一种单组份tmb显色液的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种单组份TMB显色液的制备方法，包括以下步骤：首先，分别称取柠檬酸7-10g、磷酸氢二钠16-20g、过硼酸钠0.1-0.5g置于1000mL烧杯A中，加入800mL纯化水溶解；其次，将烧杯A溶液的pH调整为4.5-6.0，加入甘油20-30mL，再加入1-3gEDTA；然后，称取TMB5-40mg置于100mL烧杯B中，加入10-30ml乙醇使其溶解；最后，将烧杯A、烧杯B中的溶液均转移到1000mL的容量瓶，加纯化水定容至1000mL，摇匀。通过本发明所制备的TMB显色液为单组份显色液，其与现有双组份TMB显色液相比，具有操作方便、灵敏度高，稳定性好、显色背景低的优点。
【专利说明】一种单组份TMB显色液的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及TMB显色液领域，具体地，涉及一种单组份TMB显色液的制备方法。
【背景技术】
[0002] TMB是一种过氧化物酶底物，用于ELISA反应。底物产生一种可溶性淡蓝色的末端 产物，可在370或635nm在分光光度计上读取。其适用于酶联免疫反应中的显色阶段的定量 和定性分析。其检验的原理是：当标记在抗体或抗原上的酶与显色液中的TMB、双氧水等反 应，加入终止液后溶液由无色变成黄色，黄色深浅反应ELISA体系中抗原抗体结合的多少， 从而判断某种抗原或抗体的多少。在通过酶标仪测度吸光值，判断免疫反应的程度。
[0003] 现有市售的酶联免疫试剂盒所采用TMB显色剂液大多为双组份，分A液和B液，使 用之前需要先混匀，在使用上存在缺点一是不够方便，二是在包装材料上存在成本提高和 资源浪费；三是使用中的混合过程容易造成批间质量不均一；四是还存在稳定性差、保存 时间短、显色背景高、灵敏度低等的缺点。
[0004] 现有技术的TMB显色液及其制备方法，由A液和B液等体积混合后得到，所述A 液各组分的摩尔浓度为：柠檬酸0. 01-0. 5mol/L，磷酸氢二钠0. 01-0. 5mol/L，过氧化氢 0. 01-0. 5mol/L，EDTAO. 1-lmmol/L;所述B液包括TMB、HC1和聚乙烯吡咯烷酮，所述TMB的 摩尔浓度为〇.l-lmm〇l/L，所述HC1的摩尔浓度为0. 01-0. 5mol/L，所述聚乙烯吡咯烷酮的 质量分数为〇. 1-10%。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种单组份TMB显色液的制备方法，以克服现 有TMB显色液稳定性差、显色背景高、操作麻烦的问题。
[0006] 本发明解决上述问题所采用的技术方案是：一种单组份TMB显色液的制备方法， 包括以下步骤： 首先，分别称取柠檬酸7-10g、磷酸氢二钠16-20g、过硼酸钠0. 1-0. 5g置于1000mL烧 杯A中，加入800mL纯化水溶解； 其次，将烧杯A溶液的pH调整为4. 5-6. 0,加入甘油20-30mL，再加入l-3gEDTA; 然后，称取TMB5-40mg置于100mL烧杯B中，加入10-30ml乙醇使其溶解； 最后，将烧杯A、烧杯B中的溶液均转移到1000mL的容量瓶，加纯化水定容至1000mL， 摇匀。
[0007] 采用本方法所制备的TMB显色液为单组份显色液，单组份TMB显色液避免了TMB 显色液在使用之间需要将A、B液混合的操作步骤，简化操作流程，减少了操作时间，提高了 效率，同时避免了因A、B液不同批次间的差异导致混合的显色剂的显色效果；并且，不会存 在因HC1挥发导致的TMB显色液的有效显色成分的浓度发生改变，进而提高了TMB显色液 的灵敏度；本方法中采用了过硼酸钠，与现有的过氧化氢相比较，其作为氧化剂在酶联免疫 显色阶段具有较好的氧化性；并且，本方法将pH控制在4. 5-6. 0之间，将TMB显色液的pH 控制在该范围内使得制备的单组份TMB显色液在显色过程中具有较好的稳定性、较低的显 色背景；且本发明过硼酸钠替换现有的过氧化氢、过氧化脲，实验证明，过氧化硼具有更好 的氧化性，本发明还加入了EDTA，使得通过本方法所制备的TMB显色液具有更好的稳定性。
[0008]进一步地，TMB10-30mg。
[0009] 将TMB的质量设置为10-30mg所制备的单组份TMB显色液具有较好的显色效果， 以及具有较高的灵敏度。
[0010] 一种单组份TMB显色液的制备方法，所述乙醇替换成DMSO。DMSO为一种极性非质 子溶剂，具有较好的渗透性，能与有机溶剂、水互溶，因此，DMSO能加快TMB的溶解，使之溶 解的更充分，且使溶解后的溶液更稳定。
[0011] 实验证明，DMSO作为溶剂一乙醇相比，稳定性更好。
[0012] 综上，本发明的有益效果是： 1、本发明所制备的TMB显色液为单组份显色液，单组份TMB显色液避免了TMB显色液 在使用之间需要将A、B液混合的操作步骤，减少了操作时间，提高了效率，同时避免了因A、 B液不同批次间的差异导致混合的显色剂的显色效果；并且，不会导致的TMB显色液的有效 显色成分的浓度发生改变，进而提高了TMB显色液的灵敏度。
[0013] 2、本发明中采用了过硼酸钠，与现有的过氧化氢相比较，其作为氧化剂在酶联免 疫显色阶段具有较好的氧化性。
[0014] 3、本发明将pH控制在4. 5-6. 0之间，将TMB显色液的pH控制在该范围内使得制 备的单组份TMB显色液在显色过程中具有较好的稳定性、较低的显色背景。
[0015] 4、本发明加入了EDTA，调高了所制备的TMB显色液的稳定性。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例，对发明作进一步地的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0017] 实施例1 : 一种单组份TMB显色液的制备方法，包括以下步骤： 首先，分别称取柠檬酸7g、磷酸氢二钠16g、过硼酸钠0.lg置于1000mL烧杯A中，加入 800mL纯化水溶解； 其次，将烧杯A溶液的pH调整为4. 5,加入甘油20mL，再加入1EDTA; 然后，称取TMB5mg置于100mL烧杯B中，加入10ml乙醇使其溶解； 最后，将烧杯A、烧杯B中的溶液均转移到1000mL的容量瓶，加纯化水定容至1000mL， 摇匀。
[0018] 实施例2 : 一种单组份TMB显色液的制备方法，包括以下步骤： 首先，分别称取柠檬酸l〇g、磷酸氢二钠20g、过硼酸钠0. 5g置于1000mL烧杯A中，加 入800mL纯化水溶解； 其次，将烧杯A溶液的pH调整为6. 0,加入甘油30mL，再加入3gEDTA; 然后，称取TMB40mg置于100mL烧杯B中，加入30ml乙醇使其溶解； 最后，将烧杯A、烧杯B中的溶液均转移到1000mL的容量瓶，加纯化水定容至1000mL， 摇匀。
[0019] 实施例3 : 一种单组份TMB显色液的制备方法，包括以下步骤： 首先，分别称取柠檬酸9g、磷酸氢二钠18g、过硼酸钠0. 2g置于1000mL烧杯A中，加入 800mL纯化水溶解； 其次，将烧杯A溶液的pH调整为5. 0,加入甘油25mL，再加入2gEDTA; 然后，称取TMB30mg置于100mL烧杯B中，加入20ml乙醇使其溶解； 最后，将烧杯A、烧杯B中的溶液均转移到1000mL的容量瓶，加纯化水定容至1000mL， 摇匀。
[0020] 实施例4 : 一种单组份TMB显色液的制备方法，包括以下步骤： 首先，分别称取柠檬酸9g、磷酸氢二钠18g、过硼酸钠0. 2g置于1000mL烧杯A中，加入 800mL纯化水溶解； 其次，将烧杯A溶液的pH调整为5. 0,加入甘油25mL，再加入2gEDTA; 然后，称取TMB30mg置于100mL烧杯B中，加入lOmlDMSO使其溶解； 最后，将烧杯A、烧杯B中的溶液均转移到1000mL的容量瓶，加纯化水定容至1000mL， 摇匀。
[0021] 实施例5: 一种单组份TMB显色液的制备方法，包括以下步骤： 首先，分别称取柠檬酸9g、磷酸氢二钠18g、过硼酸钠0. 2g置于1000mL烧杯A中，加入 800mL纯化水溶解； 其次，将烧杯A溶液的pH调整为5. 0,加入甘油25mL，再加入2gEDTA; 然后，称取TMB30mg置于100mL烧杯B中，加入30mlDMS0使其溶解； 最后，将烧杯A、烧杯B中的溶液均转移到1000mL的容量瓶，加纯化水定容至1000mL， 摇匀。
【权利要求】
1. 一种单组份TMB显色液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 首先，分别称取柠檬酸7-10g、磷酸氢二钠16-20g、过硼酸钠0. 1-0. 5g置于lOOOmL烧 杯A中，加入800mL纯化水溶解； 其次，将烧杯A溶液的pH调整为4. 5-6. 0,加入甘油20-30mL，再加入l-3gEDTA ; 然后，称取TMB5-40mg置于100mL烧杯B中，加入10-30ml乙醇使其溶解； 最后，将烧杯A、烧杯B中的溶液均转移到lOOOmL的容量瓶，加纯化水定容至1000mL， 摇匀。
2. 根据权利要求1所述的一种单组份TMB显色液的制备方法，其特征在于，所述 TMB10-30mg〇
3. 根据权利要求1或2所述的一种单组份TMB显色液的制备方法，其特征在于，所述乙 醇替换成DMS0。
【文档编号】G01N21/78GK104458719SQ201410685416
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】杨秦, 张志新, 陶家春, 叶正义 申请人:成都威尔诺生物科技有限公司