一种烟草中氟节胺、仲丁灵和除芽通残留量的测定方法
【专利摘要】本发明公开一种烟草中氟节胺、仲丁灵和除芽通残留量的测定方法，包括以下步骤：提取烟草中的目标物、N-丙基乙二胺纯化、标准储备液和标准工作液的配制、液相色谱-串联质谱测定。本发明使用的超高效色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）在农残检测的灵敏度以及选择性方面都明显优于传统方法，在分析速度方面优于GC和普通LC-MS/MS法；与传统的气相色谱-电子捕获检测器法比较，采用基质分散固相萃取法来检测氟节胺、仲丁灵和除芽通，无需浓缩与过固相萃取小柱，简化了前处理过程，提高了分析灵敏度。
【专利说明】一种烟草中氟节胺、仲丁灵和除芽通残留量的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农药残留检测领域，涉及烟草中农药残留量检测技术，特别涉及烟草 中常用植物生长调节剂残留量的测定方法，具体是检测烟草中氟节胺、仲丁灵和除芽通的 残留量。
【背景技术】
[0002] 生长调节剂在现代农业、果蔬及烟叶生产中应用十分广泛，给人们的生产生活带 来了巨大的利益。随着人们环保意识的增加，人们不仅注重作物的产量和营养，更加关注对 环境的影响以及食品安全问题。国际烟草科学研究合作中心（C0RESTA)的农用化学品咨询 委员会（ACAC)在2008年制定的118种农用化学品指导性残留限量表中将氟节胺、仲丁灵 和除芽通的限量定为5mg/kg。
[0003] 烟草常施用的植物生长调节剂有可能会超出指导限量，因此监测烟草常施用农 药的残留量尤为重要。烟叶植物生长调节剂的分析方法主要有气相色谱法（GC)、气相色 谱-串联质谱法（GC - MS/MS)和高效液相色谱-串联质谱法（LC - MS/MS)。廖雅桦等利用凝 胶渗透色谱处理烟叶样品，高效液相色谱-串联质谱法测定了烟草中二甲戊灵、仲丁灵和 马来酰肼等抑芽剂残留。陈晓水等利用GC-MS/MS同时测定了烟草中的氟节胺等132种农 药残留，此方法适合于有机磷、有机氯和菊酯类农药的检测。2011年，烟草行业制定一系列 多农残检测标准，而这3种常用农药分列于两个检测标准，其中GC-ECD法测定氟节胺和除 芽通需要通过基质分散提取，单独的固相萃取和旋转蒸发浓缩，使得前处理过程较为复杂， 繁琐，并且标准方法虽然为多农残检测方法，但检测时间较长，不利于单独筛查植物生长调 节剂的残留量。
【发明内容】
[0004] 鉴于此，本发明目的在于提供一种简便、快捷的氟节胺、仲丁灵和除芽通残留量的 检测方法。
[0005] 为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种烟草中氟节胺、仲丁灵 和除芽通残留量的测定方法，包括以下步骤： 1) 提取烟草中的目标物： 称取烘干磨好的烟叶样品，加入纯水浸润，依次加入内标和乙腈，涡漩混合振荡；放入 冰箱冷冻后取出，依次加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠，涡旋振荡后离 心； 2) N-丙基乙二胺纯化： 移取上清液于新的离心管中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂，于漩涡振荡混合，然后高 速离心；吸取上清液经有机相滤膜过滤，移取滤液，并用乙腈和超纯水稀释后待测； 3) 标准储备液和标准工作液的配制： 用乙腈配制氟节胺、仲丁灵和除芽通标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20°C保存；取 一定量的各化合物储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得混合标准储备液； 用乙腈准确配制二甲戊灵-d5内标储备液，用内标储备液配制内标工作液，储存于棕 色玻璃瓶中；所有的储备液于_20°C保存,使用前将其恢复到室温； 用空白烟叶的萃取基质配制不同浓度的氟节胺，仲丁灵和除芽通标准工作溶液； 4)液相色谱-串联质谱测定： 吸取空白烟叶溶液和配制好的不同浓度的氟节胺、仲丁灵和除芽通标准工作溶液， 注入串联质谱检测器，按内标法以峰面积计算出样品待测液中氟节胺、仲丁灵和除芽通含 量； 前述串联质谱检测器为UPLC-MS/MS系统，选取的色谱柱为UPLC色谱柱：UPLCHSST3,规 格为100_^2.1111111、1.811111，柱温35°(：;进样量10此；串联质谱检测的条件为 ：电喷雾离 子源，喷雾电压：2. 6kV ;离子化温度350°C ;雾化气流量：1000L/Hr ;锥孔气流量50L/Hr ;碰 撞气流量为〇. 15ml/min ;碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30msec，正离子MRM 模式采集；洗脱条件为梯度洗脱，选取70%流动相A :甲酸水和30%流动相B :乙腈初始流动 相体系，分析时间为5min，进样量为5 y L ;所述甲酸水中甲酸体积分数为0. 1%，所述甲酸甲 醇溶液中甲酸体积分数为〇. 1%。
[0006] 优选地，所述步骤1)中提取过程依次加入的超纯水，IOy g/mL内标，乙腈的体积 分别为200ii L和10mL。
[0007] 优选地，所述涡漩振荡速率为2000rpm，震荡时间lmin，离心管在-KTC条件下保 持 IOmin。
[0008] 优选地，所述无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠的质量分别为4g、lg、 Ig 和 〇.5g。
[0009] 优选地，所述漩涡混合振荡的速率为2000rpm，振荡时间为2min，以4000rpm的速 率离心lOmin。
[0010] 优选地，步骤2)中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂的质量为150mg和25mg。
[0011] 优选地，所述步骤2)中移取滤液体积为200 iiL，加入乙腈和超纯水的体积为 IOOii L 和 700 i! Lo
[0012] 优选地，步骤4)中，梯度洗脱条件为：(T2min，90%A?50%A;2?2. 4min，50%A?30%A; 2. 4?4. Omin，30%A?20%A ;4.0?6.Omin，20%A?5%A，6. 0?9. 8min，5%A?5%A;9. 8?10. Omin， 5%A?90%A，10. 0?12. 0min，90%A?90%A ;流动相流速为 0? 3mL/min。
[0013] 优选地，步骤4)中测定烟草中氟节胺，仲丁灵和除芽通含量的具体操作为：吸取 标准空白烟草和配制好的不同浓度的氟节胺，仲丁灵和除芽通标准工作溶液，注入LC-MS/ MS系统，绘制氟节胺，仲丁灵和除芽通的线性回归方程，对纯化稀释后的样品待测液进行测 定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的 含量。
[0014] 本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对烟草样本优化了酶解条 件、固相萃取条件，并对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色 谱柱以及流动相体系。与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点： 1、本发明使用的超高效色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS)在农残检测的灵敏度以及选择 性方面都明显优于传统方法，在分析速度方面优于GC和普通LC-MS/MS法，而目前未见该检 测方法应用同时检测烟草中的氟节胺、仲丁灵和除芽通残留量。
[0015] 2、与传统的气相色谱-电子捕获检测器法比较，采用基质分散固相萃取法来检测 氟节胺、仲丁灵和除芽通。无需浓缩与过固相萃取小柱，简化了前处理过程，提高了分析灵 敏度。
[0016] 3、由于选取了超高效液相色谱柱，使得柱子的分离度明显提高，分析时间显著缩 短，提高检测通量。串联质谱的使用使得方法的选择性和灵敏度提高，更有利于低含量的植 物生长调节剂残留的测定。
[0017] 4、选取了空白基质配制标准曲线的方法，使得方法的准确性更高，有效消除基质 干扰和前处理过程中引起的误差。
[0018] 5、本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为氟节胺的选择离子流色谱图。
[0020] 图2为仲丁灵的选择离子流色谱图。
[0021] 图3为二甲戊灵的选择离子流色谱图。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合一个具体实施例进行说明。
[0023] 本实施例依次采用超纯水浸润样品，乙腈萃取分析物，N-丙基乙二胺（PSA)净化 样品，超高效液相色谱-串联质谱仪等步骤进行测定，可快速、准确、同时检测出烟草中氟 节胺、仲丁灵和除芽通的残留含量。
[0024] 1.仪器与试剂：Waters Xevo TQ超高效液相色谱-串联质谱仪（美国Waters公 司），配备电喷雾电离源（ESI);VtexMixer 230VeU振荡器(美国Labnet公司）;Sigma 3K15 离心机（德国Sigma公司）。
[0025] 甲酸为HPLC级（浓度为49-51%，德国Sigma公司）；乙腈、甲醇均为色谱 纯(美国Thermo-Fisher公司）；氟节胺、仲丁灵和除芽通标准品来自于Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers (化学纯度：98. 5%，Augsburg，德国），二甲戊灵 _d5 来自于 Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers (纯度：98. 5%，Augsburg，德国）。N-丙基乙二胺（PSA)吸附 齐U，水为超纯水。
[0026] 2.提取烟草中的分析物 准确称取2. OOg样品于50mL具盖离心管中，加入IOmL水，振荡直至样品被水充分浸 润。冷冻IOmin后移取IOmL乙腈至离心管中，然后将离心管置于涡漩混合振荡仪上，以 2000rpm速率振荡lmin。将离心管置于-KTC条件下保持lOmin，然后向离心管中加入4g 无水硫酸镁和Ig氯化钠，Ig柠檬酸钠和〇. 5g柠檬酸二氢钠，立即于漩涡混合振荡仪上，以 2000rpm速率振荡2min，然后以4000rpm速率离心lOmin。
[0027] 3. PSA 纯化 移取上清液I. OmL于I. 5mL离心管中，加入150mg无水硫酸镁及25mgPSA吸附剂，于 漩涡混合振荡仪上以2000rpm速率振荡2min，以6000rpm速率离心2min。吸取上清液经 0. 22 ii m有机相滤膜过滤，移取200 ii L，加入100 ii L乙腈，用超纯水稀释至I. OmL，待测。
[0028] 4.液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS)测定 (1)LC-MS/MS 条件： 色谱条件：Atiantis UPLC HSS T3 (100 mmX 2. 1 mm，I. 8 u m，美国 Waters 公司）；流 动相A :0. 1%甲酸水溶液(体积分数)，流动相B :0. 1%甲酸甲醇溶液(体积分数);流速0. 3mL/ min ;柱温 35° C ;进样量 10ML。梯度洗脱条件：(T2min，90%A?50%A ;2?2. 4min，50%A?30%A ; 2. 4?4. Omin，30%A?20%A ;4.0?6.Omin，20%A?5%A，6. 0?9. 8min，5%A?5%A;9.8?10. Omin， 5%A?90%A，10. 0?12. 0min，90%A?90%A。
[0029] 质谱条件：电喷雾离子源，喷雾电压（IS) :2. 6kV ;离子化温度350°C ;雾化气流量： 1000L/Hr ;锥孔气（cone)流量50L/Hr ;碰撞气流量为0. 15ml/min ;碰撞气为氩气，其余气 体为氮气；驻留时间为30msec，正离子MRM模式采集，监测离子对及其相应的碰撞能量（CE) 见表1。
[0030] 表1多反应监测模式下三种植物生长调节剂及其内标的部分质谱参数
【权利要求】
1. 一种烟草中氟节胺、仲丁灵和除芽通残留量的测定方法，其特征在于，包括以下步 骤： 1) 提取烟草中的目标物： 称取烘干磨好的烟叶样品，加入纯水浸润，依次加入内标和乙腈，涡漩混合振荡；放入 冰箱冷冻后取出，依次加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠，涡旋振荡后离 心； 2. N-丙基乙二胺纯化： 移取上清液于新的离心管中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂，于漩涡振荡混合，然后高 速离心；吸取上清液经有机相滤膜过滤，移取滤液，并用乙腈和超纯水稀释后待测； 3) 标准储备液和标准工作液的配制： 用乙腈配制氟节胺、仲丁灵和除芽通标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20°C保存；取 一定量的各化合物储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得混合标准储备液； 用乙腈准确配制二甲戊灵-d5内标储备液，用内标储备液配制内标工作液，储存于棕色 玻璃瓶中；所有的储备液于_20°C保存，使用前将其恢复到室温； 用空白烟叶的萃取基质配制不同浓度的氟节胺，仲丁灵和除芽通标准工作溶液； 4) 液相色谱-串联质谱测定： 吸取空白烟叶溶液和配制好的不同浓度的氟节胺、仲丁灵和除芽通标准工作溶液， 注入串联质谱检测器，按内标法以峰面积计算出样品待测液中氟节胺、仲丁灵和除芽通含 量； 前述串联质谱检测器为UPLC-MS/MS系统，选取的色谱柱为UPLC色谱柱：UPLC HSS T3， 规格为100 mmX 2.1 mm、1.8 iim，柱温35° C;进样量10ML;串联质谱检测的条件为：电喷 雾离子源，喷雾电压：2. 6 kV;离子化温度350 °C;雾化气流量：1000 L/Hr;锥孔气流量 50 L/Hr;碰撞气流量为0.15 ml/min;碰撞气为氦气，其余气体为氮气；驻留时间为30 msec，正离子MRM模式采集；洗脱条件为梯度洗脱，选取70%流动相A :甲酸水和30%流动相 B :甲酸甲醇溶液初始流动相体系，分析时间为5min，进样量为5 y L ;所述甲酸水中甲酸体 积分数为〇. 1%，所述甲酸甲醇溶液中甲酸体积分数为〇. 1%。
2. 根据权利要求1所述的烟草中氟节胺、仲丁灵和除芽通残留量的测定方法，其特 征在于，所述步骤1)中提取过程依次加入的超纯水，10 U g/mL内标，乙腈的体积分别为 200ii L 和 10mL〇
3. 根据权利要求2所述的烟草中氟节胺、仲丁灵和除芽通残留量的测定方法，其特征 在于，所述涡漩振荡速率为2000rpm，震荡时间lmin，离心管在-10°C条件下保持lOmin。
4. 根据权利要求3所述的烟草中氟节胺、仲丁灵和除芽通残留量的测定方法，其特征 在于，所述无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠的质量分别为4g、lg、lg和0. 5g。
5. 根据权利要求4所述的烟草中氟节胺、仲丁灵和除芽通残留量的测定方法，其特 征在于，所述漩润混合振荡的速率为2000rpm，振荡时间为2min，以4000rpm的速率离心 10min〇
6. 根据权利要求1所述的烟草中氟节胺、仲丁灵和除芽通残留量的测定方法，其特征 在于，步骤2)中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂的质量为150mg和25mg。
7. 根据权利要求1所述的烟草中氟节胺、仲丁灵和除芽通残留量的测定方法，其特 征在于，所述步骤2)中移取滤液体积为200 yL，加入乙腈和超纯水的体积为100 yL和 700 u L。
8. 根据权利要求1所述的烟草中氟节胺、仲丁灵和除芽通残留量的测定方法，其特征 在于，步骤4)中，梯度洗脱条件为：(T2min，90%A?50%A ;2?2. 4min，50%A?30%A ;2. 4?4. Omin， 30%A?20%A ;4.0?6.Omin，20%A?5%A，6. 0?9. 8min，5%A?5%A ;9.8?10.Omin，5%A?90%A， 10. 0?12. 0min，90%A?90%A ;流动相流速为 0? 3mL/min。
9. 根据权利要求1所述的烟草中氟节胺、仲丁灵和除芽通残留量的测定方法，其特征 在于，步骤4)中测定烟草中氟节胺，仲丁灵和除芽通含量的具体操作为：吸取标准空白烟 草和配制好的不同浓度的氟节胺，仲丁灵和除芽通标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，绘 制氟节胺，仲丁灵和除芽通的线性回归方程，对纯化稀释后的样品待测液进行测定，测得分 析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
【文档编号】G01N30/88GK104374857SQ201410612518
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】熊巍, 陶晓秋, 韶济民, 庞夙, 黄玫 申请人:中国烟草总公司四川省公司