一种毛细管电色谱法分离硫酸软骨素异构体的分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种毛细管电色谱法分离硫酸软骨素异构体的分析方法，包括样品的制备，毛细管电泳条件及分析方法，具体如下：分离缓冲溶液：由乙二胺、磷酸二氢钠、金纳米棒和水组成，其中，各组分的浓度为：150mmol/L乙二胺；20mM磷酸二氢钠；30％的内径20nm×长度75nm的金纳米棒；pH4.5；电泳条件参数具体为：毛细管长度总长67cm，有效长度50cm，毛细管内径为50μm；分离电压：-10kV，毛细管温度25℃；压力进样5秒；UV检测器，检测波长为200nm。本发明所所建立的分析方法，重现性好，硫酸软骨素和硫酸皮肤素异构体实现了基线分离，纳米金棒的加入改善了峰形，缩短了分析时间。
【专利说明】一种毛细管电色谱法分离硫酸软骨素异构体的分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于金纳米棒的毛细管电色谱法分离硫酸软骨素异构体一硫酸软骨素和硫酸皮肤素的分析方法。
【背景技术】
[0002]硫酸软骨素(CS)是一类由葡萄糖醛酸(GlcA)和氨基半乳糖(GalNAc)的重复二糖单元组成的酸性糖胺聚糖，具有分子量和电荷不均一、硫酸化的位置和数量不固定以及没有紫外吸收等特点。所以常规毛细管电泳对CS的分析存在检测灵敏度低，峰形差和异构体之间难分离等难点。
[0003]硫酸软骨素和硫酸皮肤素(DS)是一对羧基位置异构的异构体，目前对二者的分离多采用酶降解的方法，分析过程复杂且试剂昂贵。Danielson等人(T.N.Loegel, J.D.Trombley, R.T.Taylor, N.D.Danielson, Capillary electrophoresis of heparin andother glycosaminoglyeans using a polyamine running electrolyte, Anal.Chim.Acta753(2012)90-96.)发展了一种使用多胺作为缓冲溶液来分离CS和DS的毛细管电泳方法，但峰形和分离度都不是很满意。
【发明内容】
[0004]针对上述现有技术，本发明提供了一种毛细管电色谱法分离硫酸软骨素异构体的分析方法。
[0005]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0006]一种毛细管电色谱法分离(或检测)硫酸软骨素异构体的分析方法，包括样品的制备，毛细管电泳条件及分析方法，具体如下:
[0007]样品的制备:取硫酸软骨素和硫酸皮肤素对照品，用蒸馏水配制成浓度为lmg/ml的溶液；
[0008]分离缓冲溶液:由乙二胺、磷酸二氢钠、金纳米棒和水组成，其中，各组分的浓度为:150mmol/L(mM)乙二胺；20mM 憐酸二氢钠；30% (体积比，v/v) 20nm(内径)X75nm(长度)的金纳米棒；ρΗ4.5 ；
[0009]电泳条件参数具体为:毛细管长度总长67cm,有效长度50cm,毛细管内径为50 μ m(使用前，依次使用0.1M NaOH溶液和分离缓冲溶液对毛细管进行活化和平衡)；分离电压:_10kV，毛细管温度250C ;压力(0.5psi)进样5秒；UV检测器，检测波长为200nm。
[0010]本发明建立了一种基于金纳米棒的开管毛细管电色谱方法来分离硫酸软骨素和硫酸皮肤素。通过考察影响分离效率的各种实验因素，采用正交设计实验方案获得了最优的分离条件(如上述)。在最优条件下，CS和DS获得了基线分离，峰形得到改善。所建立的分析方法重现性好，CS和DS连续运行5次的迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别为
0.13%,0.14%和 0.86%, 1.07%o【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1:本发明的方法得到的电泳谱图(图中横坐标为分析时间、纵坐标为峰面积)。
[0012]图2:现有技术中的方法得到的电泳谱图。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0014]实施例1毛细管电色谱法分离硫酸软骨素异构体的分析方法
[0015]包括样品的制备，毛细管电泳条件及分析方法，具体如下:
[0016]样品的制备:用蒸懼水配制lmg/ml硫酸软骨素和lmg/ml硫酸皮肤素对照品溶液。
[0017]分离缓冲溶液:由乙二胺、磷酸二氢钠、金纳米棒和水组成，其中，各组分的浓度为:150mmol/L(mM)乙二胺；20mM 憐酸二氢钠；30% (体积比，v/v) 20nm(内径)X75nm(长度)的金纳米棒；ρΗ4.5 ；
[0018]电泳条件参数具体为:毛细管长度总长67?cm,有效长度50cm,毛细管内径为50 μ m(使用前，依次使用0.1M NaOH溶液和分离缓冲溶液对毛细管进行活化和平衡)；分离电压:_10kV，毛细管温度25°C;压力(0.5psi)进样5秒；UV检测器，检测波长为200nm。所得电泳谱图如图1所示。
[0019]同时，以现有技术中的方法进行分离分析，实验条件及参数为:毛细管:50μπι内径，375 μ m外径，67cm总长度(50cm有效长度)；UV检测器，200nm ;运行电压，-30Kv ;缓冲溶液，50mM 乙二胺(EDA)+18.7mMNaH2P04 (pH4.5), 34.5 °C.样品:5mg/mLDS+5mg/mLCS.Repeat the conditions of reference.(T.N.Loegel, J.D.Trombley, R.T.Taylor, N.D.Danielson, Capillary electrophoresis of heparin and other glycosaminoglycansusing a polyamine running electrolyte, Anal.Chim.Acta753 (2012) 90-96.)。所得电泳谱图如图2所示。
[0020]对比图1、图2，可以发现，用本发明建立的毛细管电泳方法对硫酸软骨素和硫酸皮肤素异构体实现了基线分离，纳米金棒的加入改善了峰形，缩短了分析时间。
【权利要求】
1.一种毛细管电色谱法分离硫酸软骨素异构体的分析方法，包括样品的制备，毛细管电泳条件及分析方法，其特征在于:具体如下: 样品的制备:取硫酸软骨素和硫酸皮肤素对照品，用蒸馏水配制成溶液； 分离缓冲溶液:由乙二胺、磷酸二氢钠、金纳米棒和水组成，其中，各组分的浓度为:150mmol/L乙二胺；20mM磷酸二氢钠；30%的内径20nmX长度75nm的金纳米棒；pH4.5 ； 电泳条件参数具体为:毛细管长度总长67cm，有效长度50cm，毛细管内径为50μπι ;分离电压:_10kV，毛细管温度25°C ;压力进样5秒；UV检测器，检测波长为200nm。
2.根据权利要求1所述的毛细管电色谱法分离硫酸软骨素异构体的分析方法，其特征在于:所述样品溶液中，硫酸软骨素和硫酸皮肤素的浓度各为lmg/ml。
3.根据权利要求1所述的毛细管电色谱法分离硫酸软骨素异构体的分析方法，其特征在于:所述毛细管在使用前，依次使用0.1M NaOH溶液和分离缓冲溶液对毛细管进行活化和平衡。
【文档编号】G01N27/26GK103995029SQ201410196153
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月9日 优先权日:2014年5月9日
【发明者】刘秀美, 周广连, 赵婷, 魏茂杰 申请人:山东大学