对在人类血清中指示人类肺组织的病理学状态的蛋白质的鉴定的制作方法

对在人类血清中指示人类肺组织的病理学状态的蛋白质的鉴定的制作方法
【专利摘要】鉴定在人类血清中存在的蛋白质的方法，所述蛋白质在正常个体和按照医生诊断已知患有非小细胞肺癌和哮喘的患者之间差异地表达。将来自各个群体的人类血清试样用胰蛋白酶或任何其它合适的内切蛋白酶消化，并且使用液相色谱电喷雾离子化质谱仪进行分析。比较来自各个群体的质谱数据以确定具有在正常、哮喘和肺癌群体之间显著差异地表达的表达强度的蛋白质。发现11种蛋白质具有在所述群体之间显著差异地表达的表达强度。最后，通过将所述质谱数据与具有已知蛋白质的质谱数据文库的已知数据库比较，获得11种蛋白质的特征。
【专利说明】对在人类血清中指示人类肺组织的病理学状态的蛋白质的 鉴定
[0001] 本申请是申请日为2008年9月11日、申请号为200880113342. 7、发明名称为"对 在人类血清中指示人类肺组织的病理学状态的蛋白质的鉴定"的发明专利申请的分案申 请。
[0002] 发明人：Robert T. STREEPER, Elzbieta IZBICKA 和 Sung Η· BAEK

【背景技术】
[0003] 这是要求2007年9月11日提交的美国临时申请60/971,422的权益最初的非临 时申请，在此将上述美国临时申请引入以作参考。
[0004] 1.【技术领域】
[0005] 本发明主要涉及对人类肺组织的病理学状态（pathology)的诊断。更具体地，本 发明涉及使用液相色谱-质谱以鉴定在人类血清中存在的蛋白质来诊断非小细胞肺癌和 哮喘，当与正常群体中发现的相同蛋白相比在人类血清中在表达的相对强度方面改变时， 所述蛋白质指示与人类肺组织和人类呼吸系统相关的病理学状态。通过鉴定与此类病理学 状态相关的蛋白质，确定代表性的表达强度，并且将这些表达强度与在患者的血清中呈现 的表达强度比较，可以通过简单的血液测试在其发展早期检测病理学状态的存在并且区分 所述病理学状态。
[0006] 2.相关技术的描述
[0007] 呼吸系统的病理学状态，例如哮喘和肺癌，影响数以百万计的美国人。实际上，美 国肺科协会（American Lung Association)报道几乎2千万的美国人遭受哮喘痛苦。美国 癌症协会（American Cancer Society)估计仅在2007年就有229, 400例呼吸系统的新的 癌症病例，164, 840例死于呼吸系统的癌症。因此，当检测出癌症尽管仍然为局部时，癌症病 例的五年存活率为46%，肺癌患者的五年存活率仅为13%。相应地，在肺癌已经扩散前仅 16%的该疾病被发现。基于癌细胞的病理学状态通常将肺癌分类为两种主要类型。各类型 以被转化从而变得癌化的细胞的类型而命名。小细胞肺癌源自在人类肺组织中的小细胞， 而非小细胞肺癌通常包括不是小细胞类型的所有肺癌。因为对于所有的非小细胞类型治疗 通常相同，所以将非小细胞肺癌归类在一起。非小细胞肺癌或NSCLC-起占所有肺癌的约 75%。
[0008] 降低肺癌患者的存活率的主要因素为肺癌难以早期诊断的事实。在人类中诊断肺 癌或鉴定其存在的当前方法局限于采用X-射线、CT扫描和肺的类似扫描以物理上地确定 肿瘤的存在或不存在。因此，肺癌的诊断常常仅应答于已经呈现一段显著时间的症状，并 且在所述疾病已经在人类中呈现足够长的时间以产生物理上可检测的团块（mass)之后进 行。
[0009] 类似地，检测哮喘的当前方法典型地在症状例如反复哮喘、咳嗽和胸闷呈现后长 时间进行。检测哮喘的当前方法典型地局限于肺功能测试例如肺活量测试或激发测试 (challenge test)。此外，这些测试被医生命令与许多其它测试一起进行以排除其它病理 学状态或疾病例如慢性阻塞性肺病（COPD)、支气管炎、肺炎和充血性心力衰竭。
[0010] 在现有技术中没有在其发展早期诊断人类肺组织的病理学状态的简单可靠的方 法。此外，现在不存在能够指示特定肺组织病理学状态的存在的可利用的血液测试。因此 期望开发在疾病发展早期确定肺癌的存在的方法。同样地期望开发在症状的出现的最早期 诊断哮喘和非小细胞肺癌和使其相互区分开和与其它肺疾病例如感染区分开的方法。进一 步期望鉴定在人类血液中存在的特定蛋白质，其当在表达的相对强度方面改变时，指示非 小细胞肺癌和/或哮喘的存在。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明提供使用液相色谱电喷雾离子化质谱（"LC-ESMS"），鉴定在人类血清 中存在的蛋白质的新方法，所述蛋白质在正常个体和按照医生诊断而已知患有非小细胞 肺癌和哮喘的患者之间差异地表达。指示非小细胞肺癌和/或哮喘的蛋白质的选择通 过将质谱数据，即肽的质量和在一维上随时间表达的蛋白质强度的图解表示（graphical indications)比较来进行。比较了数以千计的蛋白质，导致11种蛋白质的选择，所述蛋白 质在不患有任何肺组织病理学状态的个体的群体、按照医生诊断患有哮喘的个体的群体和 按照医生诊断患有非小细胞肺癌的个体的群体之间以基本上不同的强度表达。
[0013] 具体地，人类血清从"正常群体"、"哮喘群体"和"肺癌群体"获得。本文所用的"正 常群体"旨在定义已知未患有哮喘或肺癌的那些个体。本文所用的"哮喘群体"旨在定义已 知患有哮喘并且被医生诊断患有哮喘的那些个体。本文所用的"肺癌群体"旨在定义已知 患有非小细胞肺癌并且被医生诊断患有非小细胞肺癌的那些个体。
[0014] 获得正常群体、哮喘群体和肺癌群体的血清之后，将各血清试样分成等分试样并 且暴露于消化剂（digesting agent)或蛋白酶，即，胰蛋白酶，以将在血清试样中存在的蛋 白质消化成定义的和可预测的裂解物（cleavages)或肽。通过胰蛋白酶的酶促作用形成 的肽，通常称为胰蛋白酶肽，然后通过将所述试样进行离心以使不溶物质沉淀而从不溶物 质分离。包含胰蛋白酶肽的上清液然后进行毛细液相色谱以实现胰蛋白酶肽的时空分离 (tempero-spatial separation)〇
[0015] 所述胰蛋白酶肽然后进行LC-ESMS。各肽通过使所述肽通过疏水性流体的柱来及 时地分离，即，使水、包含〇. 1%体积甲酸的乙腈通过包含Supelcosil ΑΒΖ+5μηι填充材料 固定相的色谱柱，床长18cm，内径0.375mm。分离的肽通过柱洗脱液加载。所述柱具有这样 的终点，从该终点分离的肽然后通过施加高电压至相对于地面具有正偏压的柱尖，形成带 电荷的小滴而电喷雾化，所述带电荷的小滴通过施加的电场的力向LC-ESIMS的入口加速。 形成的所得喷雾由包含溶解的胰蛋白酶肽的溶剂的小滴组成。所述小滴通过经过电喷雾源 的大气压区域然后进入加热的LC-ESIMS的毛细管入口来去溶剂化。
[0016] 所述小滴的去溶剂化导致带正电的离子（最典型地为氢）（H+)沉积在所述 肽上，给予所述肽以电荷。在气相中此类带电荷的肽在本领域描述为"假分子离子 (pseudo-molecular ions) "。所述假分子离子通过各种电势被拉入LC-ESIMS的质谱仪，其 中它们在空间和时间上基于质荷比分离。一旦通过质荷比分离，所述假分子离子然后通过 另外的电场梯度导向LC-ESIMS的检测器，其中所述假分子离子束转化成通过数据记录设 备记录的电脉冲。
[0017] 这样，使在胰蛋白酶消化物中存在的肽传递到在LC-ESIMS中的质谱仪，其中对各 肽测定分子量，在来自样品的肽从所述柱离开（pass out)的整个时间范围产生重复获得的 时间增量质谱。质谱读数通常为通过LC-ESIMS发现的肽的图解说明，其中X轴为测定的质 荷比，y轴为所述肽的信号强度。这些质谱然后可以及时地组合成三维显示，其中X轴为色 谱分离的时间，z轴为质谱的质量轴，和y轴为质谱信号的强度，其与通过LC-ESIMS检测的 给定假分子离子的量成比例。
[0018] 接下来，进行比较分析，对于从哮喘群体和肺癌群体测试的各个试样和从正常群 体测试的各个试样比较质谱读数。在哮喘、肺癌和正常病理学状态方面将与在LC-ESMS中 检测出的推定鉴定的蛋白相关的各胰蛋白酶肽假分子离子信号（"峰"）比较。将具有如下 质谱峰强度的肽确定为无意义的并且排除：其指示当将哮喘群体或肺癌群体与正常群体比 较时肽的量未基本上改变。通常，所用的排除标准包括：将给定蛋白质的至少一半鉴定的特 征肽的肽峰强度在源自来自各病理学状态的个体患者血清的分析的至少10个数据组方面 做比较。如果源自给定蛋白质的大多数肽峰的强度在强度上是80%的血清数据组至少10 倍，将所述蛋白质分类为在两种病理学状态类别之间差异地调节。
[0019] 作为比较分析的结果，11种蛋白质确定为在哮喘群体，肺癌群体和正常群体之间 一致地差异地表达。该11种蛋白质通过参考蛋白质和肽的已知数据库或文库来鉴定。此 类数据库的实例包括由 National Center for Biotechnology Information〃NCBInr〃）维 护的 Entrez Protein、由 Swiss Bioinformatics Institute (〃SwissProt〃）维护的 ExPASy 和 Medical Research Council Clinical Science Center of the Imperial College of London 的 Mass Spectral Database("MSDB")。
[0020] 将来自每一正常、肺癌和哮喘群体的各个试样的质谱读数输入已知的称为Mascot 的搜索引擎。Mascot为本领域已知的搜索引擎，其使用质谱数据以从四个主要测序数据库， 即MSDB、NCBInr、SwissProt和dbEST数据库鉴定蛋白质。将搜索标准和参数输入Mascot 程序,并且使各个试样通过Mascot程序运行。Mascot程序然后针对测序数据库运行输入的 肽，将各肽的峰强度和质量与已知肽和蛋白质的质量和峰强度比较。然后Mascot产生可能 匹配的候选物列表，对于运行的各肽通常称为"显著匹配"。
[0021] 显著匹配通过Mascot程序通过对于所测试的各个试样指派称为"Mowse得分"的 得分来确定。Mowse得分为如下算法，其中所述得分为-10*L0G 1CI(P)，其中P为所观察的匹 配为随机事件的概率，其与当P小于0. 05的显著性p值相关，其在科学界为通常承认的显 著性标准。约55至约66或以上的Mowse得分通常认为是显著的。由于特定搜索考虑和数 据库参数而导致显著性水平稍微变化。对于各肽运行返回所述显著匹配，产生蛋白质的候 选物列表。
[0022] 然后使所述肽与来自所述显著匹配的蛋白质匹配以确定在Mascot程序中运行 通过的肽的特征（identity)。对于通过Mascot程序鉴定的各肽和来自所述显著匹配的 各蛋白质进行手工分析。排除被确定为"噪音"（无论是化学的或是电子的）的结果的 峰强度匹配。使来自质谱读数的数据与所述显著匹配交互检查以验证原始数据、峰特征 (peak identities)、电荷多重性（charge multiplicities)、同位素分布和侧翼电荷状态 (flanking charge state)〇
[0023] 然后进行逆谱库检索（reverse search)以将可能已经通过Mascot程序的自动 检索被漏失的肽添加至候选物列表。添加的肽通过以下来鉴定：选择表示与所比较的肽的 各参数基本上匹配的单一蛋白质的"最佳匹配"，进行计算机（in silico)消化，其中所述 胰蛋白酶肽和其各自的分子质量基于蛋白质的已知氨基酸或基因序列来计算。这些预测 的肽质量然后针对原始质谱数据搜索，并且使鉴定的任何峰如上所述进行检查和具有资格 (qualified)。然后，使包括通过Mascot自动鉴定的和通过手工检查鉴定的所有的肽进入由 Mascot使用的质量列表。如本文下面所述，然后将细化的（refined)匹配用于推导出细化的 Mowse得分。
[0024] 作为鉴定过程的结果，确定为在哮喘群体、肺癌群体和/或正常群体之间显 著差异地表达的11种蛋白质鉴定为BAC04615、Q6NSC8、CAF17350、Q6ZUD4、Q8N7P1、 CAC69571、包含FERM结构域的蛋白质4、JC1445蛋白酶体肽链内切酶复合物链C2长剪接 (JC1445proteasome endopetidase complex chain C21ong splice)、突角生融合蛋白 11、 AAK13083 和 AAK130490。BAC04615、Q6NSC8、CAF 17350、Q6ZUD4、Q8N7P1 为由基因测序成果 产生的鉴定的蛋白质。已知包含FERM结构域的蛋白质4参予胞质内蛋白质膜锚定。JC1445 蛋白酶体肽链内切酶复合物链C2长剪接为已知的蛋白酶体。突触融合蛋白11在细胞免疫 应答中活跃。BAC04615，AAK13083和AAK130490为主要的组织相容性复合物（"MHC"）相 关蛋白质。

【专利附图】

【附图说明】
[0025] 图1描述显示蛋白质BAC04615的Mowse得分和显著匹配的表；
[0026] 图2描述显示蛋白质Q6NSC8的Mowse得分和显著匹配的表；
[0027] 图3描述显示蛋白质CAF17350的Mowse得分和显著匹配的表；
[0028] 图4描述显示蛋白质Q6ZUD4的Mowse得分和显著匹配的表；
[0029] 图5描述显不蛋白质Q8N7P1的Mowse得分和显著匹配的表；
[0030] 图6描述显不蛋白质CAC69571的Mowse得分和显著匹配的表；
[0031] 图7描述显示蛋白质包含FERM 4结构域的蛋白质4的Mowse得分和显著匹配的 表；
[0032] 图8描述显示蛋白质JC1445蛋白酶体肽链内切酶复合物链C2长剪接的Mowse得 分和显著匹配的表；
[0033] 图9描述显示蛋白质突触融合蛋白11的Mowse得分和显著匹配的表；
[0034] 图10描述显示蛋白质AAK13083和AAK13049的Mowse得分和显著匹配的表。
[0035] 发明详述
[0036] 本发明提供使用液相色谱电喷雾离子化质谱，鉴定在人类血清中存在的蛋白质的 方法，所述蛋白质在正常个体和按照医生诊断已知患有非小细胞肺癌和哮喘的患者之间差 异地表达。通过确定在未患有任何人类肺组织病理学状态的人的群体、诊断患有哮喘的人 的群体和诊断有非小细胞肺癌的人的群体之间基本上和一致地差异地表达的蛋白质，并且 获得这些蛋白质的特征，可以在患者中通过鉴定相同的蛋白质并且定量所述蛋白质的表达 水平的血液测试来鉴定所述病理学状态的存在，以在各疾病的发展的更早期鉴定和诊断哮 喘或非小细胞肺癌。
[0037] 人类血液样品收集自志愿者。从已知未患有非小细胞肺癌或哮喘的个体收集30 个样品。已知未患有非小细胞肺癌或哮喘的个体包括，并且在本文中称为"正常群体"。此 夕卜，如本文所用术语"肺癌"，旨在描述非小细胞肺癌。从已知患有哮喘并且被医生诊断为患 有哮喘的个体收集28个血液样品。已知患有哮喘的个体包括，并且在本文中称为"哮喘群 体"。从已知患有非小细胞肺癌并且被医生诊断为患有非小细胞肺癌的个体收集30个血液 样品。已知患有非小细胞肺癌的个体包括，并且在本文中称为"肺癌群体"。通常，如本文所 用，术语"肺癌"旨在指非小细胞肺癌。最后，从已知由于按照医生记录的由于吸烟历史而 具有肺癌风险的个体收集71个血液样品。这71个样品为正在进行的研究和试验的对象， 并且因此未在本文讨论。
[0038] 所述血液样品使用标准静脉穿刺技术以IRB批准的实验方案，遵循知情同意原则 从志愿者收集入无菌的l〇ml BD Vacutainer?玻璃血清红顶管。所述血液样品然后在室 温下不受干扰地静置30分钟以使血液凝块。所述样品在室温下以2000rpm在标准台式离 心机（benchtop centrifuge)中旋转10分钟以将血清从血液样品分离。然后通过将血清 移液入第二管（secondary tube)来除去各样品的血清。所述第二管在冰上预冷以通过限 制由于蛋白水解和变性导致的降解而确保各血清试样的完整性。然后将来自收集的各样品 的血清试样分成在冰上在预冷的冷冻管（Cryovial tube)中的1.0ml的等分试样。将来自 所述血清试样的等分试样贮存在至少如零下80摄氏度（_80°C) -样冷的温度下。从放血 (phlebotomy)到在_80°C下1C存的处理时间不超过1小时。
[0039] 随机选择来自各个哮喘群体、正常群体和肺癌群体的8至10个血清试样以测试。 使来自各个群体的各个血清试样经受蛋白酶或消化剂（在这种情况下为胰蛋白酶）。胰蛋 白酶用作蛋白酶，并且因为其进行高度特异和高度可预测裂解的能力被期望用作蛋白酶， 这是由于以下事实：已知胰蛋白酶在赖氨酸和精氨酸的羧基侧裂解肽链，除了其中脯氨酸 紧接地存在于赖氨酸或精氨酸后之外。虽然使用胰蛋白酶，可以使用其它蛋白酶或消化剂。 期望使用这样的蛋白酶，或蛋白酶的混合物，其至少如胰蛋白酶一样特异地裂解。
[0040] 然后通过使试样进行离心和毛细管液相色谱从不可溶物质中分离胰蛋白酶肽 (其为通过胰蛋白酶裂解后剩下的肽），其中使用具有0. 1%甲酸的水性乙腈梯度液，使用 在Eksigent 2D毛细管HPLC上的0.375X 180_ Supelcosil ABZ+柱以实现产生的胰蛋 白酶肽的色谱分离。所述肽的分离是需要的，因为电喷雾离子化过程经受离子共抑制（ion co-suppression)，其中具有更高质子亲和力的离子类型将抑制具有较低质子亲和性的离 子的离子形成，如果它们同时地从电喷雾发射器洗脱的话，在该情况下电喷雾发射器与 HPLC柱的末端共终端（co-terminal)。
[0041] 该方法允许分离在胰蛋白酶消化中产生的大量肽，并且有助于最小化共抑制问 题，由此最大化假分子离子共抑制的形成的机会，从而最大化离子取样。各个试样的胰蛋白 酶肽然后进行LC-ESMS。所述LC-ESMS通过使在各个试样中的肽通过如上所述由水、乙腈 和甲酸组成的溶剂系统的柱及时地分离在各个试样中的各肽。
[0042] 所述肽然后在电喷雾离子源中喷射以使所述肽离子化并且产生如上所述的肽假 分子离子。使所述肽通过在LC-ESIMS中的质谱仪，其中分子质量就各肽假分子离子进行测 量。在通过LC-ESIMS之后，对于各样品中存在的肽从=质谱数据，即所述肽的强度、分子量 和洗脱时间产生质谱读数。质谱读数通常为通过LC-ESMS记录的的肽假分子离子信号的 图解说明，其中X轴为测量的质荷比，y轴为所述假分子离子信号的信号强度。然后通过控 制LC-ESMS的软件系统处理这些数据并且获得和贮存所得数据。
[0043] 一旦获得质谱数据并将其置于质谱读数上，进行比较分析，其中病理学状态之间 地（interpathologically)和病理学状态之内地（intrapathalogically)对于各个群体进 行在LC-ESMS中测试的各血清试样的质谱读数。在正常群体中测试的各个试样之间比较 质谱峰。然后在哮喘群体和肺癌群体中测试的各个试样之间比较质谱峰。进行病理学状态 之内地比较后，则进行病理学状态之间地比较，其中将对于哮喘群体在LC-ESMS中测试的 各个试样的质谱读数与在正常群体中测试的各个试样进行比较。同样地，将对于肺癌群体 在LC-ESMS中测试的各个试样的质谱读数与在正常群体中测试的各个试样进行比较。
[0044] 将具有如下质谱读数的肽确定为不显著地并且排除：当将哮喘群体或肺癌群体与 正常群体比较时，所述质谱读数指示肽强度不一致地差异性地病理学状态之内的表达或基 本上不改变（在强度上低于10倍方差（variance))。通常，所用的排除标准包括：对于给 定蛋白质，将至少一半所鉴定的特征肽的肽峰强度在源自来自各病理学状态的个体患者血 清的分析的至少10个数据组上做比较。如果源自给定蛋白质的大多数肽峰的强度在强度 上对于80 %的血清数据组是至少10倍高，将所述蛋白质分类为在两种病理学状态类别之 间差异地调节。
[0045] 然而，产生经观察被差异性调节的肽的蛋白质的特征是未知的并且需要鉴定。为 了进行所述蛋白质的鉴定，将肽假分子离子信号强度在整个已知数据库上比较，所述已知 数据库包含已知蛋白质和肽以及可疑蛋白质和肽的文库。
[0046] 将来自各个正常、肺癌和哮喘群体的各个试样的胰蛋白酶消化物的质谱读数输入 已知的称为Mascot的搜索引擎。Mascot为本领域已知的搜索引擎，其使用质谱数据以从四 个主要测序数据库，即MSDB、NCBInr、SwissProt和dbEST数据库鉴定蛋白质。这些数据库 包含已知序列的所有蛋白和基于源自基因序列的特征性蛋白质转录起始区域的观察的所 有推定蛋白方面的信息。对这些数据库就精度和冗余进行连续地检查并且进行连续的添加 作为新的蛋白质和基因序列在科学和专利文献中鉴定和出版。
[0047] 作为比较分析的结果，11种蛋白质被确定为在哮喘群体、肺癌群体和正常群体之 间一致地差异地表达。将搜索标准和参数输入Mascot程序，并且使来自各个群体质谱读数 的质谱数据通过Mascot程序运行。输入Mascot程序的质谱数据用于各病理学状态的所有 试样。Mascot程序然后针对测序数据库运行输入的肽的质谱数据，将各肽的峰强度和质量 与已知肽和蛋白质的质量和峰强度进行比较。Mascot然后产生搜索结果，其返回可能的蛋 白质鉴定匹配（对于分析的各样品通常称为"显著匹配"）的候选物列表。
[0048] 显著匹配通过Mascot程序通过对于测试的各个试样指派称为"Mowse得分"的得 分来确定。Mowse得分为一种算法，其中所述得分为-10*L0G1CI(P)，其中P是所观察的匹配 为随机事件的概率，其与其中P小于〇. 05的显著性p值相关，其在科学界为通常承认的标 准。约55至约66或以上的Mowse得分通常认为是显著的。由于特定搜索考虑和数据库参 数导致显著性水平稍微变化。对于各肽运行返回所述显著匹配，产生蛋白质的候选物列表。 [0049] 接下来，进行比较分析，将从哮喘群体和肺癌群体测试的各试样和从正常群体测 试的各试样的质谱读数进行比较。在哮喘、肺癌和正常病理学状态方面将与在LC-ESMS中 检测的推定鉴定蛋白相关的各个胰蛋白酶肽假分子离子信号（峰）进行比较。将具有如下 质谱峰强度的肽确定为无意义的并且排除：其指示当将哮喘群体或肺癌群体与正常群体比 较时肽的定量基本上未改变。通常，所用的排除标准包括：将给定蛋白质的至少一半鉴定的 特征肽的肽峰强度在源自来自各病理学状态的个体患者血清的分析的至少10个数据组上 做比较。如果源自给定蛋白质的大多数肽峰的强度在强度上对于80%的血清数据组是至少 10倍高，将所述蛋白质分类为在两种病理学状态类别之间差异地调节。
[0050] 使来自质谱读数的数据与所述显著匹配进行交互检查以验证原始数据、峰特性、 电荷多重性、同位素分布和侧翼电荷状态。然后进行逆谱库检索以将肽添加至候选物列表， 其可能被Mascot程序的自动搜索所错过。添加的肽通过以下来鉴定：选择表示与所比较的 肽的各参数基本上匹配的单一蛋白质的"最佳匹配"，进行计算机消化，其中所述胰蛋白酶 肽和其各自的分子质量基于蛋白质的已知氨基酸或基因序列进行计算。然后针对原始质谱 数据搜索这些预测的肽质量，并且使鉴定的任何峰如上所述进行检查和具有资格）。然后， 使包括通过Mascot自动鉴定的和通过手工检查鉴定的所有的肽进入由Mascot使用的质量 列表。如本文下面所述，然后将细化的匹配用于推导出细化的Mowse得分。
[0051] 参考图1至图10,就鉴定为在肺癌群体或哮喘群体与正常群体之间比较差异性表 达的各蛋白质显示Mascot搜索结果。在各情况中，输入搜索标准和参数，建立显著性的可 接受性的Mowse得分阈值。参考图1，显示蛋白质BAC04615的Mascot搜索结果。选择要搜 索的数据库为NCBInr 10,输入Mascot程序的试样的分类设置为智人（Homo sapiens) 12。 显著性的Mowse得分阈值确认为66的Mowse值或大于14。作为Mascot搜索的结果，获得 121的最高得分，如Mowse得分图形18所示，所述图的y轴表示具有特定Mowse得分的鉴定 的蛋白质的数量。
[0052] 仍然参考图1，如行20所示，对于gi/21755032给出121的最高Mowse得分。121 的Mowse得分是高度显著的，表示存在匹配是随机的非常低的可能性。实际上，如第28列所 示，该匹配将随机出现的预期将通过Mascot程序表示为1.7Χ1(Γ°_ 7。然而，在第22, 24和26 行中指示的蛋白质也具有非常高的Mowse得分，表示这3种蛋白质也是显著匹配。然后进行 手工分析，其中除去非显著的和/或噪音数据，并且交换检查原始数据、峰特征、电荷多重 性、同位素分布和侧翼电荷状态。作为手工分析的结果，在第22, 24和26行指示的蛋白质为 显著匹配的可能性显著地降低，并且因此，将在第22, 24和26行指示的蛋白质排除在匹配 之外。在图1中在第20行指示的蛋白质，gi/21755032,鉴定为通过将质谱数据输入Mascot 程序所指不的蛋白质，在第20行指不的蛋白质编号，gi/21755032，（其中gi编号有时与为 "GI"）仅仅是被连续地分配给由NCBI处理的各序列记录的一系列数字。gi/21755032与蛋 白质BAC04615相对应。
[0053] 参考图2,显示蛋白质Q6NSC8的Mascot搜索结果。如在Mowse得分图形30中通 过Mowse得分条形图（bar) 36所不，显著性29的Mowse得分阈值确认Mowse值为64,并且 获得117的最高Mowse得分。与Mowse得分条形图36相对应的鉴定的蛋白质为Q6NSC8， 如在第32行中所示。如在图2中所示，Mowse得分图形30的阴影线部分34表示如下蛋白 质：其被记录，但其在显著性的阈值之下，并且因此不予考虑。
[0054] 参考图3,显示蛋白质CAF17350的Mascot搜索结果。如在Mowse得分图形40中 通过Mowse得分条形图42所不，显著性38的Mowse得分阈值确认Mowse值为64,并且获得 152的最高Mowse得分。与Mowse得分条形图42相对应的鉴定的蛋白质为CAF17350,如在 第46行中所示。如在图3中所示，Mowse得分图形40的阴影线部分44表示如下蛋白质： 其被记录，但其在显著性的阈值之下，并且因此不予考虑。
[0055] 参考图4,显示蛋白质Q6ZUD4的Mascot搜索结果。如在Mowse得分图形50中通 过Mowse得分条形图52所不，显著性48的Mowse得分阈值确认Mowse值为64,并且获得 220的最高Mowse得分。与Mowse得分条形图52相对应的鉴定的蛋白质为Q6ZUD4,如在第 56行中所示。如在图4中所示，Mowse得分图形50的阴影线部分54表示如下蛋白质：其被 记录，但其在显著性的阈值之下，并且因此不予考虑。
[0056] 参考图5,显不蛋白质Q8N7P1的Mascot搜索结果。如在Mowse得分图形60中通 过Mowse得分条形图62所不，显著性58的Mowse得分阈值确认Mowse值为66,并且获得74 的最高Mowse得分。与Mowse得分条形图62相对应的鉴定的蛋白质为gi/71682143,如在 第64行中所示。与图1类似，gi/71682143对应于蛋白质Q8N7PI。在第66和68行中指示 的蛋白质也具有非常高的Mowse得分，表示这两种蛋白质也是显著匹配。然后进行手工分 析，其中除去非显著的和/或噪音数据，并且交换检查原始数据、峰特征、电荷多重性、同位 素分布和侧翼电荷状态。作为手工分析的结果，在第66和68行指示的蛋白质为显著匹配 的可能性显著地降低，并且因此，将在第66和68行指示的蛋白质排除在匹配之外。在图5 中Q8N7PI鉴定为通过将质谱数据输入Mascot程序而指示的蛋白质。指出在第70处关于 蛋白质Q8NB22的指示，因为其与Q8N7PI为相同的蛋白质。
[0057] 参考图6,显示蛋白质CAC69571的Mascot搜索结果。如在Mowse得分图形74中 通过Mowse得分条形图76所不，显著性72的Mowse得分阈值确认Mowse值为64,并且获得 171的最高Mowse得分。与Mowse得分条形图76相对应的鉴定的蛋白质为CAC69571，如在 第78行中所示。在第80, 82, 84和86行中指示的蛋白质也具有非常高的Mowse得分，表示 这4种蛋白质也是显著匹配。然后进行手工分析，其中除去非显著的和/或噪音数据，并且 交换检测原始数据、峰特征、电荷多重性、同位素分布和侧翼电荷状态。作为手工分析的结 果，在第80, 82, 84和86行指示的蛋白质为显著匹配的可能性显著地降低，并且因此，将在 第80, 82, 84和86行指示的蛋白质排除在匹配之外。在图6中CAC69571鉴定为通过将质 谱数据输入Mascot程序而指示的蛋白质。
[0058] 参考图7,描述包含蛋白质FERM 4结构域的蛋白质4的Mascot搜索结果。如在 Mowse得分图形90中通过Mowse得分条形图92所示，显著性88的Mowse得分阈值确认 Mowse值为64,并且获得335的最高Mowse得分。与Mowse得分条形图92相对应的鉴定的 蛋白质为包含FERM 4结构域的蛋白质4,如在第98行中所示。在第100, 102, 104、106和 108行中指示的蛋白质也具有非常高的Mowse得分，表示这5种蛋白质也是显著匹配。然后 进行手工分析，其中除去非显著的和/或噪音数据，并且交换检查原始数据、峰特征、电荷 多重性、同位素分布和侧翼电荷状态。作为手工分析的结果，在第100, 102, 104、106和108 行中指示的蛋白质为显著匹配的可能性显著地降低，并且因此，将在第100, 102, 104U06 和108行中指示的蛋白质排除在匹配之外。在图7中包含FERM 4结构域的蛋白质4鉴定 为通过将质谱数据输入Mascot程序而指示的蛋白质。
[0059] 参考图8,描述蛋白质JCC1445蛋白酶体肽链内切酶（endopeptidase)复合物链 C2长剪接形式（"JCC1445"）的Mascot搜索结果。如在Mowse得分图形112中通过Mowse 得分条形图114所示，显著性110的Mowse得分阈值确认Mowse值为66,并且获得123的 最高Mowse得分。与Mowse得分条形图114相对应的鉴定的蛋白质为gi/4506179,如在第 116 行中所示。gi/4506179 对应于蛋白质 JCC1445。在第 118, 120, 122, 124, 126 和 128 行 中指示的蛋白质也具有非常高的Mowse得分，表示这6种蛋白质也是显著匹配。然后进行手 工分析，其中除去非显著的和/或噪音数据，并且交换检查原始数据、峰特征、电荷多重性、 同位素分布和侧翼电荷状态。作为手工分析的结果，在第118, 120, 122, 124, 126和128行 中指示的蛋白质为显著匹配的可能性显著地降低，并且因此，将在第118, 120, 122, 124, 126 和128彳丁中指不的蛋白质排除在匹配之外。在图8中JCC1445鉴定为通过将质谱数据输入 Mascot程序而指示的蛋白质。
[0060] 参考图9,显示蛋白质突触融合蛋白11的Mascot搜索结果。如通过Mowse得分条 形图134、和第136和138行所示，显著性130的Mowse得分阈值确认Mowse值为66,并且 两次获得127的最高Mowse得分。对于突触融合蛋白11获得95的第三Mowse得分，如在 第140行中所示。在图9中突触融合蛋白11鉴定为通过将质谱数据输入Mascot程序而指 不的蛋白质。
[0061] 参考图10,描述两种蛋白质AAK13083和AAK13049的Mascot搜索结果。如在第 148行和Mowse得分条形图146所不，显著性142的Mowse得分阈值确认Mowse值为64,并 且通过蛋白质Q5VY82获得273的最高Mowse得分。在第150, 152和154行中指示的蛋白 质也具有非常高的Mowse得分，表示这3种蛋白质也是显著匹配。然而，作为进行手工分析 的结果，将在第150和154行中指示的蛋白质排除在可能的匹配之外。Q5VY82经受进一步 的调查和试验以确认其是否显著差异地表达。在图10中如在第152行中所示的AAK13049 和AAK13083都鉴定为通过将质谱数据输入Mascot程序而指示的蛋白质。
[0062] 图1至图10描述进行以鉴定所述11种蛋白质的数据分析，所述11种蛋白质当与 正常群体比较时在哮喘和/或肺癌群体中差异地表达。对于哮喘群体，正常群体和肺癌群 体就11种蛋白质的每一种进行本文所述并且如在图1至图10中所示的方法。
[0063] 作为鉴定过程的结果，确定为在哮喘群体肺癌群体和/或正常群体之间显著差异 地表达的 11 种蛋白质鉴定为 BAC04615、Q6NSC8、CAF17350、Q6ZUD4、Q8N7P1、CAC69571、包 含FERM结构域的蛋白质4、JCC1445蛋白酶体肽链内切酶复合物链C2长剪接形式、突触融 合蛋白 11、AAK13083 和 AAK130490。BAC04615、Q6NSC8、CAF 17350、Q6ZUD4、Q8N7P1 为由基 因测序成果产生的鉴定的蛋白质。已知包含FERM结构域的蛋白质4参予胞质内蛋白膜锚 定。JCC1445蛋白酶体肽链内切酶复合物链C2长剪接形式为已知的蛋白酶体。突触融合蛋 白11在细胞免疫应答中活跃。BAC04615、AAK13083和AAK130490为主要的组织相容性复 合物（"MHC"）相关蛋白。
[0064] 已经鉴定出在哮喘和肺癌患者中连续差异地表达的11种特定蛋白质，可以通过 以下在所述疾病的发展早期诊断这些病理学状态：使来自患者血清的蛋白质BAC04615、 Q6NSC8、CAF17350、Q6ZUD4、Q8N7P1、CAC69571、包含 FERM 结构域的蛋白质 4、JCC1445 蛋白 酶体肽链内切酶复合物链C2长剪接形式、突触融合蛋白11、AAK13083和AAK130490进行 LC-ESMS，从这些蛋白质获得质谱数据，并且将该质谱数据与正常群体的质谱数据进行比 较。可以通过将该质谱数据与来自肺癌群体和/或哮喘群体的质谱数据相比较而进行进一 步的分析，以验证或取消（nullify)给定病理学状态的存在。
[0065] 当然该分析可以扩展至多个另外的技术，由此可以确定特定的蛋白质浓度，包括 但不限于：放射免疫测定，酶联免疫吸附测定，经由可见光或紫外线的吸光度使用辐射测定 的、光谱测定的检测的高压液相色谱，质谱仪定性和定量分析，western印迹，借助于检测放 射性探针或核酸的定量显示的1或2维凝胶电泳、使用吸收或荧光光度法的基于抗体的检 测，通过许多化学发光报道子系统中的任何的发光的定量，酶促测定，免疫沉淀或免疫捕获 测定或许多固相和液相免疫测定中的任何。
[0066] 除了在疾病发展的早期确定肺癌或哮喘的存在之外，本文鉴定为此类病理学状态 的指示的蛋白质可以在相关方法中使用和应用以有助于治疗肺癌和/或哮喘的目的。例 如，可以开发抗体以与这些蛋白质结合。所述抗体可以组装在生物标记面板中，其中将任何 或所有的抗体组装在基于单一珠的面板（panel)或试剂盒中以用于基于珠的免疫测定。所 述蛋白质然后可以使用基于珠的技术，例如Luminex' s xMAP技术进行多重免疫测定，和定 量。此外，其它非基于珠的测定可以用于定量蛋白质表达水平。通过定量蛋白质表达水平， 这些定量结果可以与正常群体、哮喘群体、/或肺癌群体的表达水平相比较以进一步验证或 取消患者中肺癌或哮喘的存在。
[0067] 所述蛋白质也可使用和应用至药理学领域以评价患者对治疗性干预例如药物治 疗、放疗/化疗或外科手术治疗的反应。此外，测定个体蛋白质的试剂盒或蛋白质的面板可 用于患者的例行测试以监视患者的健康状况，所述患者处于病理学状态的较高风险中，例 如吸烟者，或具有该病理学状态的家族史的那些。
[0068] 最后，本文鉴定的11种蛋白的每一种的氣基酸序列的序列表随本文提受并且特 别引入以作参考。在序列表中，在SEQ ID N0:1中记载的氨基酸序列为提交本申请之日时 已知的蛋白质BAC04615的一级氨基酸序列。在SEQ ID N0:2中记载的氨基酸序列为提交 本申请之日时已知的蛋白质Q6NSC8的一级氨基酸序列。在SEQ ID N0:3中记载的氨基酸 序列为提交本申请之日时已知的蛋白质CAF17350的一级氨基酸序列。在SEQ ID N0:4中 记载的氨基酸序列为提交本申请之日时已知的蛋白质Q6ZUD4的一级氨基酸序列。在SEQ ID N0:5中记载的氨基酸序列为提交本申请之日时已知的包含FERM结构域的蛋白质4的 一级氨基酸序列。在SEQ ID N0:6中记载的氨基酸序列为提交本申请之日时已知的蛋白质 AAK13083的一级氨基酸序列。在SEQ ID N0:7中记载的氨基酸序列为蛋白质Q8N7P1提交 本申请之日时已知的一级氨基酸序列。在SEQ ID N0:8中记载的氨基酸序列为提交本申请 之日时已知的蛋白质CAC69571的一级氨基酸序列。在SEQ ID N0:9中记载的氨基酸序列 为提交本申请之日时已知的蛋白质JCC1445蛋白酶体肽链内切酶复合物链C2长剪接的一 级氨基酸序列。在SEQ ID N0:10中记载的氨基酸序列为提交本申请之日时已知的蛋白质 突触融合蛋白11的一级氨基酸序列。在SEQ ID N0:11中记载的氨基酸序列为在SEQ ID NO: 10中记载的氨基酸序列为提交本申请之日时已知的蛋白质AAK13049的一级氨基酸序 列。
[0069] 本文和在序列表中所述的氨基酸序列为提交本申请之日时已知的一级氨基酸序 列。应该理解在未来可以对在序列表中列出的序列进行修饰。例如，可以发现翻译后修饰， 其用列出的蛋白质的加工改变，或可以在体内在其功能的某些点上与所述蛋白质形成功能 性加合物。此外，序列表可以通过剪接差异或发现与命名蛋白质的相同家族的结构上密切 相关的蛋白质而改变。此外，由列出的蛋白质的加工或降解引起的在所有其排列中的蛋白 水解片段可以以亲本蛋白以在医学和药理学利用开发的所有方式产生可利用的标记片段。 此类修饰被视为在本文所述的本发明的范围，而无需背离本文所述本发明的范围。
[0070] 尽管本发明已经参考【具体实施方式】描述，该描述不旨以限制意义限制。参考本发 明说明书时，所述实施方式的各种改进，以及本发明的替代实施方式对本领域技术人员而 言是明显的。因此，认为所附权利要求将包括落入本发明范围的此类改进。
【权利要求】
1. 鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的蛋白质的方法，当与来自 未患有所述病理学状态的人类的血清中相同的所述蛋白质的表达水平相比时，所述蛋白质 具有改变的表达水平，所述方法包括以下步骤： 第一获得步骤，从不患有所述人类肺组织的所述病理学状态的人类群体获得大量人类 血清； 第二获得步骤，从患有哮喘的人类群体获得大量人类血清； 第三获得步骤，从患有非小细胞肺癌的人类群体获得大量人类血清； 暴露步骤，将在所述第一获得步骤、所述第二获得步骤和所述第三获得步骤中获得的 所述人类血清暴露于消化剂，所述消化剂将在所述人类血清中的所述蛋白质裂解成可预测 和定义的肽； 分离步骤，从所述人类血清分离所述肽； 使用液相色谱质谱仪，将来自在所述第一获得步骤、所述第二获得步骤和所述第三获 得步骤中获得的各个所述大量人类血清的所述肽进行分析，所述质谱仪其中具有疏水性固 定相的柱，以及流过所述柱的溶剂系统，所述溶剂系统分离所述肽，以及检测机构以产生质 谱读数，所述质谱读数包括所述肽的质量和测量随着所述肽通过所述柱的时间阶段的所述 肽的所述强度的图解说明； 第一比较步骤，将来自在所述第一获得步骤中获得的所述人类血清的所述质谱读数与 来自在所述第二获得步骤中获得的所述人类血清的所述质谱读数进行比较； 第二比较步骤，将来自在所述第一获得步骤中获得的所述人类血清的所述质谱读数与 来自在所述第三获得步骤中获得的所述人类血清的所述质谱读数进行比较； 第三比较步骤，将来自在所述第二获得步骤中获得的所述人类血清的所述质谱读数与 来自在所述第三获得步骤中获得的所述人类血清的所述质谱读数进行比较； 选择步骤，选择在所述第一比较步骤、所述第二比较步骤和所述第三比较步骤中比较 的所述质谱读数，其中所述质谱读数指示在以下之间相同的所述肽的基本上变化的所述强 度：(a).患有所述哮喘的所述人类群体与不患有所述肺组织病的所述病理学状态的所述 人类群体；(b).患有所述非小细胞肺癌的所述人类群体与不患有所述肺组织病的所述病 理学状态的所述人类群体；和（c).患有所述哮喘的所述人类群体与患有所述非小细胞肺 癌的所述人类的所述群体； 鉴定步骤，通过从在所述选择步骤期间选择的所述质谱读数获得所述肽的特征，鉴定 指示所述人类肺组织的所述病理学状态的所述蛋白质；和 其中所述人类肺组织的所述病理学状态包括所述哮喘和所述非小细胞肺癌。
2. 根据权利要求1所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的 蛋白质的方法，其中所述消化剂为胰蛋白酶或其它内切蛋白酶。
3. 根据权利要求2所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的 蛋白质的方法，其中所述鉴定步骤进一步包括以下步骤： 分析步骤，通过预定义的计算机程序分析在所述选择步骤期间选择的所述质谱读数， 所述预定义的计算机程序将所述肽的所述质谱读数与预鉴定的蛋白质的质谱读数的至少 一个文库比较，并且将在所述质谱读数中的所述肽的所述质量和所述强度与所述预鉴定的 蛋白质的质量和强度匹配；和 获得步骤，从所述预定义的计算机程序获得作为结果的鉴定的蛋白质。
4. 根据权利要求2所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的 蛋白质的方法，其中所述鉴定步骤进一步包括以下步骤： 运行步骤，通过预定义的计算机程序运行在所述分析步骤期间选择的所述质谱读数， 所述预定义的计算机程序将所述肽的所述质谱读数与预鉴定的蛋白质的质谱读数的至少 一个文库比较，并且将在所述质谱读数中的所述肽的所述质量和所述强度与所述预鉴定的 蛋白质的候选物列表的质量和强度匹配，所述候选物列表包括具有与所述肽的所述质量和 所述强度基本上类似的所述质量和所述强度的大量所述预鉴定的蛋白质；和 确定步骤，从所述候选物列表确定作为结果的鉴定的蛋白质。
5. 根据权利要求4所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的 蛋白质的方法，其中所述确定步骤包括消除在所述候选物列表中不是所述得到的鉴定的蛋 白质的蛋白质的步骤，包括以下步骤： 消除步骤，消除在所述候选物列表上的与所述肽的所述强度和质量不是最基本上相似 的所述蛋白质的所述强度和所述质量；和 选择步骤，从所述候选物列表选择与所述肽的所述强度和质量最基本上相似的所述强 度和所述质量。
6. 根据权利要求5所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的 蛋白质的方法，其中在所述鉴定步骤中鉴定的所述蛋白质包括CAC69571。
7. 根据权利要求5所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的 蛋白质的方法，其中在所述鉴定步骤中鉴定的所述蛋白质包括包含FERM结构域的蛋白质 4。
8. 根据权利要求5所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的 蛋白质的方法，其中在所述鉴定步骤中鉴定的所述蛋白质包括JC1445蛋白酶体肽链内切 酶复合物链C2长剪接。
9. 根据权利要求5所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的 蛋白质的方法，其中在所述鉴定步骤中鉴定的所述蛋白质包括突触融合蛋白11。
10. 根据权利要求6所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的 蛋白质的方法，其中在所述鉴定步骤中鉴定的所述蛋白质进一步包括包含FERM结构域的 蛋白质4。
11. 根据权利要求6所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的 蛋白质的方法，其中在所述鉴定步骤中鉴定的所述蛋白质进一步包括JC1445蛋白酶体肽 链内切酶复合物链C2长剪接。
12. 根据权利要求6所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的 蛋白质的方法，其中在所述鉴定步骤中鉴定的所述蛋白质进一步包括突触融合蛋白11。
13. 根据权利要求7所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的 蛋白质的方法，其中在所述鉴定步骤中鉴定的所述蛋白质进一步包括JC1445蛋白酶体肽 链内切酶复合物链C2长剪接。
14. 根据权利要求7所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的 蛋白质的方法，其中在所述鉴定步骤中鉴定的所述蛋白质进一步包括突触融合蛋白11。
15. 根据权利要求8所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的 蛋白质的方法，其中在所述鉴定步骤中鉴定的所述蛋白质进一步包括突触融合蛋白11。
16. 根据权利要求10所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态 的蛋白质的方法，其中在所述鉴定步骤中鉴定的所述蛋白质进一步包括JC1445蛋白酶体 肽链内切酶复合物链C2长剪接。
17. 根据权利要求11所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态 的蛋白质的方法，其中在所述鉴定步骤中鉴定的所述蛋白质进一步包括突触融合蛋白11。
18. 根据权利要求13所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态 的蛋白质的方法，其中在所述鉴定步骤中鉴定的所述蛋白质进一步包括突触融合蛋白11。
19. 根据权利要求16所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态 的蛋白质的方法，其中在所述鉴定步骤中鉴定的所述蛋白质进一步包括突触融合蛋白11。
20. 根据权利要求6, 7, 8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18或19所述的鉴定在人类血 清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的蛋白质的方法，其中在所述鉴定步骤中鉴定的 所述蛋白质进一步包括选自以下的至少一种蛋白质：BAC04615、Q6NSC8、CAF17350、Q6ZVD4 和 Q8N7P1。
21. 根据权利要求20所述的鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态 的蛋白质的方法，其中在所述鉴定步骤中鉴定的所述蛋白质进一步包括选自以下的至少一 种蛋白质：BAC04615、AK13083 和 AK13490。
22. 在患者中通过鉴定在所述患者的人类血清试样中改变的蛋白质的表达强度来诊断 人类肺组织的病理学状态的方法，所述方法包括： 第一获得步骤，获得用于所述蛋白质表达的所述改变的强度的待测试的所述患者血清 试样； 暴露步骤，将所述患者血清试样暴露于消化剂，所述消化剂将在所述患者血清试样中 的所述蛋白质裂解成定义的肽； 分离步骤，从所述患者血清试样分离所述肽； 使用液相色谱质谱仪，将来自在所述第一获得步骤中获得的所述患者血清试样的所述 肽进行分析，所述质谱仪其中具有疏水性固定相的柱，以及流过所述柱的溶剂系统，所述溶 剂系统分离所述肽，以及检测机构以产生质谱读数，所述质谱读数包括所述肽的质量和测 试随着所述肽通过所述柱的时间阶段的所述肽的所述强度的图解说明； 选择步骤，从所述人类血清试样选择至少一种所述肽以比较所述质谱读数，所述肽的 所述质谱读数代表在所述暴露步骤期间从其裂解所述肽的蛋白质的质谱读数； 第二获得步骤，对于由在所述选择步骤期间选择的所述肽代表的各个相同蛋白质获得 基本上未改变的表达强度的质谱读数，所述未改变的表达强度从未患有人类肺组织的所述 病理学状态的人类血清试样的群体进行确定； 第一比较步骤，将来自所述患者血清试样的在所述选择步骤期间选择的所述至少一种 肽的所述质谱读数与来自未患有所述人类肺组织的所述病理学状态的人类血清试样的所 述群体的所述未改变的蛋白质表达的所述质谱读数进行比较； 第一确定步骤，确定所述患者血清试样的所述蛋白质表达的所述强度是否改变； 其中所述蛋白质表达的所述改变的强度指示所述人类肺组织的所述病理学状态；和 其中所述人类肺组织的所述病理学状态包括非小细胞肺癌和哮喘。
23. 根据权利要求22所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中所述 消化剂为胰蛋白酶或其它内切蛋白酶。
24. 根据权利要求23所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中在所 述选择步骤中选择的所述蛋白质包括CAC69571。
25. 根据权利要求23所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中在所 述选择步骤中选择的所述蛋白质包括包含FERM结构域的蛋白质4。
26. 根据权利要求23所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中在所 述选择步骤中选择的所述蛋白质包括JC1445蛋白酶体肽链内切酶复合物链C2长剪接。
27. 根据权利要求23所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中在所 述选择步骤中选择的所述蛋白质包括突触融合蛋白11。
28. 根据权利要求24所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中在所 述选择步骤中选择的所述蛋白质进一步包括包含FERM结构域的蛋白质4。
29. 根据权利要求24所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中在所 述选择步骤中选择的所述蛋白质进一步包括JC1445蛋白酶体肽链内切酶复合物链C2长剪 接。
30. 根据权利要求24所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中在所 述选择步骤中选择的所述蛋白质进一步包括突触融合蛋白11。
31. 根据权利要求25所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中在所 述选择步骤中选择的所述蛋白质进一步包括JC1445蛋白酶体肽链内切酶复合物链C2长剪 接。
32. 根据权利要求25所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中在所 述选择步骤中选择的所述蛋白质进一步包括突触融合蛋白11。
33. 根据权利要求26所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中在所 述选择步骤中选择的所述蛋白质进一步包括突触融合蛋白11。
34. 根据权利要求28所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中在所 述选择步骤中选择的所述蛋白质进一步包括JC1445蛋白酶体肽链内切酶复合物链C2长剪 接。
35. 根据权利要求29所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中在所 述选择步骤中选择的所述蛋白质进一步包括突触融合蛋白11。
36. 根据权利要求31所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中在所 述选择步骤中选择的所述蛋白质进一步包括突触融合蛋白11。
37. 根据权利要求34所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中在所 述选择步骤中选择的所述蛋白质进一步包括突触融合蛋白11。
38. 根据权利要求 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31，32, 33, 34, 35, 36 或 37 所述的在患者中 诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中在所述选择步骤中选择的所述蛋白质进一步包 括选自以下的至少一种蛋白质：8八〇)4615、06呢08、04?17350、062￥04和08町？1。
39. 根据权利要求38所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中在 所述选择步骤中选择的所述蛋白质进一步包括选自以下的至少一种蛋白质：BAC04615、 AK13083 和 AK13490。
40. 根据权利要求39所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，进一步包 括： 第三获得步骤，获得从来自患有哮喘的人类的人类血清试样的群体在所述选择步骤期 间选择的所述肽代表的各个相同的蛋白质的表达强度的质谱读数； 第二比较步骤，将来自所述患者血清试样的在所述选择步骤期间选择的所述至少一种 肽的所述质谱读数与从来自患有哮喘的所述人类的人类血清试样的所述群体的所述质谱 读数进行比较； 第二确定步骤，确定所述患者血清试样的所述蛋白质表达的所述强度与从来自患有哮 喘的所述人类的人类血清试样的所述群体的所述蛋白质表达的所述强度是否基本上类似； 和 其中所述蛋白质表达的所述基本上类似的强度指示哮喘。
41. 根据权利要求39所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，进一步包 括： 第四获得步骤，获得从来自患有非小细胞肺癌的人类的人类血清试样的群体在所述选 择步骤期间选择的所述肽代表的各个相同的蛋白质的信号强度的质谱读数； 第三比较步骤，将来自所述患者血清试样的在所述选择步骤期间选择的所述至少一种 肽的所述质谱读数与从来自患有非小细胞肺癌的所述人类的人类血清试样的所述群体的 所述质谱读数进行比较； 第三确定步骤，确定所述患者血清试样的所述蛋白质表达的所述强度与从来自患有非 小细胞肺癌的所述人类的人类血清试样的所述群体的所述蛋白质表达的所述强度是否基 本上类似；和 其中所述蛋白质表达的所述基本上类似的强度指示小细胞肺癌。
42. 根据权利要求40所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，进一步包 括： 第四获得步骤，获得从来自患有非小细胞肺癌的人类的人类血清试样的群体在所述选 择步骤期间选择的所述肽代表的的各个相同的蛋白质的表达强度的质谱读数； 第三比较步骤，将来自所述患者血清试样的在所述选择步骤期间选择的所述至少一种 肽的所述质谱读数与从来自患有非小细胞肺癌的所述人类的人类血清试样的所述群体的 所述质谱读数进行比较； 第三确定步骤，确定所述患者血清试样的所述蛋白质表达的所述强度与从来自患有非 小细胞肺癌的所述人类的人类血清试样的所述群体的所述蛋白质表达的所述强度是否基 本上类似；和 其中所述蛋白质表达的所述基本上类似的强度指示小细胞肺癌。
43. 根据权利要求40所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中通过 以下从来自患有哮喘的人类的人类血清试样的所述群体获得所述蛋白质表达的所述强度 的所述质谱读数：消化来自所述群体的各个人类血清试样，从各个所述人类血清试样分离 肽，和使各个所述人类血清试样的所述肽进行所述液相色谱质谱。
44. 根据权利要求41所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中通过 以下从来自患有非小细胞肺癌的人类的人类血清试样的所述群体获得所述蛋白质表达的 所述强度的所述质谱读数：消化来自所述群体的各个人类血清试样，从各个所述人类血清 试样分离肽，和将各个所述人类血清试样的所述肽用于所述液相色谱质谱仪。
45.根据权利要求42所述的在患者中诊断人类肺组织的病理学状态的方法，其中通过 以下获得从来自患有非小细胞肺癌的人类的人类血清试样的所述群体的所述蛋白质表达 的所述强度的所述质谱读数：消化来自所述群体的各个人类血清试样，从各个所述人类血 清试样分离肽，和将各个所述人类血清试样的所述肽经受所述液相色谱质谱仪。
【文档编号】G01N30/88GK104297490SQ201410482100
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2008年9月11日 优先权日:2007年9月11日
【发明者】R·T·斯特里佩, E·伊兹比卡, S·H·贝克 申请人:癌症预防和治疗有限公司