一种测定土壤硝态氮的方法与流程

本发明涉及土壤中硝态氮的测定，具体的说是一种改进土壤硝态氮的测定方法。

背景技术：

土壤中无机氮可分为水溶态、交换态及固定态等。测定土壤中的铵态、硝态及亚硝态氮素，通常是测定水溶态及交换态两者总量。交换态为可被中性盐溶液交换提取的部分(中性盐溶液为氯化钾或氯化钠)。中性盐溶液与土壤混合、震荡，将土壤吸附的铵态氮交换浸出，其中也包含水溶态。此提取物经过滤，滤液再进行各种形态氮的测定。常用的测定铵态氮方法有蒸馏法和靛酚蓝比色法，然而测定硝态氮的方法却有很多，包括蒸馏法，酚二磺酸法，镉还原法和双波长紫外分光光度法(文献1：鲁如坤，土壤农业化学分析方法，北京：中国农业科技出版社，2000：156-165)。

需要说明的是亚硝态氮也属于交换态氮，在作物生长过程中，作为有效氮肥为作物提供养分，即使其含量及低，不足硝态氮的5％。上述测定土壤硝态氮的方法中测定的值均可含有亚硝态氮。在这里我们所涉及的是测定土壤硝态氮和亚硝态氮总和的方法。

常用的测定硝态氮方法有以下缺点：蒸馏法需要特定装置，能源消耗大，且定氮合金很难磨细过100目筛；酚二磺酸法操作步骤过于繁琐、土壤浸提液水分蒸发时间长、费能源且多种物质存在干扰；镉柱还原法虽然干扰少、精度高，但操作繁琐且镉是高毒性的重金属，易污染环境；双波长紫外分光光度法中测定波长没有统一标准(文献2：涂常青，温欣荣，双波长紫外分光光度法测定土壤硝态氮，土壤肥料，2006(1)：50-51)。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种操作简单，不添加任何试剂，重复性好，重现性高的测定土壤硝态氮的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种测定土壤硝态氮的方法，

1)以2mol/L KCl为溶剂配制浓度为0.1–20mg N/L范围内的6个以上不同浓度的硝态氮溶液，分别用紫外-可见分光光度计在220nm和275nm波长处测定各个所配制溶液吸光度A₂₂₀和A₂₇₅；用A₂₂₀–2×A₂₇₅的计算方法求得吸光度，以硝态氮浓度为横坐标，计算的吸光度值为纵坐标制作标准曲线；

2)土壤浸提液制备：将土壤样品用4倍重量体积(g/ml)的2mol/L KCl溶液振荡浸提1h以上，过滤，得浸提液；

3)将浸提液直接置于紫外-可见分光光度计中测定220nm和270nm吸光度值，用A₂₂₀–2×A₂₇₅的计算方法求得吸光度，通过求得的吸光度于步骤1)制作的标准曲线中查询获得浸提液中硝态氮浓度；

4)将紫外分光光度法法测定值校正成为蒸馏法测定值，公式为y＝1.021x-0.223，其中x为紫外分光光度法的土壤硝态氮浓度测定值，y为蒸馏法的土壤硝态氮浓度测定值。

所述步骤1)配制硝态氮溶液的具体过程为：以2mol/L KCl为溶剂配制浓度为0.1–20mg N/L范围内的6个以上不同浓度的硝态氮溶液，其中包括0.1mg N/L和20mg N/L二个端值浓度的硝态氮溶液，以及大于0.1mg N/L至小于20mg N/L的4个以上不同浓度的硝态氮溶液。

所述步骤1)配制硝态氮溶液的具体过程为：以2mol/L KCl为溶剂配制浓度为0.1–15mg N/L范围内的6个以上不同浓度的硝态氮溶液，其中包括0.1mg N/L和15mg N/L二个端值浓度的硝态氮溶液，以及大于0.1mg N/L至小于15mg N/L的4个以上不同浓度的硝态氮溶液。

所述步骤1)的具体过程为：分别吸取浓度为100mg N/L的硝态氮溶液0.05、0.25、0.5、2.5、5.0、7.5mL于50mL容量瓶中，加入2mol/L KCl至50mL刻度线，摇匀，用紫外-可见分光光度计在220nm和275nm波长处测定吸光度；用A₂₂₀–2×A₂₇₅的计算方法求得吸光度，以硝态氮浓度为横坐标，计算的吸光度值为纵坐标制作标准曲线，标准曲线线性范围为0.1–15mg N/L，标准曲线一般为多项式方程。

所述配制硝态氮溶液采用的溶质为硝酸钾。

具体过程可为：一种测定土壤硝态氮的方法，

1)制作标准曲线：吸取100mg N/L硝态氮溶液(2mol/L KCl配制)0.05，0.25，0.5，2.5，5.0，7.5mL于50mL容量瓶中，加入2mol/L KCl定容，摇匀，用紫外-可见分光光度计在220nm和275nm波长测定吸光度，用A₂₂₀–2×A₂₇₅的计算方法求得吸光度，以硝态氮浓度为横坐标，计算的吸光度值为纵坐标制作标准曲线；

2)土壤浸提液制备：将土壤样品用4倍重量体积(g/ml)的2mol/L KCl溶液振荡浸提1h，过滤，得浸提液；

3)将浸提液直接置于紫外-可见分光光度计中测定220nm和270nm吸光度值，用A₂₂₀–2×A₂₇₅的计算方法求得吸光度，查询标准曲线计算浸提液中硝态氮浓度；

4)将紫外分光光度法法测定值校正成为蒸馏法测定值，公式为y＝1.021x-0.223(R²＝0.9722，n＝20)，其中x为紫外分光光度法法测定值，y为蒸馏法测定值。

使用该方法测定土壤中硝态氮含量，有如下优点：

1.该方法操作简便，步骤少，不用添加任何试剂，直接进行浸提液的紫外吸收测定，人为误差小。

2.该方法省事。原有的蒸馏法或者比色法一天测定硝态氮不超过100个，相同时间内可用该方法测定1000个，效率提高9倍。

3.使用该方法测定的土壤硝态氮浓度与蒸馏法测定值相关性极好(R²＝0.9722，n＝20)，因此可以将测定值校正后与蒸馏法测定铵态氮相结合，建立一套完整、高效、准确的土壤有效态无机氮测定方法体系。

本发明方法重复性好，重现性高，简单易行。

附图说明

图1硝态氮测定标准曲线-1；

图2硝态氮测定标准曲线-2；

图3蒸馏法和紫外分光光度法测定土壤硝态氮结果比对；

图4验证蒸馏法和紫外分光光度法测定硝态氮的相关性。

具体实施方式

实施例1

建立紫外分光光度法测定硝态氮标准曲线

由于土壤浸提液中硝态氮浓度是不经任何操作直接测定，因此硝态氮浓度应 全部落在标准曲线线性范围中，否则测定结果不准确。经计算，当土壤溶液中硝态氮浓度为15mg N/L时，土壤硝态氮含量约为66kg/mg，相当于氮肥施用量158kg N/ha(0-20cm土壤容重为1.2g/cm³)，因此标准曲线中硝态氮最大浓度设置为15m N g/L(如果需要，也可以设置为20mg N/L)，完全可以满足实验需要。

经测定，紫外分光光度法测定硝态氮和亚硝态氮都在220nm处出现较强的吸收峰，因此该方法的测定结果包含了亚硝态氮含量，这与蒸馏法测定的硝态氮和亚硝态氮总和相匹配，成为将该法与蒸馏法相互验证的实验基础。另外，土壤亚硝态氮是土壤硝化作用的中间过程，含量极低，在测定过程中通常忽略不计，因此标准曲线溶液不加入标准亚硝态氮，其吸光度对照硝态氮计算。

具体过程如下：

1)配制硝态氮储备液：准确称取7.216g烘干硝酸钾，加入2mol/L KCl溶解，定容至1L容量瓶中，此溶液含有硝态氮1000mg/L。将此储备液按10倍数稀释，2mol/L KCl定容，得到浓度为100mg N/L的溶液；

2)制作标准曲线：吸取上述硝态氮溶液0.05，0.25，0.5，2.5，5.0，7.5mL于50mL容量瓶中，加入2mol/L KCl至刻度线，摇匀，用紫外-可见分光光度计在220nm和275nm波长处测定吸光度。用A₂₂₀–2×A₂₇₅的计算方法求得吸光度，以硝态氮浓度为横坐标，计算的吸光度值为纵坐标制作标准曲线。结果如图1所示，标准曲线符合多项式方程，R²＝0.998(n＝7)。

实施例2

紫外分光光度法与蒸馏法测定硝态氮浓度比对

具体实施过程：

1)土壤浸提液制备：将土壤样品(共n＝44个土壤样品)分别用4倍重量体积(g/ml)的2mol/L KCl溶液振荡浸提1h，过滤，得浸提液。此浸提样品分成两部分，一部分(共n＝20个土壤样品)用来确定两种方法测定硝态氮浓度的相关性，剩余样品(共n＝24个土壤样品)用于验证该相关性的准确性；

2)制作标准曲线：吸取浓度为100mg N/L的硝态氮溶液0.05，0.25，0.5，2.5，5.0，7.5mL于50mL容量瓶中，加入2mol/L KCl至刻度线，摇匀，用紫外-可见分光光度计在220nm和275nm波长处测定吸光度。用A₂₂₀–2×A₂₇₅的计算方法求得吸光度，以硝态氮浓度为横坐标，计算的吸光度值为纵坐标制作标准曲线(图2)；标准曲线一般为多项式方程；

3)紫外分光光度法测定浸提液中硝态氮浓度：将步骤1)中浸提液(共n＝20个土壤样品)分别直接置于紫外-可见分光光度计中测定220nm和270nm吸光度值A₂₂₀和A₂₇₅，用A₂₂₀–2×A₂₇₅的计算方法求得吸光度，查询上述标准曲线计算浸提液中硝态氮浓度；

4)蒸馏法测定浸提液中硝态氮浓度：分别取上述测定步骤3)同样的浸提液(共n＝20个土壤样品)50mL于蒸馏瓶中，同时于一蒸馏瓶中做空白组(内装有50mL 2mol/L KCl溶液)进行对照，分别加入1g氧化镁，置于蒸馏装置中，立即分别向浸提液和空白组中通入水蒸汽进行加热蒸馏，至冷凝管下端接收馏出液的三角瓶中馏出液体积达100mL时，终止蒸馏，移去接收馏出液的三角瓶，此步骤目的为去除铵态氮。将接收馏出液的三角瓶换成一个盛有15mL重量浓度为2％的硼酸加一滴(0.05mL)混合指示剂(0.066g甲基红和0.099g溴甲酚绿用体积浓度95％乙醇定容至100ml)的接收瓶于冷凝管下端，继续分别向蒸馏瓶中加入0.2g定氮合金(合金组成：Cu 50％，Al 45％，Zn 5％)，继续分别向蒸馏 瓶中通入水蒸汽进行蒸馏，至接收瓶中的馏出液体积达100mL时，终止蒸馏，移去接收瓶。用0.003mol·L^-1硫酸标准溶液进行滴定，当溶液由灰色中显现红色时即为滴定终点。根据样品消耗的硫酸量计算硝态氮含量(文献1：鲁如坤，土壤农业化学分析方法，北京：中国农业科技出版社，2000：156-165)；

测定结果见图3，随机选取的土壤浸提液硝态氮浓度变异较大，范围从0.1-3.7mg/L，代表性强。两种方法的相关系数R＝0.986，说明两种方法的相关性较好，可以用紫外分光光度法取代繁琐的蒸馏法，用于测定土壤硝态氮含量。

5)取剩下的24个土壤浸提液，按照上述3)-4)步骤所述，使用两种方法对其硝态氮浓度进行测定，并将紫外分光光度法测定结果按照公式y＝1.021x-0.223校正，所得结果与蒸馏法测定结果进行比对，结果如图4所示。结果表明两种方法相关性极好，特别是浓度很低的样品，测定结果依然很吻合，说明操作简单的紫外分光光度法完全可以取代操作繁琐的蒸馏法，成为测定土壤硝态氮的重要方法。