硫苏糖醇得到的溶液，所述 还原剂溶液中所述二硫苏糖醇的浓度为lmol/L;涡旋混匀后在55°C-65°C水浴锅中加热 13min_17min〇
5. 根据权利要求4所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，其特征在于，所述 步骤（3)具体包括如下步骤： 将所述还原后的胰岛素样品溶液冷却至室温，加入相当于所述加标溶液体积 3. 5% -6. 5 %的浓度为lmol/L烷基化试剂溶液，所述烷基化试剂为碘乙酰胺，所述烷基化 试剂溶液由50mmol/L的碳酸氢铵溶液溶解碘乙酰胺得到，涡旋混匀后暗反应40min，再加 入相当于所述加标溶液体积13. 5% -16. 5%的浓度为lmol/L的所述还原剂溶液来终止烷 基化反应，根据所述胰岛素样品溶液中胰岛素的质量分数进行预处理；所述预处理步骤如 下：将终止烷基化的所述胰岛素样品溶液进行固相萃取后用MALDI-T0F基质混匀后点在靶 板上，自然晾干；当所述胰岛素样品溶液中胰岛素质量分数>l(T7g/g时，将所述终止烷基 化的胰岛素样品溶液用MALDI-T0F基质混匀后点在祀板上，自然晾干；或将其进行固相萃 取后用MALDI-T0F基质混匀后点在靶板上，自然晾干；所述胰岛素标准溶液按照与上述步 骤同样的步骤进行预处理。
6. 根据权利要求4所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，其特征在于，所述 质谱分析参数为：选用反射正离子检测模式，m/z采集范围为600Da-6000Da，每个样品点 设激光随机射击39900个点进行叠加，每次射击300次，监测还原后的胰岛素B链的信号 强度，即m/z=3429-3433时的信号强度；检测同位素标记的B链的信号强度，即m/z= 3445-3449时的信号强度。
7.根据权利要求5所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，其特征在于，所述 质谱分析参数为：选用线性正离子检测模式，m/z采集范围为600Da-6000Da，每个样品点设 激光随机射击39900个点进行叠加，每次射击300次，监测还原后的胰岛素B链的还原烷基 化肽段的信号强度，即m/z=3543-3547时的信号强度；检测同位素标记的胰岛素烷基化肽 段的信号强度，即m/z=3557-3561时的信号强度。
8. 根据权利要求6所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，其特征在于，所述 计算所述胰岛素样品溶液中胰岛素含量的计算方法如下： 按照公式（1)计算样品溶液中胰岛素的含量：
Rm-Std_标准溶液中胰岛素与标记的B链的质量比； Rh_std-标准溶液中非标记的胰岛素B链还原肽段与标记的B链的峰高比或峰面积比； Ry-样品溶液中非标记的胰岛素B链还原肽段与标记的B链的峰高比或峰面积比； ms_f样品溶液中标记的B链的质量（g); m-样品溶液的质量（g); ws-样品溶液中胰岛素的含量（g/g)。
9.根据权利要求7所述同位素稀释质谱法测定胰岛素含量的方法，其特征在于，所述 计算所述胰岛素样品溶液中胰岛素含量的计算方法如下： 按照公式（2)计算样品溶液中胰岛素的含量：
Rm-Std_标准溶液中胰岛素与标记的B链的质量比； Rh_std-标准溶液中非标记的胰岛素B链的还原烷基化肽段与标记的B链的烷基化肽段 的峰高比或峰面积比； Ry-样品溶液中非标记的胰岛素B链的还原烷基化肽段与标记的B链的烷基化肽段的 峰高比或峰面积比； ms_f样品溶液中标记的B链的质量（g); m-样品溶液的质量（g); ws-样品溶液中胰岛素的质量分数（g/g)。
【文档编号】G01N27/62GK104458890SQ201410787753
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月17日 优先权日:2014年12月17日
【发明者】李奥欣, 武利庆, 金有训, 李佳乐, 杨彬 申请人:中国计量科学研究院