本发明属于药物领域，特别涉及一种根据迈克尔加成反应活性快速预测对映贝壳杉烯抗肿瘤活性方法。
背景技术：
迈克尔加成反应（Michael addition reaction）是亲电的共轭体系与亲核的负电体系进行的共轭亲核加成反应。一般来说，烯键或炔键与吸电子基团（如羰基、氰基等）共轭相连形成的官能团可构成亲电共轭体系，含有该共轭体系的化合物称为迈克尔反应受体分子。迈克尔反应受体分子具有许多重要的药理活性，如抗肿瘤活性，酶抑制活性，抗病毒活性，抗炎活性，醌还原酶诱导活性等。迈克尔反应受体分子是一类重要的烷化剂，它能与细胞酶中半胱氨酸残基的巯基或细胞上其它亲核基团发生迈克尔加成反应形成共价键结合，从而产生重要的生物效应，如抗肿瘤活性。对映贝壳杉烯二萜是一类具有显著抗肿瘤活性的天然迈克尔反应受体分子，如冬凌草甲素和冬凌草乙素等具有较广谱的抗肿瘤活性，对人早幼粒白血病细胞、人宫颈癌细胞、人食管癌细胞、人肝癌细胞等许多肿瘤细胞有较强的抑制作用。目前，冬凌草甲素已作为一种重要的抗肿瘤新药开发。研究表明，绝大部分对映贝壳杉烯二萜的抗肿瘤活性与其D环中具有exo-亚甲基环戊酮结构有关，其紫外可见光谱最大吸收波长约240nm。该结构可以与受体氨基酸的亲核基团，如氨基、羟基及巯基等发生不可逆迈克尔加成反应，从而体现出显著的抗肿瘤活性，此机制已得到大多数研究者的认可。本发明公开了对映贝壳杉烯二萜与对硝基苯甲酰乙酸乙酯（Ethyl 4-nitrobenzoylacetate）迈克尔加成反应活性与其抗肿瘤活性之间存在正向相关性，即迈克尔加成反应活性越高，抗肿瘤活性越好。据此建立了一种根据测定迈克尔加成反应活性来快速预测对映贝壳杉烯抗肿瘤活性的方法。采用紫外光谱动力学法快速测定对映贝壳杉烯二萜与对硝基苯甲酰乙酸乙酯迈克尔加成反应速率。对映贝壳杉烯二萜与对硝基苯甲酰乙酸乙酯迈克尔加成反应为二级反应，反应物对映贝壳杉烯二萜浓度的倒数与反应时间呈线性关系。对映贝壳杉烯二萜紫外可见光谱最大吸收波长约240nm，根据朗伯比尔定律和吸光度加和原理，反应体系240nm波长处吸光度可以代表对映贝壳杉烯二萜浓度，因此，通过监测反应体系240nm波长处吸光度可以反映对映贝壳杉烯二萜浓度变化，从而快速测得迈克尔加成反应速率，快速预测抗肿瘤活性。该快速预测对映贝壳杉烯抗肿瘤活性方法与常规MTT法和抗肿瘤动物模型法比较，具有简便、快速、需要样品量少、经济等优势，可作为对映贝壳杉烯二萜抗肿瘤活性快速、高通量筛选方法，具有重要的实际应用价值。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种根据迈克尔加成反应活性快速预测对映贝壳杉烯二萜抗肿瘤活性的方法。该快速预测方法与常规MTT法和抗肿瘤动物模型法比较，具有简便、快速、需要样品量少、经济等优势，可作为对映贝壳杉烯二萜抗肿瘤活性快速、高通量筛选方法，具有重要的实际应用价值。
本发明的技术方案是这样实现的：
将对硝基苯甲酰乙酸乙酯的乙醇溶液和乙醇钠的乙醇溶液，混匀，放置一定时间后，加入对映贝壳杉烯二萜的乙醇溶液，快速摇匀，得迈克尔加成反应溶液；控制反应温度，采用紫外可见分光光度计立即对迈克尔加成反应溶液进行紫外动力学测试，记录240nm波长处反应体系的吸光度随反应时间变化曲线；以反应体系240nm波长处吸光度倒数对反应时间作图，线性回归得到线性方程，获得线性方程斜率；根据吸光度倒数对反应时间的线性方程斜率，即迈克尔加成反应速率快速预测对映贝壳杉烯二萜抗肿瘤活性高低，线性方程斜率大的对映贝壳杉烯二萜的迈克尔加成反应活性高、抗肿瘤活性更好；以冬凌草甲素为阳性对照药，线性方程斜率大于阳性对照药的对映贝壳杉烯二萜的迈克尔加成反应活性和抗肿瘤活性比阳性对照药更好。
附图说明
图1为240nm波长处对硝基苯甲酰乙酸乙酯与对映贝壳杉烯二萜迈克尔反应体系吸光度随反应时间变化曲线，图中曲线Ⅰ为冬凌草甲素反应体系，曲线Ⅱ为1，14-二乙酰基冬凌草甲素反应体系，曲线Ⅲ为冬凌草乙素反应体系，曲线Ⅳ为1，6-二乙酰基冬凌草乙素反应体系。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但应理解本发明的范围非仅限于这些实施例的范围。
实施例1：
冬凌草甲素、1，14-二乙酰基冬凌草甲素、冬凌草乙素、1，6-二乙酰基冬凌草乙素四个对映贝壳杉烯二萜乙醇溶液制备：分别精密称取上述化合物7.86mg、9.68mg、7.82mg、9.63mg，置于50ml容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，得4.32×10-4 mol/L溶液。
对硝基苯甲酰乙酸乙酯乙醇溶液制备：精密称取对硝基苯甲酰乙酸乙酯5.12mg，置于50ml容量瓶，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，得4.32×10-4 mol/L溶液。
乙醇钠的乙醇溶液制备：精密称取乙醇钠 2.94mg，置于100ml容量瓶，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，得4.32×10-4 mol/L溶液。
迈克尔加成反应溶液制备：在4个10ml试管中均加入对硝基苯甲酰乙酸乙酯乙醇溶液2ml和乙醇钠的乙醇溶液2ml，混匀，放置5min；再分别向每个试管中加入冬凌草甲素、1，14-二乙酰基冬凌草甲素、冬凌草乙素、1，6-二乙酰基冬凌草乙素的乙醇溶液2ml，快速摇匀，得各自的迈克尔加成反应溶液。控制反应温度为21℃，采用紫外可见分光光度计立即进行紫外动力学测试，记录240nm波长处反应体系的吸光度随反应时间变化曲线（见图1）。
数据处理和反应速率计算：以240nm波长处吸光度倒数（1/A）对反应时间（t，单位小时）作图，线性回归，得线性方程和相关系数见表1。线性方程斜率顺序为：冬凌草甲素＞1，14-二乙酰基冬凌草甲素＞冬凌草乙素＞1，6-二乙酰基冬凌草乙素，吸光度相当于浓度，因此迈克尔加成反应速率顺序为：冬凌草甲素＞1，14-二乙酰基冬凌草甲素＞冬凌草乙素＞1，6-二乙酰基冬凌草乙素。其中冬凌草甲素与对硝基苯甲酰乙酸乙酯迈克尔加成反应活性最好。
实施例2
冬凌草甲素、1，14-二乙酰基冬凌草甲素、冬凌草乙素、1，6-二乙酰基冬凌草乙素体外抗肿瘤活性测定。
采用常规MTT法测定了这四个对映贝壳杉烯二萜体外抗肿瘤活性，结果见表2。这四个化合物具有较强的抗肿瘤活性，其中冬凌草甲素活性最好。总体看来，这4个化合物体外抗肿瘤活性为：冬凌草甲素＞1，14-二乙酰基冬凌草甲素＞冬凌草乙素＞1，6-二乙酰基冬凌草乙素。
结合实施例1结果，对映贝壳杉烯二萜的迈克尔加成反应速率顺序为：冬凌草甲素＞1，14-二乙酰基冬凌草甲素＞冬凌草乙素＞1，6-二乙酰基冬凌草乙素。体外抗肿瘤活性为：冬凌草甲素＞1，14-二乙酰基冬凌草甲素＞冬凌草乙素＞1，6-二乙酰基冬凌草乙素。结果表明对映贝壳杉烯的迈克尔加成反应速率越快，其抗肿瘤活性越好。因此，通过测定对映贝壳杉烯与对硝基苯甲酰乙酸乙酯的迈克尔加成反应活性可以快速预测对映贝壳杉烯的抗肿瘤活性高低。