本发明涉及埃德曼降解辅助的蛋白质C-末端肽富集方法，具体地说是一种使用在赖氨酸之后进行酶切的蛋白酶对蛋白样品进行酶解，然后利用埃德曼降解反应，在蛋白质非C-末端肽赖氨酸侧链氨基上选择性标记理化性质改变功能团，然后根据蛋白质C-末端肽和非C-末端肽物理化学性质的差异，选择性吸附蛋白质非C-末端肽，从而对蛋白质C-末端肽进行富集的方法。
背景技术：
蛋白质末端剪切是一种常见并且重要的修饰，形成的末端序列对分子的生物功能具有重要的影响。例如，一些蛋白质前体需要经过蛋白酶剪切去掉信号肽后才能被激活。蛋白质翻译后剪切的位置不同，使得同一个基因表达的蛋白质可能拥有不同的末端，从而导致蛋白质的多态性。对蛋白质末端肽进行鉴定，可以更加准确地实现对蛋白质的定性分析。
目前的蛋白质C-末端肽富集方法，主要依据它与非C-末端肽物理化学性质的不同，将其它肽除去而进行富集。例如Sonomura,K等[1]使用Lys-C将蛋白质进行水解，然后利用金属离子催化的氨基转移反应将多肽的N端氨基转化为羰基，随后将样品与对苯二异硫氰酸基玻璃进行孵育，除去含有赖氨酸的非C-末端肽，富集得到C-末端肽。该方法在对肽段进行衍生时，无法完全控制副反应以及反应完全程度，并且衍生反应影响多肽的分离以及鉴定。Sechi,S.等[2]使用Lys-C对蛋白质进行水解，再利用固定在琼脂糖珠表面的脱水胰蛋白酶特异性吸附C端氨基酸为赖氨酸或者精氨酸多肽的特性去除C-末端肽，从而分离得到C-末端肽。该方法特异性较好，并且保持了C-末端肽的原始状态。然而对非C-末端肽的吸附，必须使用大量的脱水胰蛋白酶对蛋白质样品酶解产物进行处理，成本较高。Xu[3]发展了一种酶联标记方法。使用羧肽酶Y在蛋白质C端标记上亲和标签，酶解后对C-末端肽进行亲和富集。该方法优点是选择性高，缺点是需要严格控制反应条件以避免酶催化的水解反应，导致酶联反应不能在最佳的条件下进行，反应效率较低，因此末端肽富集的回收率低。
(1)Sonomura K,Kuyama H,Matsuo E et al.,The specific isolation of C-terminal peptides of proteins through a transamination reaction and its advantage for introducing functional groups into the peptide,Rapid Communications in Mass Spectrometry,2009,23(5):611-618.
(2)Sechi S,Chait B,A method to define the carboxyl terminal of proteins,Analytical Chemistry,2000,72:3374-3378.
(3)Xu GQ,Shin SBY,Jaffrey SR,ACS Chemical Biology,2011,6(10):1015.
技术实现要素：
蛋白质C-末端肽的富集比较困难。本发明的目的是基于埃德曼降解反应，对蛋白质非C-末端肽赖氨酸侧链氨基进行选择性标记，引起蛋白质C-末端肽和非C-末端肽物理化学性质的不同，然后对蛋白质非C-末端肽进行选择性吸附，从而实现对蛋白质C-末端肽的富集。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
(1)使用包括Lys-C等任意一种在赖氨酸之后进行酶切的蛋白酶对组织、细胞、血浆、标准蛋白等各种来源蛋白样品进行酶解，使产生的蛋白质非C-末端肽的C末端带有一个赖氨酸，而蛋白质C-末端肽不含有赖氨酸。
(2)利用埃德曼降解反应，在蛋白质非C-末端肽上标记带有理化性质改变功能团和异硫氰酸酯功能团的试剂；：酶解后产生的肽段使用带有理化性质改变功能团和异硫氰酸酯功能团的氨基反应试剂进行标记；标记完成后，在强酸性条件下进行埃德曼降解，使肽段的N端第一个氨基酸从肽段上断裂下来。
(3)蛋白质C-末端肽的富集：利用蛋白质非C-末端肽与蛋白质C-末端肽在包括亲水性、疏水性、带电性、亲和性及分子体积中的一种或两种以上化学物理性质上的显著差异，对蛋白质非C-末端肽进行选择性吸附，从而富集得到蛋白质C-末端肽。
发明的蛋白质C-末端肽富集方法可以应用于简单和复杂蛋白质样品C-末端肽的高效和高选择性富集。
本发明具有如下优点：
1.富集选择性高：本发明通过利用埃德曼降解反应，可以实现对蛋白质酶解肽段上赖氨酸侧链氨基的高效高选择性标记，使得蛋白质非C-末端肽和蛋白质C-末端肽的物理化学性质存在显著差异，有利于实现对蛋白质非C-末端肽的选择性吸附，显著提高蛋白质C-末端肽的富集选择性；
附图说明
图1为使用带有理化性质改变功能团的埃德曼降解试剂进行蛋白质C-末端肽富集实验流程图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明提供的方法进行详述，但不以任何形式限制本发明。
实施例1
如图1所示，按如下流程进行蛋白质C-末端肽富集：
1)蛋白质的酶解：提取得到的两份血浆蛋白分别溶解于50mM NaHCO3(pH7.5)，然后在90℃下热变性20min，冷却至室温后还原(10mM DTT，56℃，2h)并烷基化(25mM IAA，室温避光，40min)，随后以酶/蛋白质为1:25的比例加入Lys-C酶解并在37℃水浴中反应16h。
2)蛋白质酶解肽段的埃德曼降解：在碱性条件下(pH＝8.0)，45℃将与蛋白质酶解肽段进行反应，反应时间30分钟。反应混和溶液冷冻干燥后，加入10微升-1毫升无水三氟乙酸，在45℃反应10分钟，将肽段N端氨基酸从肽段上断裂下来。
3)蛋白质C-末端肽的富集：将埃德曼降解后的蛋白质酶解肽段溶液通过C18色谱柱，蛋白质非C末端肽的C端赖氨酸被带有疏水基团的试剂标记，因此吸附在C18色谱柱上被去除，而蛋白质C末端不被吸附从而留在溶液中得到富集。
实施例2
如图1所示，按如下流程进行蛋白质C-末端肽富集：
1)蛋白质的酶解：提取得到的两份血浆蛋白分别溶解于50mM NaHCO3(pH7.5)，然后在90℃下热变性20min，冷却至室温后还原(10mM DTT，56℃，2h)并烷基化(25mM IAA，室温避光，40min)，随后以酶/蛋白质为1:25的比例加入Lys-C酶解并在37℃水浴中反应16h。
2)蛋白质酶解肽段的埃德曼降解：在碱性条件下(pH＝8.0)，45℃将与蛋白质酶解肽段进行反应，反应时间30分钟。反应混和溶液冷冻干燥后，加入10微升-1毫升无水三氟乙酸，在45℃反应10分钟，将肽段N端氨基酸从肽段上断裂下来。
3)蛋白质C-末端肽的富集：将埃德曼降解后的蛋白质酶解肽段溶液通过亲水色谱柱，蛋白质非C末端肽的C端赖氨酸被带有亲水基团的试剂标记，因此吸附在亲水色谱柱上被去除，而蛋白质C末端不被吸附从而留在溶液中得到富集。
实施例3
如图1所示，按如下流程进行蛋白质C-末端肽富集：
1)蛋白质的酶解：提取得到的两份血浆蛋白分别溶解于50mM NaHCO3(pH7.5)，然后在90℃下热变性20min，冷却至室温后还原(10mM DTT，56℃，2h)并烷基化(25mM IAA，室温避光，40min)，随后以酶/蛋白质为1:25的比例加入Lys-C酶解并在37℃水浴中反应16h。
2)蛋白质酶解肽段的埃德曼降解：在碱性条件下(pH＝8.0)，45℃将与蛋白质酶解肽段进行反应，反应时间30分钟。反应混和溶液冷冻干燥后，加入10微升-1毫升无水三氟乙酸，在45℃反应10分钟，将肽段N端氨基酸从肽段上断裂下来。
3)蛋白质C-末端肽的富集：将埃德曼降解后的蛋白质酶解肽段溶液通过阳离子交换色谱柱，蛋白质非C末端肽的C端赖氨酸被带有正电荷基团的试剂 标记，因此吸附在阳离子交换色谱柱上被去除，而蛋白质C末端不被吸附从而留在溶液中得到富集。
实施例4
如图1所示，按如下流程进行蛋白质C-末端肽富集：
1)蛋白质的酶解：提取得到的两份血浆蛋白分别溶解于50mM NaHCO3(pH7.5)，然后在90℃下热变性20min，冷却至室温后还原(10mM DTT，56℃，2h)并烷基化(25mM IAA，室温避光，40min)，随后以酶/蛋白质为1:25的比例加入Lys-C酶解并在37℃水浴中反应16h。
2)蛋白质酶解肽段的埃德曼降解：在碱性条件下(pH＝8.0)，45℃将与蛋白质酶解肽段进行反应，反应时间30分钟。反应混和溶液冷冻干燥后，加入10微升-1毫升无水三氟乙酸，在45℃反应10分钟，将肽段N端氨基酸从肽段上断裂下来。
3)蛋白质C-末端肽的富集：将埃德曼降解后的蛋白质酶解肽段溶液通过阳离子交换色谱柱，蛋白质非C末端肽的C端赖氨酸被带有正电荷基团的试剂标记，因此吸附在阳离子交换色谱柱上被去除，而蛋白质C末端不被吸附从而留在溶液中得到富集。
本发明利用埃德曼降解反应，在蛋白质非C-末端肽上高效高选择性的标记理化性质改变功能团。依据蛋白质非C-末端肽和蛋白质C-末端肽物理化学性质的显著差异，可以对蛋白质非C-末端肽进行选择性吸附，从而显著提高蛋白质C-末端肽的富集选择性。