一种同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，包括对照品标准曲线的制作、山药待测样品的前处理及测定，其中待测样品的前处理为：将山药样品用浓度(v/v)为20％-60％的甲醇水溶液进行超声提取20-40min，摇匀后取部分提取液至离心管离心，吸取上清液后采用滤膜过滤得到待测样品溶液；所述山药待测样品的测定采用液相色谱串联质谱法。本发明结合了色谱和质谱的优点，特异性强、灵敏度高，可同时达到鉴定和质量控制的目的，为山药及其饮片的质量控制提供了参考依据。
【专利说明】一种同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法。
【背景技术】
[0002] 山药，别名怀山药、淮山药，简称淮山，为薯蓣科植物薯蓣的干燥根茎，是药食两用 资源，有补肾养胃，生津益肺，补肾涩精的功效，是六味地黄丸、知柏地黄丸、地奥心血康等 中药的主要成分，并广泛应用于各类中药配方。2010版《中国药典》收载山药品种，对山药 及其饮片的质量控制仅限于常规的水分、灰分及浸出物等检测，不利于山药在临床上的应 用及推广。
[0003] 尿囊素和腺苷是山药的主要成分之一，腺苷类化合物对糖及脂肪的代谢、核酸及 蛋白质的合成等起着重要的调节作用。药理研究表明，腺苷具有舒张血管、降低血压、减慢 心律、抑制血小板聚集、松弛血管平滑肌等生理活性，还具有触发或介导缺血预适应、减轻 再灌注损伤等心脏保护应用；尿囊素具有修复上皮组织促进皮肤溃疡和伤口愈合生肌等作 用与山药的功效密切相关。因此尿囊素和腺苷在山药及其饮片的质量控制中具有重大的作 用。
[0004] 目前尿囊素的含量测定主要集中在薄层色谱法、红外色谱法、毛细管电泳法、高效 液相色谱法等，然而山药中富含多糖、淀粉类物质，容易干扰目标成分的测定，因此目前的 检测方法中待测样品的前处理较复杂，专属性差，且灵敏度低。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明的目的在于提供一种采用液相色谱串联质谱分离并快速测 定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，特异性强、灵敏度高，可同时达到鉴定和质量控制的目 的，为山药及其饮片的质量控制提供了参考依据。
[0006] 本发明提供的技术方案为：
[0007] -种同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，包括对照品标准曲线的制作、 山药待测样品的前处理及测定，其中待测样品的前处理为：将山药样品用浓度（v/v)为 20% -60 %的甲醇水溶液进行超声提取20-40min，摇匀后取部分提取液至离心管离心，吸 取上清液后采用滤膜过滤得到待测样品溶液；所述山药待测样品的测定采用液相色谱串联 质谱法。
[0008] 优选的是，所述的同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，其中，
[0009] 标准曲线的制作：将减压干燥至衡重的尿囊素和腺苷对照品，加入与待测样品前 处理使用的浓度相同的甲醇水溶液制备不同浓度的对照品混标溶液，采用液相色谱串联质 谱方法进行测定，其中尿囊素采用正离子模式，腺苷采用负离子模式，以尿囊素或腺苷的色 谱峰面积为纵坐标，其相对应浓度为横坐标进行线性回归制作标准曲线；
[0010] 山药待测样品的测定：将待测样品经前处理，通过液相色谱串联质谱方法进行测 定，其中尿囊素采用正离子模式，腺苷采用负离子模式，得出尿囊素或腺苷的色谱峰面积， 代入标准曲线计算得出山药待测样品中尿囊素和腺苷的含量。
[0011] 优选的是，所述的同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，所述液相色谱串联 质谱法测定的色谱条件包括：色谱柱：PursuitC182. 0*100mm，3. 0i!m;柱温：30°C;流动相 为甲醇和水，等度洗脱，分析时间为8min，其中所述流动相体积比为甲醇：水=10 : 90,流 速为 0? 20ml/min;进样量：3ill。
[0012] 优选的是，所述的同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，所述液相色谱串联 质谱法测定的质谱条件包括：电喷雾离子源（ESI);检测器毛细管电压1. 3kV;电喷雾电压 5kV;离子源温度50°C;脱溶剂气温度300°C;干燥气压力20psi;雾化气压力50psi;多级反 应监测（MRM)模式测定；采用正、负离子切换扫描模式进行测试，其中尿囊素采用正离子模 式，监测母离子为m/z156. 7,子离子为113. 6和96. 6,毛细管电压为-45V，碰撞能量分别为 10. 5V和13. 0V，腺苷采用负离子模式，监测母离子为m/z268. 2,子离子为135. 9和252. 7， 毛细管电压为55V;碰撞能量分别为16. 0V和5. 0V。
[0013] 优选的是，所述的同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，所述待测样品的前 处理中，每1克山药样品添加20ml浓度（v/v)为40%的甲醇水溶液进行超声提取。
[0014] 优选的是，所述的同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，所述超声提取次数 为1次，超声提取时间为30min。
[0015] 优选的是，所述的同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，所述离心的转速为 10000r/min，离心时间为lOmin。
[0016] 优选的是，所述的同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，所述滤膜过滤为 0. 22ilm微孔滤膜过滤。
[0017] 本发明所述的同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，将液相色谱与质谱串联 使用，具有分离能力强、特异性强、灵敏度高的特点，可同时达到鉴定和质量控制的目的，相 比高效液相色谱法，本发明的待测样品的前处理方法简单、快速，具有如下有益效果：
[0018] (1)本发明的待测样品的前处理采用超声波提取，操作简单、时间短，采用20ml浓 度（v/v)为40%的甲醇水溶液作为提取剂时，使用一次超声提取30min提取效率最高；
[0019] (2)本发明将超声后的待测样品溶液在10000r/min的转速下离心lOmin，使山药 中的淀粉等大分子充分沉淀，提高了待测样品溶液进行液相色谱串联质谱测定时的抗干扰 性；
[0020] (3)采用0. 22ym微孔滤膜过滤，滤过细微颗粒，防止进入柱子造成堵塞及损坏质 谱；
[0021] (4)本发明的测定方法灵敏度高，检测尿囊素与腺苷的检测限分别为0.002、 0? 006i!g/ml，定量限分别为 0? 015、0. 080i!g/ml。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为本发明所述的反应监测模式（MRM)测定得到的尿囊素标准品色谱图；
[0023] 图2为本发明所述的多反应监测模式（MRM)测定得到的腺苷标准品色谱图；
[0024] 图3为本发明所述的多反应监测模式（MRM)测定得到的山药提取物中腺苷及尿囊 素色谱图；
[0025] 图4为本发明的尿囊素标准曲线；
[0026] 图5为本发明的腺苷标准曲线。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。
[0028] 本发明提供一种同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，包括以下步骤：
[0029] (1)标准曲线的制作：将减压干燥至衡重的尿囊素和腺苷对照品，加入浓度（v/v) 为40%的甲醇水溶液配制成每lml含有150. 0yg尿囊素和每lml含有20. 0yg腺苷的混标 溶液，根据需要稀释成不同浓度的混标溶液，将其先通过液相色谱分离尿囊素和腺苷，再经 过质谱测定，其中尿囊素采用正离子模式，腺苷采用负离子模式，以尿囊素或腺苷的色谱峰 面积Y为纵坐标，其相对应浓度X为横坐标进行线性回归制作标准曲线，并考察线性关系， 分别得到标准曲线如图4和图5,标准曲线、线性范围、相关系数、定量限及检测限见表1 ;
[0030] 表1尿囊素与腺苷的标准曲线、线性范围、相关系数、定量限及检测限
【权利要求】
1. 一种同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，其特征在于，包括对照品标准曲线 的制作、山药待测样品的前处理及测定，其中待测样品的前处理为：将山药样品用浓度（V/ V)为20 % -60 %的甲醇水溶液进行超声提取20-40min，摇匀后取部分提取液至离心管离 心，吸取上清液后采用滤膜过滤得到待测样品溶液；所述山药待测样品的测定采用液相色 谱串联质谱法。
2. 如权利要求1所述的同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，其特征在于，其中， 标准曲线的制作：将减压干燥至衡重的尿囊素和腺苷对照品，加入与待测样品前处理 使用的浓度相同的甲醇水溶液制备不同浓度的对照品混标溶液，采用液相色谱串联质谱方 法进行测定，其中尿囊素采用正离子模式，腺苷采用负离子模式，以尿囊素或腺苷的色谱峰 面积为纵坐标，其相对应浓度为横坐标进行线性回归制作标准曲线； 山药待测样品的测定：将待测样品经前处理，通过液相色谱串联质谱方法进行测定，其 中尿囊素采用正离子模式，腺苷采用负离子模式，得出尿囊素或腺苷的色谱峰面积，代入标 准曲线计算得出山药待测样品中尿囊素和腺苷的含量。
3. 如权利要求2所述的同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，其特征在于，所述 液相色谱串联质谱法测定的色谱条件包括：色谱柱：Pursuit C182. 0*100mm，3. Oiim ;柱 温：30°C;流动相为甲醇和水，等度洗脱，分析时间为8min，其中所述流动相体积比为甲醇： 水=10 : 90,流速为 0.20ml/min;进样量：3iil。
4. 如权利要求3所述的同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，其特征在于，所 述液相色谱串联质谱法测定的质谱条件包括：电喷雾离子源（ESI);检测器毛细管电压 1. 3kV ;电喷雾电压5kV ;离子源温度50°C ;脱溶剂气温度300°C ;干燥气压力20psi ;雾化 气压力50psi ;多级反应监测（MRM)模式测定；采用正、负离子切换扫描模式进行测试，其 中尿囊素米用正尚子模式，监测母尚子为m/z 156. 7,子尚子为113. 6和96. 6,毛细管电压 为-45V，碰撞能量分别为10. 5V和13. 0V，腺苷采用负离子模式，监测母离子为m/z268. 2,子 离子为135. 9和252. 7,毛细管电压为55V ;碰撞能量分别为16. 0V和5. 0V。
5. 如权利要求4所述的同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，其特征在于，所述 待测样品的如处理中，每1克山药样品添加20ml浓度（v/v)为40%的甲醇水溶液进行超声 提取。
6. 如权利要求4所述的同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，其特征在于，所述 超声提取次数为1次，超声提取时间为30min。
7. 如权利要求4所述的同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，其特征在于，所述 离心的转速为l〇〇〇〇r/min，离心时间为lOmin。
8. 如权利要求4所述的同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，其特征在于，所述 滤膜过滤为0. 22 y m微孔滤膜过滤。
【文档编号】G01N30/88GK104330516SQ201410697800
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】何丽丽, 谷筱玉, 宋志军 申请人:广西壮族自治区药用植物园