菲牛蛭冻干粉的挥发性成分的检测方法与流程

本发明属于检测领域，具体涉及一种菲牛蛭冻干粉的挥发性成分的检测方法。

背景技术：

菲牛蛭(poecilobdellamanillensislesson)，俗称金边蚂蟥，隶属于无吻蛭目、医蛭科、牛蛭属，主要分布于广西、广东、海南和福建等省区，具有显著的抗凝血、抗血栓、溶栓、抗血小板聚集活性，主要化学成分为脂肪酸、氨基酸和蛋白质等。

菲牛蛭冻干粉为医蛭科动物菲牛蛭的新鲜全体的加工炮制品，其主要功效为破血通经、逐瘀消癥，现代临床多用于高血压、高血脂、脑溢血、脑血栓等心脑血管疾病的治疗。菲牛蛭冻干粉是由现代低温冷冻方式加工而成，有强烈的腥味。

挥发性成分是菲牛蛭及其冻干粉的重要组成部分，包含了大量腥味成分以及有效成分，准确检测菲牛蛭及其冻干粉的挥发性成分，对菲牛蛭有效成分的研究，以及腥味物质的去除、检测和评价有重要意义。

目前，未见菲牛蛭冻干粉挥发性成分的检测方法。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种检测菲牛蛭冻干粉挥发性成分的方法。

本发明检测菲牛蛭冻干粉挥发性成分的方法，它包括如下步骤：

(1)制备供试品：取菲牛蛭冻干粉，用乙酸乙酯提取，制成供试品；

(2)检测：采用气相色谱-质谱法检测。

气相色谱-质谱法：气相色谱和质谱联用的方法。

步骤(1)中，所述乙酸乙酯的使用量为菲牛蛭冻干粉的20倍v/w。

步骤(1)中，所述提取的方法为冷浸法回流提取法或超声提取法。

优选地，所述冷浸法的时间为24h。

优选地，所述回流提取的时间为24h。

优选地，所述超声提取的功率为500w，时间为0.5h。

步骤(1)中，所述在氮气环境中干燥是氮气吹干。

步骤(2)中，气相色谱-质谱检测时，气相色谱的条件为：起始温度为70℃，保持1min，之后以10℃/min的速率升高到250℃，保持10min。进一步优选地，气相色谱法采用的条件为：不分流模式；载气：高纯氦气 (99.999％)，流速：1ml/min。

步骤(2)中，气相色谱-质谱法检测时，质谱的条件为：ei离子源，离子源温度为200℃，电离电压为70ev；四级杆温度：200℃，传输线温度250℃，溶剂延迟：4min；采用全扫描模式，质量范围为40～400。

本发明检测方法可以有效分离提取并检测菲牛蛭冻干粉的挥发性成分，准确度高，可以为菲牛蛭冻干粉的脱腥以及有效成分的研究提供理论支持，应用前景良好。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1本发明检测方法的总离子流图

图2本发明检测方法的总离子流图

图3本发明检测方法的总离子流图

图4本发明检测方法的总离子流图

图5本发明检测方法检测脱腥前后的取菲牛蛭冻干粉的总离子流图

图6对比实施例总离子流图

图7对比实施例总离子流图

图8对比实施例总离子流图

图9对比实施例总离子流图

具体实施方式

实验试剂与仪器如下：

实验材料

菲牛蛭冻干粉(云南海瑞迪生物药业有限公司提供)，于4～8℃保存。

仪器与试药

主要仪器

主要试剂

实施例1本发明检测菲牛蛭冻干粉挥发性成分的方法

一、检测方法

1、制备供试品

取菲牛蛭冻干粉1g，加入乙酸乙酯20ml，冷浸24h，离心10min，取上清液；取上清液10ml，氮气吹干后用乙酸乙酯定容到1ml，过滤后作为样品，进样分析。

2、采用gc-ms(气相色谱-质谱法)检测

气相色谱条件：不分流模式；载气：高纯氦气(99.999％)，流速：1ml/min；起始温度为70℃，保持1min，之后以10℃/min的速率升高到250℃，保持10min。

色谱柱：agilenthp-5ms毛细管柱(30m×250μm×0.25μm)，填料为5％-苯基。

质谱条件：ei离子源，离子源温度为200℃，电离电压为70ev。四级杆温度：200℃，传输线温度250℃，溶剂延迟：4min。采用全扫描模式，质量范围为40～400。

二、检测结果

总离子流图如图1所示。由图1可以看出，采用本发明方法检测的丰度高，可以检测出大量挥发性成分，且分离效果好。

实施例2本发明检测菲牛蛭冻干粉挥发性成分的方法

一、检测方法

1、制备供试品

取菲牛蛭冻干粉1g，加入乙酸乙酯20ml，回流提取24h，离心10min，取上清液；取上清液10ml，氮气吹干后用乙酸乙酯定容到1ml，过滤后作为样品，进样分析。

2、采用gc-ms(气相色谱-质谱法)检测

同实施例1。

二、检测结果

总离子流图如图2所示。由图2可以看出，采用本发明方法检测的丰度高，可以检测出大量挥发性成分，且分离效果好。

实施例3本发明检测菲牛蛭冻干粉挥发性成分的方法

一、检测方法

1、制备供试品

取菲牛蛭冻干粉1g，加入乙酸乙酯20ml，超声提取0.5h(功率为500w)， 离心10min，取上清液；取上清液，氮气吹干后用乙酸乙酯定容到1ml，过滤后作为样品，进样分析。

2、采用gc-ms(气相色谱-质谱法)检测

同实施例1。

二、检测结果

总离子流图如图3所示。由图3可以看出，采用本发明方法检测的丰度高，可以检测出大量挥发性成分，且分离效果好。

将图1、2、3比较可以看出，采用实施例1～3检测方法检测菲牛蛭冻干粉的挥发性成分，丰度均比较高，总峰面积大，而且分离度好，其中，实施例1检测方法的丰度最高，总峰面积最大，为最优选的实施例。

以下用试验例的方式来证明本发明的有益效果

试验例1本发明检测菲牛蛭冻干粉挥发性成分的方法

1、试验方法

取未经处理的菲牛蛭冻干粉(云南海瑞迪生物药业有限公司提供批号c04-15020701)，按照实施例1的方法检测。

2、试验结果

菲牛蛭冻干粉总离子流图如图4所示。由图4可以看出，采用本发明方法检测的丰度高，可以检测出大量挥发性成分，且分离效果好。

根据图4，通过面积归一化法计算出各种化合物的相对含量，结果如下表1所示：

表1菲牛蛭冻干粉挥发性物质

由表1可知，菲牛蛭冻干粉中的挥发性物质主要包括碳氢化合物类、醛类、酯类、酸类等化合物。在检出的45种化合物中，含量最高的酸类化合物，占总体的48.34％，其次为碳氢化合物(23.93％)，酯类(20.27％)、醛类(0.75％)、其他类(6.71％)。含量高的化合物为棕榈酸(18.64％)，其次为邻苯二甲酸二正辛酯(13.1％)、硬脂酸(12.4％)、油酸(7.4％)、11-丁基-二十二烷(5.38％)、9-辛基-二十七烷(4.6％)、肉豆蔻酸(2.76)等。

根据表1可以看出，本发明方法的确可以同时检测出菲牛蛭冻干粉中的大量挥发性成分，且分离效果好，丰度高，检测结果准确。

试验结果说明，本发明方法可以有效分离提取并检测菲牛蛭冻干粉的挥发性成分。

试验例2本发明检测菲牛蛭冻干粉挥发性成分的方法

1、试验方法

取未经处理的菲牛蛭冻干粉(云南海瑞迪生物药业有限公司提供，批号c04-15020701)，分为两份，一份不做处理，一份采用红花提取液和环状糊精 溶液除腥。

红花提取液和环状糊精溶液除腥的方法如下：

a.称取5g红花药材，加20倍量的60％v/v乙醇回流提取，提取1h，提取液挥去乙醇，冷却过滤，得红花提取物；

b.称取21g环糊精，溶解，得环糊精溶液；

c.将红花提取物与环糊精溶液混合。

d.取步骤c的混合溶液与80g菲牛蛭冻干粉混合均匀，50℃水浴1h，烘干、粉碎，即可。

分别按照实施例1的方法检测。

2、试验结果

菲牛蛭冻干粉总离子流图如图5所示。由图5可以看出，无论是处理前还是处理后的菲牛蛭冻干粉，采用本发明检测方法检测的丰度高，可以检测出大量挥发性成分，且分离效果好。

根据图5，通过面积归一化法计算出各种化合物的相对含量，结果如下表2所示：

表2菲牛蛭冻干粉挥发性物质

由图5和表2可知，与脱腥前相比其中，峰面积显著降低的组分有壬醛、戊酸、肉豆蔻酸、正十五酸、棕榈酸、亚油酸、硬脂酸、3-羟基十八烷酸甲酯、邻苯二甲酸二正辛酯，包括1种醛、6种酸和2种酯。

根据表1可以看出，无论是否经过脱腥处理，本发明方法的确可以同时检测出菲牛蛭冻干粉中的大量挥发性成分，且分离效果好，而且检测到脱腥去除的物质为壬醛等腥味物质，说明本发明方法的确可以准确、有效地检测菲牛蛭冻干粉中的挥发性成分。

试验结果说明，本发明方法可以有效分离提取并检测菲牛蛭冻干粉的挥发性成分，准确度高。

对比例1

1、实验方法

除了提取步骤中，采用石油醚代替乙酸乙酯提取以外，其余条件同实施例1。

二、检测结果

总离子流图如图6所示。由图6可以看出，采用石油醚代替乙酸乙酯后，检测的丰度低，且分离效果差。

对比例2

1、实验方法

除了提取步骤中，采用二氯甲烷代替乙酸乙酯提取以外，其余条件同实施例1。

二、检测结果

总离子流图如图7所示。由图7可以看出，采用二氯甲烷代替乙酸乙酯后，检测的物质种类太少，无法有效检测。

对比例3

1、实验方法

除了提取步骤中，采用正己烷代替乙酸乙酯提取以外，其余条件同实施例1。

二、检测结果

总离子流图如图8所示。由图8可以看出，采用正己烷代替乙酸乙酯后，分离效果差，无法有效检测。

对比例4

1、实验方法

除了检测步骤中，气相色谱的升温速率为8℃/min，其余条件同实施例1。

二、检测结果

总离子流图如图9所示。由图9可以看出，气相色谱的升温速率为8℃/min时，分离效果差，无法有效检测。

综上，本发明检测方法在特定提取和气相色谱、质谱配合下，可以有效分离提取并检测菲牛蛭冻干粉的挥发性成分，准确度高，而改变提取方法或者气相色谱的条件，则无法有效检测。