一种药物刺激性的质谱检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种药物刺激性评价的质谱检测方法，该方法将药物原液或将药物原液配制成一定浓度的溶液，与细胞共同培养，取细胞上清液，或者将药物注入实验动物体内，取组织液经过提取处理后，然后利用质谱仪，检测药物作用前后炎症物质含量的变化，以此来评价药物的刺激性，并揭示药物刺激性机制。本发明经过对L02、RAW264.7等不同细胞及大鼠足组织的检测，表明该方法可有效地评价药物刺激性的强弱，具有操作简单、指标灵敏、覆盖面广的技术优势，可广泛适用于各种药物刺激性的评价和检验，为保证药物的临床用药安全提供科学依据。
【专利说明】一种药物刺激性的质谱检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药物的刺激性评价的检测方法，具体涉及一种用质谱方法评价药 物刺激性的质谱检测方法。
【背景技术】
[0002] 中药、天然药物制剂成分复杂。包括活性成分或组分、配伍后产生的新成分、体内 代谢物等。这些复杂的物质进入体内容易导致刺激性反应。很多药物，特别是静脉给药的 药物，在输液过程中常见血管刺激性反应。此外，舌下含服或者皮肤外用药物也容易因此刺 激性。美国纽约药物实践研究表明，几乎4%的住院病人患一种药物治疗的副作用。全美每 年的住院病人中，约有1〇〇万人发生药物治疗性损害，其中约有18万人死于药物损伤。
[0003] 在刺激性反应过程中的很多现象如血管反应和通透性改变，实质上主要是由一系 列被称作炎症介质的内源性化学因子介导实现的，它们影响到整个炎症过程.其中花生四 烯酸的代谢产物在炎症发生时起主要作用被称为促炎反应介质；而脂氧素（Lipoxin，LX)、 Resolvin El等在炎症消退时发挥主要作用被称为抗炎反应介质。这些炎症介质以自分泌、 旁分泌、内分泌等作用于局部和全身，以正负反馈方式相互调控，炎症反应的转归将取决于 这两大类介质的平衡，任何一方的过度优势均可造成炎症失控，内环境稳定的破坏。
[0004] 因此，为了指导临床合理用药，应进行中药、天然药物制剂应用的刺激性检验。而 对于药物刺激性，有效的检验和检测方法至关重要。关于刺激性评价的局部刺激动物模型 研究较少，常规的方法是兔眼刺激试验、动物同体左右侧自身对比法。用药部位根据药物的 给药途径确定，可选用耳缘静脉，耳中心动脉（其它动物可选用前、后肢静脉及股动脉等）， 股和背部肌肉，侧胸壁皮下组织，静脉旁组织等，采用肉眼观察药物刺激性。但是这个方法 不灵敏，当没有红、肿的现象时，就无法观测，而且肉眼观测的指标比较单一，方法主观性较 大。为此，我们建立一种更灵敏、更客观的方法用来评价药物刺激性。本发明利用药物刺激 细胞或组织，用质谱手段检测近百种炎症因子指标，检测限达到pg-ng/ml级别，通过各炎 症因子揭示药物刺激性机制。
【发明内容】
[0005] 发明目的：发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术只能对少数炎 症因子进行检测，不能全面检测引起药物刺激性的大量炎症介质的不足，从而提供一种具 有方便性、全面性、灵敏性的质谱检测方法。
[0006] 技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
[0007] -种药物刺激性的质谱检测方法，将药物原液或将药物原液配制成一定浓度的溶 液，与细胞共同培养，取细胞上清液，或者将药物注入实验动物体内，取组织液经过提取处 理后，然后利用质谱仪，检测药物作用前后炎症物质含量的变化。
[0008] 作为优选方案，以上所述的药物刺激性的质谱检测方法，其特征在于，将药物原液 稀释0. 1-100倍，更加优化倍数为10倍。
[0009] 作为优选方案，以上所述的药物刺激性的质谱检测方法，所述药物原液的浓度为 0· 01_20mmol/l，更加优化浓度为 2. 5mmol/l、5mmol/l、10mmol/l。
[0010] 作为优选方案，以上所述的药物刺激性的质谱检测方法，所述的细胞为巨噬细胞， 实验动物为大鼠。
[0011] 作为优选方案，以上所述的药物刺激性的质谱检测方法，所述的炎症物质为脂类 代谢物，所述的脂类代谢物为PGF2 a、5s-HpETE、LTB4促炎性物质及PGE1抗炎性物质。
[0012] 作为优选方案，以上所述的药物刺激性的质谱检测方法，所述的细胞上清液或组 织液的处理方法为液-液萃取法、固相萃取、超声提取。优选乙酸乙酯/正己烷（1:1)液-液 萃取法。
[0013] 作为优选方案，以上所述的药物刺激性的质谱检测方法，所述的质谱仪检测的条 件优选为流动相A相位：水-乙腈-甲酸体积比为70: 30:0. 02,流动相B相位：乙腈-异丙 醇体积比为50:50 ;
[0014] 梯度洗脱程序：
[0015] 0 ?3min :25% B ;3 ?llmin :45% B ;
[0016] 11 ?13min :60% B ; ;13 ?18min :75% B ;
[0017] 18 ?18. 5min :90% B ;20 ?25min :0% B ;
[0018] 25 ?30min :0% B。
[0019] 本发明所述的药物刺激性的质谱检测方法，所述的药物为中药生药、中成药或中 药注射液。
[0020] 本发明所述检测方法，是一种广泛适用于药物刺激性评价的质谱检测方法。
[0021] 有益效果：本发明提供的药物刺激性的质谱检测方法具有以下优点：
[0022] 中药制剂等在生产和存放过程中可能产生微量的刺激性物质，研究需要高浓度的 刺激性物质。离心浓缩是一种挥去提取液，直接浓缩炎症物质的技术。该方法具有损耗小、 效率高、操作便捷的优点，可增加刺激性检测方法的灵敏性。
[0023] 药物刺激性的质谱检测方法是一个关键性的问题。本发明创新性采用了药物刺激 细胞模型，用一种质谱方法检测上百种炎症因子指标，通过各炎症因子分属的8种不同通 路（如COX、LOX、CYP、亚油酸等）来评价药物的刺激性，可建立一种直观、简单和广泛适用 的质谱检测方法，为评价药物的刺激性提供科学方法，可保证药物的临床用药安全提供科 学依据。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价 形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0025] 实施例1芫花酯甲的刺激性检测（细胞模型）
[0026] 一、方法
[0027] 1、芫花酯甲的配制
[0028] 称取芫花酯甲粉末1. 05mg置于玻璃试管中，加162. 04 μ LDMS0溶解，配制成终浓 度为10 μ mol/L的母液，用单培分别配制成浓度为10 μ mol/L、5 μ mol/L、2. 5 μ mol/L的溶 液,过滤。
[0029] 2、样品制备
[0030] RAW264. 7细胞接种于培养皿中，每个皿加入lmL含有3X106个细胞的培养液， 37°C、5% C02条件下培养。每组设3复孔，24h后吸出培养液，PBS轻洗3遍，每皿加入lmL 不同浓度的芫花酯甲，浓度分别为〇 (对照组）、2. 5、5、10 μ mol/L (η = 3)。孵育48h后收集 上清，1000r/5min，取上清，分别加入10 μ L10 % BHT，20 μ L1M柠檬酸，涡旋lmin，加入4倍 量萃取液（正己烷：乙酸乙酯=1:1)，涡旋，2500r/10min离心，收集有机相，重复萃取一次， 合并有机相。37°C离心浓缩后，用300 μ L乙腈复溶，涡旋，低温高速离心，取上清97. 5 μ L， 加入2. 5 μ L2 μ g/mL氯霉素（终浓度50ng/mL)作为内标进样。
[0031] 3、色谱条件和质谱条件
[0032] 超高效液相色谱柱（Synergi2. 5u Fusion反相C18柱（2. 0X50mm ;美国 Phenomenex))，柱温50 °C，流速0· 3ml/min，进样量5 μ 1，流动相A (水：乙腈：甲酸= 70:30:0.02)，流动相8(乙腈：异丙醇=50 :50)，梯度洗脱程序：0?311^11，25%8;3? llmin, 45% B ;11 ?13min, 60% B ;13 ?18min, 75% B ;18 ?18. 5min, 90% B ;20 ?21min， 0% B ;21 ?25min, 0% B。质谱参数 CUR= 10psi，GSI = 30psi，GS2 = 30psi，IS = -4500V， CAD = HIGH，TEMP = 525, ihe = ON，XP = -10V，阴离子模式。
[0033] 4、标准曲线的标定
[0034] 精密吸取一定量的氯霉素标准品母液2μ g/ml，用甲醇依次稀释成256、64、16、4、 lng/ml (η = 5)不同浓度的溶液，润旋混勻，13000r/min，10min离心，按2. 2液质条件供 AB-5500分析。以峰面积积分值作为纵坐标，标准品的不同浓度作为横坐标，绘制标准曲线。
[0035] 5、数据分析与处理
[0036] 数据分析采用Analyst软件分析处理，结果用X ±S表示。
[0037] 6、数据处理方法内标法：
[0038] 样品浓度=标准品峰面积X标准品浓度/样品峰面积实验数据以均数土标准差 (X 土S)表示，组间相关指标采用Excel进行t检验，*P < 0. 05, < 0. 01有统计学意 义。
[0039] 二、结果
[0040] 1.配制不同浓度芫花酯甲溶液，采用上述建立的检测方法检测。采用Excel进行 correl计算，相关系数>0. 6或〈-0. 6则有统计学意义。结果如下表所示：
[0041] 表1 :细胞上清中各炎症因子含量及其与相应浓度的正相关系数
[0042]
【权利要求】
1. 一种药物刺激性的质谱检测方法，其特征在于，将药物原液或将药物原液配制成一 定浓度的溶液，与细胞共同培养，取细胞上清液，或者将药物注入实验动物体内，取组织液 经过提取处理后，然后利用质谱仪，检测药物作用前后炎症物质含量的变化。
2. 根据权利要求1所述的药物刺激性的质谱检测方法，其特征在于，将药物原液稀释 0· 1-100 倍。
3. 根据权利要求2所述的药物刺激性的质谱检测方法，其特征在于，将药物原液稀释 10倍。
4. 根据权利要求1所述的药物刺激性的质谱检测方法，其特征在于，所述药物原液的 浓度为 〇· 01_20mm〇l/l。
5. 根据权利要求4所述的药物刺激性的质谱检测方法，其特征在于，所述药物原液的 浓度为 2. 5mmol/l、5mmol/l 或 10mmo 1 /1 〇
6. 根据权利要求1所述的药物刺激性的质谱检测方法，其特征在于，所述的细胞为巨 噬细胞，实验动物为大鼠。
7. 根据权利要求1所述的药物刺激性的质谱检测方法，其特征在于，所述的炎症物质 为脂类代谢物。
8. 根据权利要求1所述的药物刺激性的质谱检测方法，其特征在于，所述的细胞上清 液或组织液的处理方法为液-液萃取法、固相萃取、超声提取。
9. 根据权利要求1所述的药物刺激性的质谱检测方法，其特征在于，所述的质谱仪检 测的条件为：流动相A相位：水-乙腈-甲酸体积比为70:30:0. 02,流动相B相位：乙腈-异 丙醇体积比为50:50 ; 梯度洗脱程序： 0 ?3min :25% B ;3 ?llmin :45% B ; 11 ?13min:60%B; ;13 ?18min:75%B; 18 ?18. 5min :90% B ;20 ?25min :0% B ; 25 ?30min :0% B。
10. 根据权利要求1所述的药物刺激性的质谱检测方法，其特征在于，所述的质谱检测 方法为单反应监测或多反应监测；所述的质谱检测仪器为三重四级杆质谱仪。
11. 根据权利要求1所述的药物刺激性的质谱检测方法，其特征在于，所述的药物为中 药生药、中成药或中药注射液。
【文档编号】G01N30/02GK104122347SQ201410389285
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2014年8月8日
【发明者】马宏跃, 段金廒, 周婧, 闫文丽, 龚艳, 王子月 申请人:南京中医药大学