一种抗非洲猪瘟病毒的特异性IgY抗体及制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种抗非洲猪瘟病毒p54蛋白的特异性IgY抗体及其制备方法，及利用该方法生产的IgY抗体在特异性检测非洲猪瘟病毒抗体中的应用。该特异性IgY抗体可以通过以下方法制备：利用基因重组表达的方法制备p54蛋白抗原，免疫23周龄海兰蛋鸡，共进行4次免疫，收集鸡蛋，利用饱和硫酸铵沉淀法提取和纯化卵黄免疫球蛋白(IgY抗体)。基于该特异性IgY抗体所建立的检测非洲猪瘟血清抗体的竞争ELISA方法，效果良好，只有非洲猪瘟的阳性血清检测结果呈阳性，与商品化ASFV抗体检测ELISA试剂盒的平行检测结果一致。该竞争ELISA方法可用于非洲猪瘟的血清流行病学普查和监测，防控该病经出入境口岸传入国内。
【专利说明】一种抗非洲猪瘟病毒的特异性IgY抗体及制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物病毒抗体检测领域，特别是涉及一种抗非洲猪瘟病毒p54蛋白特异性IgY抗体及制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]非洲猪瘟(African Swine Fever, ASF)是猪的一种烈性病毒病，自1909年首次在非洲发现以来，目前已蔓延扩散到整个非洲、欧洲、南美洲和亚洲等国家和地区，发病国家因此蒙受了巨大的经济损失，该病被国际动物卫生组织(OIE)列为重要动物疫病。我国虽然还没有发现非洲猪瘟疫情，但根据周边国家的发病情况，以及2006年以来我国部分省市暴发的猪流行性疫病给我们敲响了警钟，我国已面临ASF传入和流行的严重威胁。
[0003]非洲猪痕病毒(African Swine Fever Virus, ASFV)属于非洲猪痕病毒科,是目前唯一已知的代表种，也是唯一的虫媒DNA病毒。ASFV共有12个蛋白具有抗原表位，分别为p30 (CP204L)、p54(E183L)、p72 (B646L)、细菌组蛋白样蛋白(A104R)、plO(K78R)、3 个非结构蛋白(F334L、K196R 和 NP419L)和 4 个未定义的蛋白(B602L、C44L、Cp312R 和 K205R)，其中针对p54、K205R、A104R和B602L这4种蛋白的抗体滴度较高，维持时间也较长。p54是ASFV重要的结构蛋白，由E183L基因编码，分子质量约为25Ku，具有很好的抗原性，参与病毒中和反应。在弱毒攻毒后7d?1d即可检测到抗体，用该蛋白建立的ELISA抗体检测方法，具有很高的敏感性、特异性和稳定性，是目前综合评价最好的ELISA检测抗原。
[0004]鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)作用等同于哺乳动物的IgG，但与其他哺乳动物制备多克隆抗体相比，特异性IgY抗体制备具有抗原用量少、制备周期短、成功率高、动物创伤小、产量大等优势。IgY与IgG相比，其稳定性较强:室温保存适宜温度下可保存较长时间(6个月后中和病毒的活性没有太大的改变)，但浓度较低时(低于0.lmg/mL)放置5个月其活性开始下降，耐高温、耐酸，从而方便IgY抗体的运输和使用。目前纯化的IgY抗体已广泛在免疫沉淀反应、免疫电泳、ELISA、免疫电镜、免疫吸附和Western-blot等检测技术上应用。
[0005]非洲猪瘟属于一种外来疫病，目前我国还没有该病的报道，但近邻俄罗斯曾多次发生该病，最近的一次爆发于2014年8月，因此做好实验室技术储备，对于监测和防控该病的传入具有重要作用。目前关于ASFV p54蛋白的研究，主要集中在原核表达和鼠源单克隆抗体的制备以及基于此建立的ELISA方法，还未见特异性抗ASFV p54蛋白的鸡IgY抗体制备的报道。本发明旨在建立抗ASFV-p54蛋白的特异性IgY抗体的制备方法及基于IgY抗体的检测非洲猪瘟抗体的竞争ELISA方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种抗ASFV p54蛋白的特异性卵黄免疫球蛋白(抗体)及其制备方法，并进一步提供基于抗ASFV p54蛋白IgY抗体的检测非洲猪瘟血清抗体的竞争ELISA方法。
[0007]本发明提供了一种抗非洲猪瘟病毒p54蛋白的特异性IgY抗体的制备方法，包括以下步骤:
[0008](I)制备非洲猪瘟病毒重组p54抗原，所述p54抗原是用连接有所属重组p54蛋白基因的原核表达载体pET-52b(+)3C/LIC在大肠杆菌BL21(DE3)中表达得到的；
[0009](2)应用(I)所述重组p54抗原免疫产蛋鸡；所述免疫产蛋鸡的方法如下:
[0010]第一次免疫:将免疫抗原与等量弗氏完全佐剂乳化，抗原免疫剂量为200 μ g/只；
[0011]第二次免疫:第一次免疫后14d，将免疫抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，抗原免疫剂量为200 μ g/只；
[0012]第三次免疫:第二次免疫后14d，将免疫抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，抗原免疫剂量为200 μ g/只；
[0013]第四次免疫:第三次免疫后30d，直接注射免疫抗原，不使用佐剂，抗原免疫剂量为 200 μ g/ 只；
[0014](3)收集鸡蛋，分离蛋黄，提取卵黄免疫球蛋白，所述卵黄免疫球蛋白中即含有特异性的抗非洲猪瘟病毒P54蛋白的IgY抗体。
[0015]本发明的内容还包括按照上述方法制备的抗非洲猪瘟病毒p54蛋白的特异性IgY抗体。
[0016]进一步的，本发明的内容还包括所述的抗非洲猪瘟病毒P54蛋白在检测非洲猪瘟病毒抗体的应用。
[0017]具体的，本发明是通过以下技术方案实现的:
[0018](I)抗原制备
[0019]根据pET_52b (+) 3C/LIC质粒试剂盒说明，设计引入特定序列的p54基因的上下游引物，从含有ASFV-p54基因的pMD 18-T-p54质粒模板中PCR扩增该基因，通过T4DNA聚合酶的作用，将末端粘性化的P54基因克隆入pET-52b原核表达载体，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)菌株，挑取单菌落经PCR和测序鉴定；阳性克隆以lmmol/L的异丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)诱导2h，提取表达产物用SDS-PAGE检测；用蛋白纯化试剂盒(N1-NTA Fast Start Kit, Qiagen公司)纯化表达的重组蛋白，Western-blot检测蛋白的免疫原性，用BAC法测定蛋白浓度，以此纯化蛋白作为抗原备用。
[0020](2)动物免疫
[0021]将400 μ g/mL重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化，对23周龄的海兰蛋鸡进行首免，0.5mL/只，即200 μ g/只；分别间隔2周进行二免、三免，免疫原为400 μ g/mL p54纯化蛋白与弗氏不完全佐剂等体积乳化后的乳剂，免疫剂量为200 μ g/只；间隔一个月后用不加佐剂的纯化蛋白(200 μ g/只)进行第四次加强免疫；第一次免疫后开始收集鸡蛋，编号4 °C保存备用。
[0022](3)特异性IgY抗体的提取
[0023]卵黄水提液的制备:将收集的鸡蛋以75%酒精消毒，破壳，流出蛋清，收集卵黄，用蒸馏水充分冲洗后在无菌滤纸上滚动，除去残留的卵白蛋白，刺破卵黄膜，加卵黄液9倍体积pH5.2的蒸馏水稀释，充分搅匀后4°C静置过夜(12h)，次日取上清液以12 OOOrpm,4°C离心30min，取上清液备用。
[0024]硫酸铵沉淀法进一步提纯:将上述制备的卵黄水提液分别以w/v终浓度为50%、33%的硫酸铵盐析，4°C静置过夜；12 000rpm，4°C离心30min，弃上清，沉淀用少量0.01M、PH7.2的PBS溶解，并用透析袋除盐。
[0025]本发明进一步提供了基于上述抗ASFVp54蛋白的IgY抗体建立检测ASF血清抗体的竞争ELISA方法，包括:
[0026]用pH值9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释ASFV-p54蛋白抗原至工作浓度，100 μ L/孔包被酶标板(2.5yg/孔蛋白粗提物)，37°C包被2h或4°C过夜，甩干，备用；取酶标板，加入1:10稀释的ASFV阳性猪血清、阴性血清和待检血清，100 μ L/孔，37°C作用Ih,洗涤液洗板5次；加入一定稀释度的纯化ASFV特异性鸡IgY抗体，100 μ L/孔，37°C作用45min，洗涤液洗板5次；加入1:5000稀释的酶标抗体(HRP标记的兔抗鸡IgY)，100 μ L/孔，37°C作用45min，洗涤液洗板5次；加入底物，100 μ L/孔，室温避光显色10分钟；加终止液终止反应，50 μ L/孔，酶标检测仪测0D450的值。
[0027]本发明以重组ρ54蛋白为抗原免疫鸡获得了特异性的抗ASFV ρ54的IgY抗体，制备的特异性IgY抗体可用于ASF竞争ELISA检测。与鼠源等动物的抗体相比，IgY物理性质稳定，具有不激活哺乳动物补体，不结合哺乳动物Fe受体或细菌，不与类风湿因子发生非特异反应，易于保存和运输等优点，可明显降低检测的假阳性率。
[0028]为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定
[0030]其中M:蛋白质分子质量标准；1:阴性对照；2:空白对照；3:重组表达蛋白。
[0031]图2重组表达蛋白的Western-blot分析
[0032]其中M:蛋白质分子质量标准；1:大肠杆菌超声裂解上清对照；2:纯化的p54蛋白。
[0033]图3抗ASFV p54蛋白的IgY抗体消长规律变化趋势图
[0034]图4纯化IgY抗体的SDS-PAGE分析
[0035]其中M:预染蛋白质分子质量标准；1，2:纯化的IgY抗体。
[0036]图5纯化IgY抗体的Western-blot分析
[0037]其中M:预染蛋白质分子质量标准；1:纯化的p54蛋白与IgY的杂交结果。
【具体实施方式】
[0038]以下实施例是为了进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0039]实施例1:非洲猪瘟病毒p54蛋白的表达和纯化
[0040]1.1非洲猪瘟病毒p54蛋白的表达
[0041 ] 根据PET_52b (+) 3C/LIC质粒试剂盒说明，设计引入特定序列的p54基因的上下游引物，从含有ASFV-p54基因的pMD18-T-p54质粒模板中PCR扩增该基因，通过T4DNA聚合酶的作用，将末端粘性化的P54基因(GenBank登录号:EU874328)克隆入pET_52b原核表达载体，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)菌株，在含100mg/L氨苄青霉素(Amp)的LB平板上培养，挑取单个菌落，接种于2mL含100mg/L氨苄青霉素的LB培养液中，37°C，200rpm恒温摇床振荡培养至0D600值为0.6左右，加入终浓度为ImM的异丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)，诱导培养2h。将上述菌液4°C离心15min，去上清，收集菌体。用PBS重悬沉淀，40C 1000rpm离心15min，去上清。用破菌缓冲液重悬菌体，冰上超声破碎，4°C离心15min，收集上清和沉淀。将沉淀用细菌细胞蛋白裂解液处理，用变性不连续的12% SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，观察电泳结果，光密度扫描分析抗原纯度。
[0042]诱导表达产物的SDS-PAGE结果如图1所示，在分子量大小约为25Ku处出现一条特异性条带，与理论推测结果一致，说明含有重组表达载体的大肠杆菌在IPTG的诱导下表达出了目的蛋白。
[0043]1.2非洲猪瘟病毒p54蛋白的纯化
[0044]取出甘油菌，在20mL含氨苄青霉素的LB中扩大培养后，取出lmL，4400rpm离心1min,将上清倒掉，用500 μ L新鲜无菌LB重悬菌体。取100mL锥形瓶，加入200mL灭菌含氨苄青霉素的LB培养液，将重悬的菌体加入到LB培养液中，370C，225rpm进行扩大培养，当菌液的OD值达到1.0左右时加入IPTG诱导表达2h。利用蛋白纯化试剂盒(N1-NTA FastStart Kit, Qiagen公司)对表达蛋白进行纯化,纯化步骤如下:
[0045]I)纯化柱准备:取出纯化柱，上下轻轻颠倒几次，使柱中的树脂颗粒重悬。将纯化柱竖直放置，打开纯化柱的盖子，移去柱子底部的密封帽，使柱中的液体在重力作用下自然过柱。
[0046]2)菌液收集:将诱导培养后的菌液加入到50mL的离心管中，常温下4000 X g，离心1min,弃上清,收集菌体。
[0047]3)裂解:将离心好的菌体冰浴15min后，加入1mL native Lysis Buffer重悬菌体。冰浴30min，冰浴期间轻摇离心管2-3次，使菌体悬液混匀。
[0048]4)沉淀:将上述菌体混悬液在4?下，14000 Xg,离心30min,收集上清。
[0049]5)结合:将上清液加入到纯化柱中，让上清液在重力作用下自然过柱。
[0050]6)洗漆:加入4mL native Wash Buffer到纯化柱中，重力作用下过柱,弃洗液。用该洗涤缓冲液重复洗涤一次。
[0051]7)洗脱:在纯化柱下放置新的灭菌15mL离心管,加入2mL Elut1n Buffer,重力作用下过柱，收集洗脱液，此洗脱液即含有纯化的表达蛋白。
[0052]用蛋白浓度测定试剂盒(Pierce BCA Protein Assay Kit)测定纯化蛋白的浓度，然后保存于_20°C备用。
[0053]1.3 纯化 p54 蛋白的 Western-blot 鉴定
[0054]采用Western-blot方法对纯化后的蛋白进行抗原性分析,具体步骤如下:
[0055]I)取纯化后的蛋白和诱导表达阴性对照细菌超声裂解液，加入同体积的2 X Loading Buffer,混勻，95°C水浴 1min, 12000rpm 离心 2min,取上清进行 SDS-PAGE。
[0056]2)将处理好的样品加入12%的胶中进行电泳，2011^，301^11，4011^，211。
[0057]3)转膜:将PAGE胶上的蛋白转移至NC膜上，15V，30min。
[0058]4)封闭:转膜后，将NC膜在转膜缓冲液内浸泡5min，转移到TBST洗液中浸泡3min，然后在1% BSA的TBST中，4°C过夜封闭。弃封闭液，用TBST洗膜3次，5min/次。
[0059]5)加阳性血清:将膜浸在1:200稀释的非洲猪瘟阳性血清中，37°C孵育lh。将膜取出，用TBST洗涤3次，5min/次。
[0060]6)加酶标抗体:将膜浸在1:5000稀释的HRP标记的羊抗猪IgG (Sigma公司)中，37°C孵育Ih。将膜取出，用TBST洗涤3次，5min/次。
[0061]7)底物显色:将膜浸在DAB显色液中，室温避光显色5min。然后将膜取出，浸在双蒸水中，观察结果。
[0062]结果如图2所示，重组表达蛋白p54可以和非洲猪瘟标准阳性血清反应，阴性对照的蛋白不与非洲猪瘟标准阳性血清反应，试验结果表明原核重组表达的P54蛋白具有很好的抗原性。
[0063]实施例2:p54蛋白特异性IgY抗体的制备
[0064]2.1动物免疫
[0065]实验动物分组:健康的23周龄待开产的海兰蛋鸡，共12只，随机分为3组，每组4只。实验分组如下:A组为p54抗原免疫组；B组为pET-52b (+) 3C/LIC阴性质粒抗原对照组；C组为PBS对照组。
[0066]免疫接种程序:
[0067]首免的免疫原为p54抗原和阴性质粒抗原分别与等体积的弗氏完全佐剂乳化后的乳化液，二免和三免的免疫原为P54抗原和阴性质粒抗原分别与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后的乳化液，四免为不加佐剂的P54抗原和阴性质粒抗原。
[0068]⑴A组(p54抗原免疫组):每只鸡分别在第0、2、4、8周经胸肌三点肌肉注射p54抗原，0.5mL/次，即200 μ g/只。
[0069](2)B组(阴性质粒对照组):每只鸡分别在第0、2、4、8周经胸肌三点肌肉注射经BL21诱导后的阴性质粒，0.5mL/次，即200 μ g/只。。
[0070](3)C组(PBS空白对照组):每只鸡分别在第0、2、4、8周经胸肌肌肉注射无菌PBS，0.5mL/ 次。
[0071]收集血清:
[0072]分别于每次免疫前(即0、2、4周)、末次免疫后2周翅静脉采血，置室温自然凝固后,剥离血块,2000rpm离心lOmin，分离血清，100 μ L/管分装，_20°C保存备用。
[0073]收集鸡蛋:
[0074]—免后开始收集鸡蛋，编号4 C保存备用。
[0075]用间接ELISA方法检测血清中ASFV_p54蛋白抗体滴度的变化，以推测鸡蛋中特异性抗ASFV-p54蛋白的IgY抗体的产生情况。
[0076]2.2特异性IgY抗体的提取
[0077]2.2.1卵黄水提液(WSF)的制备
[0078]采用水稀释法进行IgY的初步分离:免疫鸡所产鸡蛋的外壳用清水洗干净(或用消毒过的湿布擦净)后，用75%的酒精擦拭，打一小孔，流出蛋清，从小孔内加入无菌去离子水，以尽量去除残留蛋清，重复3次，尽量去除蛋清，取出卵黄，蒸馏水漂洗，将蛋黄在滤纸上滚动，除掉表面的蛋清，或用滤纸轻轻擦拭卵黄表面，尽可能去除卵黄表面残余的蛋清，去除卵黄膜得到纯的卵黄液(或刺破蛋黄膜，收集蛋黄液)，并量其体积，用蒸馏水稀释9倍后调节pH至5.2，4°C静置过夜(12h)，次日取其上清液以12 OOOrpm，4°C冷冻离心30min，去除沉淀取其上清液，其中上清液中包含所要提取的IgY，即卵黄水提液(WSF)。
[0079]2.2.2硫酸铵沉淀法进一步提纯
[0080]在上述制备的卵黄水提液中滴加等体积饱和硫酸铵溶液使其饱和度达到50%，4°C静置过夜后，12 OOOrpm, 4°C离心30min，弃上清，离心得到沉淀物。用等体积蒸馏水溶解后滴加饱和硫酸铵溶液使其饱和度达33%，4°C静置Ih后，12 OOOrpm，4°C离心30min得到沉淀物，沉淀用少量0.01M、pH7.2的PBS溶解，并用透析袋除盐。
[0081]用蛋白浓度测定试剂盒(Pierce BCA Protein Assay Kit)测定初步提纯的IgY浓度，然后保存于_20°C备用。
[0082]2.3卵黄中IgY抗体效价的测定
[0083]采用ELISA方法测定卵黄中特异性IgY抗体的效价变化，具体操作步骤如下:
[0084]I)用pH值9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释ASFV_p54蛋白抗原至工作浓度，100 μ L/孔包被酶标板(2.5 μ g/孔蛋白粗提物)，4°C过夜。
[0085]2)取出96孔板，弃去包被液，加入封闭液，37°C温育2h，用PBST洗涤5次。
[0086]3)用抗体稀释液(0.1 % BSA的PBST)将鸡IgY抗体从1:200开始做倍比稀释，每孔加入100 μ L，每个样品做3个重复，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照，37°C孵育lh，用PBST洗涤5次。
[0087]4)每孔加入100 μ L 1:5000用PBS稀释的HRP标记的羊抗鸡IgY(Sigma公司)，37°C孵育Ih，用PBST洗涤5次。
[0088]5)每孔加入100 μ L已经配制好的TMB底物溶液，避光显色5?15min。
[0089]6)每孔加入50 μ L终止液终止反应，酶标仪测定并记录各孔0D450值，计算每个样品的平均值。
[0090]7)结果判定:阴性对照孔OD450值记为N，阳性对照孔OD450值记为P，若Ρ/Ν彡2.1，且P — N > 0.2，即判定结果为阳性。
[0091]结果如图3显示，在首免后7d的鸡蛋中即可检测到抗ASFV p54蛋白的特异性IgY抗体，抗体滴度约为1:256，即1:28，而后随着免疫次数的增加，抗体滴度也随之升高，在三免后1d特异性IgY抗体滴度达到最高水平(1:4096，1:212);此后抗体滴度略有下降(1:1024，1:210)，四免后抗体滴度略有升高，接近1:4096，四免后一个月抗体滴度仍维持在该水平。因此采用三免后1d的鸡蛋提取并纯化特异性的IgY抗体后用于竞争ELISA检测的研究。
[0092]2.4特异性IgY抗体的鉴定
[0093]采用SDS-PAGE方法分析提纯的IgY抗体的纯度，结果如图4所示，还原后的IgY抗体电泳可见2条带，相对分子质量约为68Ku和25Ku，分别为IgY的重链和轻链。
[0094]采用Western-blot方法对初步提纯后的特异性IgY抗体进行免疫原性分析，具体步骤参见实施例1中的1.3 (纯化p54蛋白的Western-blot鉴定),只需将一抗更换为特异性IgY抗体，二抗更换为HRP标记羊抗鸡IgY即可。
[0095]Western-blot结果显示(图4),制备的特异性IgY抗体可与表达的p54蛋白反应，在大小约为25Ku处形成特异性的反应条带，结果表明制备的IgY抗体是特异性针对ASFVP54蛋白的，且具有免疫活性，可用于后续的非洲猪瘟抗体的竞争ELISA检测的研究。
[0096]实施例3:p54蛋白特异性IgY抗体在检测非洲猪瘟抗体竞争ELISA中的应用
[0097]利用原核表达的P54蛋白和特异性抗ASFV-p54蛋白的IgY多抗建立了检测非洲猪瘟抗体的竞争ELISA方法，具体步骤如下:
[0098]I)用pH值9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释ASFV_p54蛋白抗原至工作浓度，100 μ L/孔包被酶标板(2.5 μ g/孔蛋白粗提物)，4°C过夜。
[0099]2)取出96孔板，弃去包被液，加入封闭液，37°C温育2h，PBST洗涤5次。
[0100]3)加入1:10稀释的ASFV阳性猪血清、阴性血清和待检血清，100 μ L/孔，37°C作用Ih，PBST洗涤5次。
[0101]4)加入1:400稀释的纯化ASFV特异性鸡IgY抗体，100 μ L/孔，37°C作用45min，PBST洗涤5次。
[0102]5)每孔加入10yL 1:5000用PBS稀释的HRP标记的羊抗鸡IgY，37°C孵育45min，用PBST洗涤5次。
[0103]6)每孔加入100 μ L已经配制好的TMB底物溶液，避光显色lOmin。
[0104]7)每孔加入50 μ L终止液终止反应，酶标仪测定并记录各孔0D450值。
[0105]8)结果判定:用该ELISA检测60份健康猪血清和标准阴性血清测定0D450值，计算抑制百分率:抑制率ΡΙ(% ) = [1-(检测样品0D450+标准阴性0D450) ] X 100%。计算检测样品的平均抑制率(ΡΙ’ )和标准偏差(S)。若待检样品PI >PI’ +3s，则判定为阳性，pi < Pr +3s，则判定为阴性。
[0106]竞争ELISA结果显示，该方法除了对非洲猪瘟阳性血清检测结果为阳性外，对猪传染性胸膜肺炎阳性血清、猪瘟阳性血清、猪伪狂犬病阳性血清、猪口蹄疫阳性血清及猪蓝耳病阳性血清的检测结果均为阴性，与商品化ASFV抗体检测ELISA试剂盒的平行检测结果一致，说明特异性的IgY抗体可用于竞争ELISA方法检测ASF抗体。
[0107]本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。
[0108]以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种抗非洲猪瘟病毒P54蛋白的特异性IgY抗体的制备方法，包括以下步骤: (1)将非洲猪瘟病毒P54蛋白基因连接在原核表达载体pET-52b(+) 3C/LIC上，将所述表达载体转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，并诱导其表达，获得所述非洲猪瘟病毒重组p54蛋白抗原； (2)应用(I)所述重组p54抗原免疫产蛋鸡；所述免疫产蛋鸡的方法如下:第一次免疫:将免疫抗原与等量弗氏完全佐剂乳化，抗原免疫剂量为200 μ g/只； 第二次免疫:第一次免疫后14d，将免疫抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，抗原免疫剂量为200 μ g/只； 第三次免疫:第二次免疫后14d，将免疫抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，抗原免疫剂量为200 μ g/只； 第四次免疫:第三次免疫后30d，直接注射免疫抗原，不使用佐剂，抗原免疫剂量为200 μ g/ 只； (3)收集鸡蛋，分离蛋黄，提取卵黄免疫球蛋白，所述卵黄免疫球蛋白中即含有特异性的抗非洲猪瘟病毒P54蛋白的IgY抗体。
2.根据权利要求1所述的方法制备获得的抗非洲猪瘟病毒P54蛋白的特异性IgY抗体。
3.权利要求2所述的抗非洲猪瘟病毒p54蛋白在检测非洲猪瘟病毒抗体的应用。
【文档编号】G01N33/569GK104262484SQ201410553923
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】张彩虹, 花群义, 刘建利, 曹琛福, 陶虹, 宗卉, 杨俊兴, 吕建强, 高又文, 孙洁, 曾少灵, 廖立珊, 唐金明, 黄超华 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心