一种用于被动皮肤过敏反应试验的综合评判方法
【专利摘要】本发明公开了一种判断被动皮肤过敏反应试验的综合评价方法，具体方法包括：被动皮肤过敏反应注射抗原后(1)肉眼观察注射抗原后的大鼠一般症状表现；(2)计算大鼠在注射抗原后的足趾肿胀度；(3)取血观察大鼠血液及生化指标；(4)处死大鼠，观察大鼠背部皮肤是否出现蓝斑，并检测大鼠皮肤、足趾、双耳以及血液的OD值。
【专利说明】一种用于被动皮肤过敏反应试验的综合评判方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种评价过敏反应发生与否的方法，具体的说是一种通过多个指标的 变化来全面综合考察过敏反应发生与否的方法。
【背景技术】
[0002] 中药注射剂是我国独创的现代新剂型，具有生物利用度高、起效快、作用强且广 泛、疗效突出、使用方便等优点，广泛应用于多种疾病的治疗。随着中药注射剂的广泛使用 有关其不良反应的报告亦相继增多，虽然中药注射剂上报的不良反应涉及多个系统，但最 常见的是过敏反应。有数据表明，中药注射剂在临床使用中出现药物不良反应的频率明显 高于其他中药剂型，其中过敏性休克就占22. 8%。过敏反应轻则仅表现为皮疹，重则引起 过敏性休克而致死亡。临床上中药注射剂引起的I型（速发型）过敏反应，多发病急，危害 大，可迅速出现皮肤潮红、瘙痒、腹痛甚至过敏性休克等严重症状，更甚者会因抢救不及时 而出现死亡。鉴于其高发生率和高危险性，I型过敏反应成为中药注射剂所致过敏反应中 最常见、危害最大、最受关注的一种不良反应。而过敏反应可能造成的休克及死亡已引发了 人们对中药注射剂安全性问题的疑虑和临床用药的信任危机。因此，中药注射剂必须安全、 有效、质量可控，但由于中药的多组份、多靶点，给药物安全性评价带来许多困难。
[0003] 被动皮肤过敏反应试验是经典的I型变态反应性疾病的常用动物模型，其原理为 受试物致敏动物血清给予正常动物皮内，IgE的F端与皮肤的肥大细胞表面的特异受体结 合，形成IgE的复合物，使肥大细胞致敏。当抗原攻击时，抗原与肥大细胞表面的IgE的Fab 端结合，导致IgE分子结构的改变，引起肥大细胞脱颗粒，释放过敏介质组胺、慢性物质等， 使血管的通透性增加，使静脉注射抗原的同时注入伊文思蓝燃料在该皮肤渗出着色。传统 的被动皮肤过敏反应主要观察指标为根据局部皮肤蓝染范围或程度，可判定血管通透性变 化的大小，继而判定过敏反应的程度。但该指标精确度较差，对呈现散在性蓝斑时很难精 确，且假阴性率较高。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对目前常用的用于判断被动皮肤过敏过敏反应 发生的评判方法精确度不足，假阴性率较高的缺点，提供一种能够比较准确的判定临床前 药理实验中药物是否能够引起动物发生被动皮肤过敏反应的评判方法。运用此方法，通过 临床前药理实验能够比较准确的判断药物是否能够引起动物发生过敏反应。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0006] -种用于被动皮肤过敏反应试验的综合评判方法，包括如下步骤：
[0007] 1、被动皮肤过敏反应试验抗血清的制备：雄性BN大鼠随机分为生理盐水组、受试 药物组。各组分别于第1、3、5日致敏，共三次，每组动物每次皮下给予相对应药物的临床 常用剂量。每组均于末次致敏后第12天进行激发，并分别在激发前取血，3000r/min离心 15min后取上清液，-20°C冷冻保存，备用。
[0008] 2、被动皮肤过敏试验：SD大鼠随机分为生理盐水组、受试药物组，每组8只。大 鼠背部中线两侧距背脊约1.5cm处剃毛，面积约4X4cm，用豚鼠主动全身过敏试验制备 的各组抗血清原液及用生理盐水1:1倍稀释液，分别皮内给于各组大鼠去毛各点，每个点 0. lmL。每只动物皮内注射抗血清24h后，足趾仪量取各组大鼠的右后肢足趾容积，各组动 物尾静脉注射相对应抗原（含0. 5%的伊文斯蓝），每只1. OmL。30min后，
[0009] (a)肉眼观察给予对应抗原后大鼠的一般症状；
[0010] (b)足趾仪再次量取各动物的右后肢足趾容积，计算动物的右后肢足趾的肿胀度 [=(注射后足趾容积-注射前足趾容积）/注射前足趾容积X 100% ];
[0011] (C)动物眼眶取血（注射不含0.5%的伊文思蓝的抗原），抗凝血液检测血液常 规指标（白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积、平均红细胞压积、平均红细胞体 积、平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度、血小板计数），3000r/min离心15min后取上清 液，用于检测血液生化指标，用日本Hitachi7020全自动生化分析仪测定心肌酶四项：谷 草转氨酶（AST)、乳酸脱氢酶（LDH)、α-羟丁酸脱氢酶（HBDH)、肌酸激酶（CK);肾功能四 项：血糖（GLU)、尿素（UREA)、肌酐（Cr)、尿酸（UA);肝功能七项：谷丙转氨酶（ALT)、谷草 转氨酶（AST)、总蛋白（TP)、白蛋白（ALB)、球蛋白（GLOB)、碱性磷酸酶（ALP)、乳酸脱氢酶 (LDH)；
[0012] (d)处死动物，翻转动物背部皮肤，并观察皮肤内侧有无蓝斑（>5mm)并量取蓝斑 直径；
[0013] (e)剪取动物的右侧后足，背部皮肤，双耳，剪碎后分别加入丙酮：生理盐水（体积 比7:3)溶液5-6ml，侵泡24h后离心，取上清液，630nm处检测0D值。
[0014] 有益效果：本方法与现有技术相比具有如下优势：
[0015] 1、评价指标比较全面，能够较准确的评价被动过敏反应的发生与否，避免单个指 标导致的假阴性的发生。
[0016] 2、通过多指标的综合，可以判断过敏发应发生的严重程度。
【具体实施方式】
[0017] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0018] 实施例1 :
[0019] 一种用于被动过敏反应实验的评判方法，步骤如下：
[0020] 1、被动皮肤过敏反应试验抗血清的制备：雄性BN大鼠随机分为生理盐水组、受试 药物组。各组分别于第1、3、5日致敏，共三次，每组动物每次皮下给予相对应药物的临床 常用剂量。每组均于末次致敏后第12天进行激发，并分别在激发前取血，3000r/min离心 15min后取上清液，-20°C冷冻保存，备用。
[0021] 2、被动皮肤过敏试验：SD大鼠随机分为生理盐水组、受试药物组，每组8只。大 鼠背部中线两侧距背脊约1.5cm处剃毛，面积约4X4cm，用豚鼠主动全身过敏试验制备 的各组抗血清原液及用生理盐水1:1倍稀释液，分别皮内给于各组大鼠去毛各点，每个点 0. lmL。每只动物皮内注射抗血清24h后，足趾仪量取各组大鼠的右后肢足趾容积,各组动 物尾静脉注射相对应抗原（含0. 5%的伊文斯蓝），每只1. OmL。30min后，
[0022] (a)肉眼观察给予对应抗原后大鼠的一般症状；
[0023] (b)足趾仪再次量取各动物的右后肢足趾容积，计算动物的右后肢足趾的肿胀度 [=(注射后足趾容积-注射前足趾容积）/注射前足趾容积X 100% ];
[0024] (c)动物眼眶取血（注射不含0.5%的伊文思蓝的抗原），抗凝血液检测血液常 规指标（白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积、平均红细胞压积、平均红细胞体 积、平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度、血小板计数），3000r/min离心15min后取上清 液，用于检测血液生化指标，用日本Hitachi7020全自动生化分析仪测定心肌酶四项：谷 草转氨酶（AST)、乳酸脱氢酶（LDH)、α-羟丁酸脱氢酶（HBDH)、肌酸激酶（CK);肾功能四 项：血糖（GLU)、尿素（UREA)、肌酐（Cr)、尿酸（UA);肝功能七项：谷丙转氨酶（ALT)、谷草 转氨酶（AST)、总蛋白（TP)、白蛋白（ALB)、球蛋白（GLOB)、碱性磷酸酶（ALP)、乳酸脱氢酶 (LDH)；
[0025] (d)处死动物，翻转动物背部皮肤，并观察皮肤内侧有无蓝斑（>5mm)并量取蓝斑 直径；
[0026] (e)剪取动物的右侧后足，背部皮肤，双耳，剪碎后分别加入丙酮：生理盐水（体积 比7:3)溶液5-6ml，侵泡24h后离心，取上清液，630nm处检测0D值。
[0027] 3、试验结果
[0028] (1)动物出现的一般症状：各组给予相应抗原后，动物表现：
[0029] 对照组：各动物正常
[0030] 卵蛋白组：各动物出现静卧、打喷嚏、挠鼻、四肢水肿等现象。
[0031] (2)对足趾肿胀度的影响：与对照组比较，卵蛋白组实验前足趾容积无显著差异 (P>0. 05)，给予对应抗原后，卵蛋白组的足趾容积明显肿胀，值高于对照组（P〈0. 05)。
[0032] 结果见表1。
[0033] 表1对大鼠足趾肿胀度的影响（η = 8， 土S)
[0034]
【权利要求】
1. 一种用于被动皮肤过敏反应试验的综合评判方法，其特征在于，该方法包括如下步 骤： (1) 被动皮肤过敏反应试验抗血清的制备：雄性BN大鼠随机分为生理盐水组、受试药 物组；各组分别于第1、3、5日致敏，共三次，每组动物每次皮下给予相对应药物的临床常用 剂量；每组均于末次致敏后第12天进行激发，并分别在激发前取血，3000r/min离心15min 后取上清液，_20°C冷冻保存，备用； (2) 被动皮肤过敏试验：SD大鼠随机分为生理盐水组、受试药物组，每组8只；大鼠背 部中线两侧距背脊约1. 5cm处剃毛，面积约4X4cm，用豚鼠主动全身过敏试验制备的各组 抗血清原液及用生理盐水1:1倍稀释液，分别皮内给于各组大鼠去毛各点，每个点〇. lmL ; 每只动物皮内注射抗血清24h后，足趾仪量取各组大鼠的右后肢足趾容积，各组动物尾静 脉注射相对应抗原，含0. 5%的伊文斯蓝，每只1. OmL ;30min后， (a) 肉眼观察给予对应抗原后大鼠的一般症状； (b) 足趾仪再次量取各动物的右后肢足趾容积，按如下公式计算动物的右后肢足趾的 肿胀度： 动物的右后肢足趾的肿胀度=(注射后足趾容积-注射前足趾容积）/注射前足趾容 积 X100% ; (C)动物眼眶取血，注射不含0. 5 %的伊文思蓝的抗原，抗凝血液检测血液常规指标， 包括白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积、平均红细胞压积、平均红细胞体积、 平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度和血小板计数，3000r/min离心15min后取上清液， 用于检测血液生化指标，用日本Hitachi7020全自动生化分析仪测定心肌酶四项：谷草转 氨酶、乳酸脱氢酶、α -羟丁酸脱氢酶、肌酸激酶；肾功能四项：血糖、尿素、肌酐、尿酸；肝功 能七项：谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总蛋白、白蛋白、球蛋白、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶； (d) 处死动物，翻转动物背部皮肤，并观察皮肤内侧有无>5mm蓝斑并量取蓝斑直径； (e) 剪取动物的右侧后足，背部皮肤，双耳，剪碎后分别加入丙酮和生理盐水按体积比 7:3的混合液5?6ml，侵泡24h后离心，取上清液，630nm处检测0D值。
【文档编号】G01N33/48GK104062412SQ201410306749
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】蒋宝平, 余黎, 许立, 田磊 申请人:南京中医药大学