元荧光团的触发组装的制作方法
相关申请
本申请根据35u.s.c.§119(e)要求2014年12月16日提交的美国临时申请号62/092,452的权益，其全部内容通过引用并入本文。
联邦资助的研究
本发明是在国家卫生研究院授予的基金号1dp2od007292-01、1r01eb018659-01和5r21hd072481-02、国家科学基金会授予的基金号ccf-1317291、国防部海军研究所授予的基金号n00014-11-1-0914和n00014-14-1-0610下由政府支持完成的。政府对发明有一定的权利。
背景
荧光显微镜允许单个分子水平的特异性靶检测，并已成为生物研究中宝贵的工具。为了将生物学信息转化为可以成像的信号，已经开发了各种荧光探针，例如具有不同颜色的有机染料或荧光蛋白。尽管取得了成功，但是目前的探针有一些限制，包括缺乏可编程性。
概述
本文提供了具有可调(例如，数字可调)性质(例如可调的颜色和亮度)的可编程脱氧核糖核酸(dna)基荧光探针。本公开内容的方法使用结构核酸(例如，dna)纳米技术用于产生在本文中称为“元荧光团(metafluorophore)”的亚衍射探针，其可在一些实施方案中被触发以在靶分子上组装。
因此，本公开内容的一些方面提供了包含与第一染料分子连接的核酸捕获链、比捕获链长的核酸触发链和部分双链的核酸的系统(或试剂盒)，所述核酸触发链包含(a)与捕获互补的捕获结构域链和(b)各自包含两个子结构域的至少两个串联结构域，所述部分双链的核酸包含具有与串联结构域的两个子结构域中的一个子结构域互补的核苷酸序列的单链支点结构域(toeholddomain)、与第二染料分子连接并且具有与串联结构域的两个子结构域中的另一个互补的核苷酸序列的双链区域以及具有与单链支点结构域互补的核苷酸序列的单链发夹环。
本公开内容的一些方面提供了包含至少两个光物理上不同的染料分子子集的核酸纳米结构(元荧光团)，其中单个光物理上不同的染料分子子集之间的距离大于染料分子自身淬灭的距离，并且任何一对染料分子之间的距离，来自一个光物理上不同子集的一个染料分子和来自另一个光物理上不同子集的另一个染料分子之间的距离，至少是该对染料的
本公开内容的一些方面提供了多个核酸纳米结构(元荧光团)，每个纳米结构包含染料分子的独特集合，其中每个集合的染料分子包括至少两个光物理上不同的染料分子子集，其中单个光物理上不同的染料分子子集之间的距离大于染料分子自身淬灭的距离，并且任何一对染料分子之间的距离，来自一个光物理上不同子集的一个染料分子和来自另一个光物理上不同子集的另一个染料分子之间的距离，至少是该对染料的
在一些实施方案中，核酸纳米结构具有非重叠的强度分布。
本公开内容的一些方面提供本文提供的多个核酸纳米结构中的任何一个的核酸纳米结构的子集，其中该子集的每个纳米结构包含至少三个光物理上不同的染料分子子集，每个光物理上不同的染料分子子集具有不同数量的染料分子，并且该子集的核酸纳米结构的强度分布是不重叠的。
在一些实施方案中，单个光物理上不同的子集的任何一对染料分子之间的距离为至少5nm。例如，单个光物理上不同的子集的任何一对染料分子之间的距离可以至少为10nm。在一些实施方案中，单个光物理上不同的子集的任何一对染料分子之间的距离为5nm至100nm(例如，5-90nm，5-80nm，5-70nm，5-60nm，5-50nm，5-40nm，5-30nm，5-20nm，10-90nm，10-80nm，10-70nm或10-60nm)。在一些实施方案中，单个光物理上不同的子集的任何一对染料分子之间的距离可以是10nm至50nm(例如，10-40nm，10-30nm或10-20nm)。在一些实施方案中，单个光物理上不同的子集的任何一对染料分子之间的距离可以是5nm，10nm，15nm，20nm，25nm，30nm，35nm，40nm，45nm，50nm，55nm，60nm，65nm，70nm，75nm，80nm，85nm，90nm，95nm或100nm。在一些实施方案中，单个光物理不同子集的任何一对染料分子之间的距离不大于核酸纳米结构的长度、宽度或高度。
在一些实施方案中，任何一对染料分子之间的距离，来自一个光物理上不同子集的一个染料分子和来自另一个光物理上不同子集的另一个染料分子之间的距离，为至少10nm。例如，任何一对染料分子之间的距离，来自一个光物理上不同子集的一个染料分子和来自另一个光物理上不同子集的另一个染料分子之间的距离，可以为至少15nm。在一些实施方案中，任何一对染料分子之间的距离，来自一个光物理上不同子集的一个染料分子和来自另一个光物理上不同子集的另一个染料分子之间的距离，为10nm至100nm(例如，10-90nm，10-80nm，10-80nm，10-60nm，10-50nm，10-40nm，10-30nm或10-20nm)。在一些实施方案中，任何一对染料分子之间的距离，来自一个光物理上不同子集的一个染料分子和来自另一个光物理上不同子集的另一个染料分子之间的距离，可以是25nm至50nm。在一些实施方案中，任何一对染料分子之间的距离，来自一个光物理上不同子集的一个染料分子和来自另一个光物理上不同子集的另一个染料分子之间的距离，为10nm，15nm，20nm，25nm，30nm，35nm，40nm，45nm，50nm，55nm，60nm，65nm，70nm，75nm，80nm，85nm，90nm，95nm或100nm。
在一些实施方案中，核酸纳米结构具有小于200nm的尺寸。例如，核酸纳米结构可以具有小于150nm的尺寸。
在一些实施方案中，每个光物理不同的子集的染料分子间接附着于纳米结构的核酸。
在一些实施方案中，每个光物理上不同的染料分子子集通过至少一个单链核酸间接附着于纳米结构的核酸。
在一些实施方案中，该至少一个单链核酸为15至100(例如，15-90,15-80,15-70,15-60,15-50,15-40,15-30,20-200,20-90,20-80,20-70,20-60,20-50,20-40,30-100,30-90,30-80,30-70,30-60或30-50)个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，单个光物理上不同的染料分子子集在纳米结构的限定区域内分组在一起。
在一些实施方案中，核酸纳米结构包含至少三个光物理上不同的染料分子子集。例如，核酸纳米结构可以包含三到十个(例如，3,4,5,6,7,8,9或10个)光物理上不同的染料分子子集。
在一些实施方案中，光物理上不同的染料分子子集是光谱上不同的染料分子子集。
在一些实施方案中，光物理上不同的染料分子子集相对于彼此具有不同的漂白动力学。例如，一个子集可以以比另一个子集漂白的速率快至少10％(例如，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％)的速率漂白。
在一些实施方案中，光物理上不同的染料分子子集相对于彼此具有不同的可光切换性质。在一些实施方案中，光物理上不同的染料分子子集在不同的缓冲条件下表现不同，具有不同的荧光寿命和/或具有不同的量子产率。
本公开内容的一些方面提供了包含至少两个光谱上不同的染料分子子集的核酸纳米结构，其中至少一个子集包括供体染料分子(例如，图19a，cy3)，并且至少一个子集包含受体染料分子(例如，图19a，alexa647)，并且其中任何一对供体和受体染料分子之间的距离在该对之间发生
在一些实施方案中，纳米结构包含至少三个光谱上不同的染料分子子集，其中至少一个子集包括供体染料分子，并且至少两个子集包括受体染料分子，并且其中任何一对供体和受体染料分子之间的距离在该对之间发生
在一些实施方案中，供体染料分子靠近至少两个受体染料分子，使得供体染料分子和每个受体染料分子之间的距离在供体染料分子和每个受体染料分子之间发生fret的距离之内。
在一些实施方案中，所述至少两个受体染料分子具有相同的子集。在一些实施方案中，所述至少两个受体染料分子具有不同的子集(例如，每个子集彼此光谱上不同)。
本公开内容的一些方面提供了包含至少三个光物理上不同的染料分子子集的核酸纳米结构，其中光物理上不同的染料分子子集中的至少两个在光谱上重叠，并且其中任何一对染料分子之间的距离，来自一个光谱上不同子集的一个染料分子和来自另一个光谱上不同子集的另一个染料分子之间的距离，在发生
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的光谱上不同子集的一个受体染料(例如alexa647r1-cy3g1^r2-g1)。
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的光谱上不同子集的几个受体染料(例如，r1-g1-r1^r2-g1-r1)。
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的任何光谱上不同子集的几个受体染料(例如，r1-g1-r2)。
本公开内容的一些方面提供了包含至少三个光物理上不同的染料分子子集的核酸纳米结构，其中任何一对染料分子之间的距离，来自一个光谱上不同子集的一个染料分子和来自另一个光谱上不同子集的另一个染料分子之间的距离，在发生
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的光物理上不同子集的一个受体染料(例如r1-g1^r2-g1^r1-b1^r2-b1)。
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的光物理上不同子集的几个受体染料(例如，r1-g1-r1^r2-g1-r2^r1-b1-r1^r2-b1r2)。
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的任何光物理上不同子集的几个受体染料(例如，r1-g1-r2^r1-b1-r2)。
本文还提供多个(例如至少两个)核酸纳米结构，每个纳米结构包含染料分子的独特集合。
在一些实施方案中，本公开内容的核酸纳米结构与与核酸靶的第一区域互补的第一单链寡核苷酸连接(参见例如图22a)。在一些实施方案中，第一单链寡核苷酸与核酸靶的第一区域结合(杂交)。
在一些实施方案中，核酸靶包含与第二单链寡核苷酸互补并与之结合的第二区域，其中第二单链寡核苷酸附着于底物。在一些实施方案中，第二单链寡核苷酸被生物素化。在一些实施方案中，表面被涂覆在链霉抗生物素蛋白中，并且第二生物素化的单链寡核苷酸经由生物素-链霉抗生物素蛋白结合相互作用连接到基底上。在一些实施方案中，基底是玻璃或塑料基底。本发明包括将单链寡核苷酸连接到基底表面的其它方法(例如，经由其它配体-配体结合相互作用或经由其它连接体分子)。在一些实施方案中，第一或第二单链寡核苷酸具有10-50，15-50，20-30，20-40或20-50个核苷酸或更长的长度。
本文提供了在基底的表面上包含多个生物素化的单链寡核苷酸的基底，其中至少一些生物素化的单链寡核苷酸与靶核酸的区域互补并结合，并且其中核酸纳米结构的第一单链寡核苷酸与靶核酸的另一区域互补并结合(参见例如图22a和22b)。
本文还提供了定量核酸靶的方法，其包括(a)将靶核酸施加于在基底表面上包含多个生物素化的单链寡核苷酸的基底，其中靶核酸包含第一和第二区域，并且其中所述生物素化的单链寡核苷酸与所述靶核酸的第二区域互补；(b)在导致核酸纳米结构与核酸靶结合的条件下，向(a)的基底施加多个核酸纳米结构；和(c)定量(例如，成像)与核酸靶结合的核酸纳米结构。
附图说明
图1a-1g显示了本公开内容的基于dna的元荧光团的实例。图1a示出了基于dna折纸的元荧光团的标记图案的实例的示意图。圆柱体代表dna双螺旋。选择的链在3'末端延伸有21个核苷酸(nt)“柄”，其结合互补的荧光标记的“抗柄”(“柄”和“抗柄”是指互补寡核苷酸(彼此结合的寡核苷酸))。标记图案表示为象形图，其中每个彩色点表示染料标记的柄。图1b-1d显示荧光强度随着连接到元荧光团的染料数量(例如每个结构为132个染料)而线性增加。插图显示了元荧光团的衍射极限荧光图像和相应的标记图案(图像尺寸：1.2×1.2μm2)。图1e-1g表明，元荧光团允许在不无自淬灭的情况下的致密标记(例如约5nm染料与染料的距离)。象形图例示14种染料的致密和稀疏标记图案。两种图案的相应强度分布对于每种颜色重叠，显示强度没有显著变化。
图2a-2f显示了多色元荧光团的实例。图2a-2c显示当用光谱上不同的染料标记时，由于
图3a-3g示出了用于强度条形码化的元荧光团的例子。图3a显示了atto488(从左至右，每个结构6个染料分子，每个结构14个染料分子，每个结构27个染料分子，每个结构44个染料分子)的强度分布。可以通过精确控制每个元荧光团结构的染料分子的数量来实现非重叠的强度分布。图3b显示了沉积在玻璃表面上的124个不同的元荧光团的荧光图像(比率尺：5μm)。图3c示出了124个不同的元荧光团的代表性荧光图像的矩阵。图3d在一个样品中显示了124个基于元荧光团的强度条形码。共记录了5,139个条形码，检测到所有124个条形码类型。图3e显示了124个条形码中的25个的子集。记录了2,155个条形码-86.5％是合格的条形码，其中87.4％是期望的条形码。图3f显示了64个条形码中的12个的子集。所有条形码都有三种荧光团种类，使其检测更加鲁棒。记录了521个条形码-92.5％是合格的，其中95.4％是期望的条形码。图3g显示了20个条形码中的5个的子集。记录了个条形码-100％是合格的，其中99.6％是期望的条形码。
图4a-4c显示元荧光团的触发组装。图4a显示了由十个亚稳定的cy3标记的dna发夹链构成的三角形元荧光团的触发组装示意图。核酸“捕获链”(用alexa647标记)通过生物素-链霉抗生物素蛋白偶联连接到玻璃表面。较长的“触发链”可以与捕获链杂交。触发链包含四个串联结构域“1-a”，其中子结构域“1”长度为20个核苷酸，子结构域“a”长度为12个核苷酸。发夹链在没有触发链的情况下共同亚稳定地存在，并且仅在暴露于触发链时才组装成所需的结构。例如，引入重复单链触发链引发动力学捕获的荧光发夹单体的组装，其产生第二排结合位点。这些结合位点进一步使得能够组装单体的连续排，每排比前一排含有少一个单体。在将10个发夹(用cy3标记))组装到单触发链之后，不再显示另外的触发序列并终止组装，产生具有固定尺寸的三角形的元荧光团。图4b示出了在玻璃表面上原位组装的三角形的荧光图像。捕获链用alexa647标记，发夹用cy3标记。将具有10个cy3和44个atto488染料分子的dna折纸作为强度参照添加到样品中。可以在atto488和cy3信号共同定位的位置识别dna折纸结构。在叠加荧光图像下面的示意图中，一个暗点表示atto488标记的折纸标记物，较浅的灰点表示alexa647标记的捕获链和由cy3标记的发夹单体组成的三角形的预期重叠。灰色“x”符号表示发夹与表面的非特异性结合。图4c显示三角形的元荧光团(浅灰色)和参照dna折纸(深灰色)的强度分布是重叠的，表明三角形的形成。
图5显示了cadnanodna折纸设计。圆形dna支架(浅灰色)被布置在水平环中以形成24个平行的螺旋。订书钉链(灰色)连接支架的部分并形成矩形。8条链在5'端(中等灰色)被生物素化。灰色订书钉链的大多数3'和5'端位于相同的dna折纸面上。然而，生物素和染料官能化旨在在相对的面上突出。在相邻订书钉的帮助下，中灰色订书钉被移动一个螺旋。这将3'和5'端切换到相对的面。黑色十字形定义了碱基跳过，这是防止dna折纸扭曲所必需的。
图6a-6k显示了单色元荧光团(6-132)的dna折纸订书钉布局的实例的示意图。六角形代表所有176个订书钉的3'端，与图5相比较。深灰色的形状代表生物素化的订书钉链，其突出在相对的面上。黑色六边形表示具有3'柄延伸的订书钉(见表2)。对于atto647n，cy3和atto488，图案是相同的。图6a不是功能化结构，对应于cadnano布局。图6b显示连接的6个染料分子，图6c显示连接的12个染料分子，图6d显示连接的18个染料分子，图6e显示连接的24个染料分子，图6f显示连接的30个染料分子，图6g显示连接的54染料分子，图6h显示了连接的72个染料分子，图6i显示了连接的84个染料分子，图6j显示连接的108个染料分子，图6k显示连接的132个染料分子。
图7a-7c显示了强度与每个dna折纸结构的染料数量的线性依赖性(经校准的)。每个dna折纸6至132个染料，对于atto647n(图7a)，cy3(图7b)和atto488(图7c)，强度线性变化。研究的样品与图1中的样品相同，然而，样品含有感兴趣的结构和具有显著不同染料计数的另外的第二个dna折纸作为参照。这允许比较和校准测量的强度，从而减少样品间的变化。图1中的相应数据未校准。
图8a-8c显示6至132个染料分子的强度分布。数据对应于图7，其中绘制了分布的平均值和标准偏差。图8a示出了atto647n。图8b示出了cy3。图8c显示了atto488。研究的样品包含感兴趣的结构和具有显著不同的染料分子计数的第二个dna折纸作为参照。参照强度分布未显示。
图9a-9c示出了激发功率变化数据。使用zeisscolibriled光源测量所有基于dna折纸的元荧光团记录。测量的30染料元荧光团的强度与atto647n(图9a)，cy3(图9b)和atto488(图9c)的施加的激发强度成线性关系。每个数据点评估超过12,000个元荧光团。相机整合时间为10秒。本研究的所有后续测量均为60％。
图10a-10c显示积分时间变化数据。使用hamamatsuorcaflash4.0scmos相机测量所有基于dna折纸的元荧光团记录。每个记录的积分时间从2秒变化到10秒，并且对于atto647n(图10a)，cy3(图10b)和atto488(图10c)在60％激发强度显示30染料元荧光团的强度的线性增加。每个数据点评估超过12,000个元荧光团。本研究中的所有后续测量均以10s积分时间进行。
图11a-11c显示重新聚焦性能数据。虽然重复聚焦尝试可能导致在不同焦平面上的成像，但是不同的焦平面可能产生单个靶的不同强度。将含有基于dna折纸的具有30个染料的元荧光团的相同样品成像并重新聚焦5次用于atto647n(图11a)，cy3(图11b)和atto488(图11c)。图被标准化至平均值(彩色线)。
图12a-12c显示光稳定性数据。相同区域的重复记录导致染料的光漂白。测得的强度呈指数下降。对于atto647n(-0.77％，图12a)，cy3(-1.37％，图12b)和atto488(-2.80％，图12c)在30染料dna折纸元荧光团上以60个激发功率和10秒的积分时间进行测量。
图13a-13f显示了自淬灭研究中使用的dna折纸订书钉布局的示例的示意图。图13a-13c显示了对于atto647n(图13a)，cy3(图13b)和atto488(图13c)，具有～15nm染料间距离的dna折纸上的稀疏染料图案化。图13d-13f显示了对于atto647n(图13d)，cy3(图13e)和atto488(图13f)，有～5nm染料间距离的dna折纸上的致密染料图案。
图14a-14h示出了fret研究染料图案化(随机和逐列)的示例。图14a-14d显示了混合染料图案，对应于图2a-2c。图14e-14h显示了色间距>10nm的逐列染料图案，对应于图2d-2f。
图15a-15d示出了强度条形码染料图案的示例。逐列染料图案将不同的染料分开>10nm，从而防止fret。图15a显示每种颜色附着的6种染料，图15b显示每种颜色附着的14种染料，图15c显示每种颜色附着的27种染料，图15d显示每种颜色附着的44种染料。这些布局用于独立控制条形码研究中所有三种颜色的亮度水平。
图16a-16c显示25/124条形码研究的强度分布。25种不同的元荧光团的示例性强度分布对于atto647n(图16a)，cy3(图16b)和atto488(图16c)在一个样品中组合。四个水平(对于于6、14、27和44个染料分子)是明显可区分的。鉴定了峰之间的重叠区域(参见方法和材料)，显示相应强度的条形码被分类为不合格。
图17显示了触发组装形成凝胶测定法。详见方法和材料。捕获链(cap)用alexa647标记(泳道1，参照)，发夹(hp)用cy3标记标记(泳道3，参照)。触发链(t)未标记。泳道1(1pmolcap)和3(12pmol)作为cap和hp迁移速度的参照。泳道4-7显示在30℃下进行的反应和泳道8-11显示在24℃下进行的反应(各为1pmolcap)。对照泳道7和11缺少(t)链，从而抑制三角形的形成。泳道只显示cap和hp带，与参照带一致。泳道5和9中的组装反应相对于cap链具有12倍过量的hp链(相对于t为10.9)，并且形成三角形(每个三角形10个hp)，如通过比参照带较慢迁移的强条带所表示的。cap参照带的存在表明并非所有的cap链都形成三角形。由于hp链相对于三角形具有轻微的化学计量过量，因此注意到弱的hp带。泳道6和10含有较高hp过量的反应。产物带看起来比泳道5和9中的产物带稍慢迁移，表明只有略微增加的三角形尺寸。泳道4和8中的反应具有不足的hp以完全组装三角形(10条链中的<5)。泳道显示比相应的12x和20x泳道更快的产物带，表示仅部分组装的三角形。cy3hp带非常弱，表明hp链的完全使用。
图18a显示可以通过改变dna纳米结构上的荧光团的量来实现几种强度水平。图18b显示了具有光谱上不同染料和不同强度水平的纳米结构的组合标记。纳米结构中的每个区域可以配备不同量的荧光团，因此具有不同的强度水平。图18c示出了相同颜色的不同荧光团表现出不同的染料稳定性，并且可以通过它们的漂白特征来鉴定。图18d显示了具有光谱上不同染料和不同染料稳定性的纳米结构的组合标记。组合的可能性增加。
图19a示出了紧密接近的fret对将显示供体的强度损失。如果受体随着时间的推移漂白，供体的强度将相应增加。根据fret对的数量，强度标志将会有所不同。图19b示出了多种颜色的使用将增加组合的可能性。图19c示出了通过平均受体邻近物与fret供体的交替，可以“延迟”fret增加。
图20a显示了通过dna/rna靶的存在特异性二聚化的两个条形码。条形码带有与靶的部分互补的柄。图20b显示了靶可以打开dna发夹，其进而可以进行二聚化。图20c示出了一个条形码可能是足够的，并且仅需要第二个组件以报告二聚化。图20d显示辅助链可以是单体之一的一部分。
图21a显示了由两个光谱上不不同的元荧光团组成的样品的时间推移荧光显微照片：一个含有44个atto647n染料(更光稳定的)和一个含有44个alexa647染料(较不光稳定的)。在t1＝0s，t2＝20s，t3＝40s，积分时间为10s时采集图像，而采集期间样品持续照明(即总照明时间为60s)。时间推移显微照片显示了两种物质，其中一种比另一种更快漂白。可以通过叠加在t1和t3拍摄的图像来目视识别这两种物质。含有更多的光稳定染料(例如，atto647n)的元荧光团看起来很亮，而具有较少的光稳定性染料(即alexa647)的元荧光团看起来为深灰色。刻度棒：5μm。荧光衰减常数可用作定量描述光稳定性的参数。通过将单个指数衰减拟合到强度相对时间曲线上来获得衰减常数。图21b分别显示了分别含有atto647n染料(左)，alexa647染料(右)和两种染料(中心)的三种不同的元荧光团样品的强度相对衰减常数的直方图(注意，每个样品中仅存在一种物质)。图21c示出了衰减常数的一维直方图，显示了三个可区分的衰减常数分布(图中的示意图示出了在元荧光团上的染料排列)。
图22a-22c示出了定量核酸检测的实例。图22a和22b示出了杂交反应的示意图。将元荧光团进行编程以杂交到特定核酸靶的区域(t1)。生物素化的捕获链结合于特定核酸靶的第二区域(a)，因此能够将三联体(捕获链，核酸靶和元荧光团)固定在涂有链霉抗生物素蛋白的表面上。每个阳性鉴定的元荧光团表示单个核酸靶。图22c是条形图，其显示检测到的靶的数量与其在感兴趣的样品中的浓度成正比。以确定的浓度(深灰色条)加入靶，随后以预期比率(浅灰色条)鉴定。最低靶浓度(靶3和4)为1.5pm。序列从左到右，从上到下：seqidno：197-199。
详细描述
荧光显微镜允许批量成像分子。它具有高度的特异性，高度灵敏度，可以检测单个生物分子。这通常通过荧光标签诸如遗传编码的荧光蛋白，有机染料或无机荧光纳米颗粒来实现。虽然荧光蛋白可以与感兴趣的靶蛋白共表达，但有机和无机染料必须与例如抗体，小分子或dna偶联，以便特异性地标记靶，例如蛋白质或核酸。
荧光显微镜的主要优点是通过使用光谱上不同的荧光标签(颜色)同时检测和鉴定一个样品中的多个不同分子种类的可能性，被称为多路复用。尽管如此，该多路复用检测受到可见范围内明确可检测的光谱颜色的数量的限制。有机荧光团的相当宽的发射光谱将光谱复用限制为约4-5种不同的染料。
因此，荧光显微镜需要一种新型的可编程标签，其允许明确检测理想地数百种不同的靶种类，同时保持“经典”染料的所需性质，例如其纳米级尺寸和靶标记能力。然而，已经实现了对可编程标签的有限的成功，这主要是由于缺乏对强度，颜色，尺寸和分子识别等性质的独立且精确的控制。
本公开内容提供了使用来自结构dna纳米技术的工具工程改造具有数字可调亮度和颜色的亚衍射尺寸标签的一般框架。每个标签由在紧凑的亚衍射体积中以空间控制的方式组织的多个可检测标记组成。这使得当使用衍射极限显微镜时，标签与传统的有机荧光团无法区分。因此，本公开内容的标签被称为“元荧光团”。本文提供的可检测标记的实例包括但不限于无机和有机荧光团，荧光蛋白，荧光纳米颗粒，无机纳米颗粒，纳米金刚石和量子点。
与传统的荧光团不同，元荧光团具有数字和独立的可调光学性质，例如可编程的强度水平和颜色混合比。为了制备这些元荧光团，使用核酸(例如dna)纳米结构作为平台，用于以准确预定的拷贝数、颜色比和空间控制在亚衍射体积中组织有机荧光团。强度和颜色的独立可编程性使得能够构建超过一百个明确编程的能够用作高含量成像的纳米级强度条形码的元荧光团。
有几种方法基于性质诸如几何形状和强度创建独特的条形码标志。可以通过使不同的荧光位置间隔超过所使用的成像系统的空间分辨率(例如，对于衍射限制大于250nm，和对于超分辨率系统大于20-40nm)来实现几何条形码化。结合光谱上不同的荧光团，组合标记指数地增加可能条形码的数量。尽管如此，几何条形码化导致标记尺寸增加，这是由于需要将荧光团充分地间隔以进行精确检测。现有的基于几何形状或荧光强度的亚微米条形码系统都不提供例如数百个尺寸低于100-200nm的条形码，而这对于原位标记是有利的。
在强度条形码化实现中，可以通过控制每个种类的荧光团的数量来产生可区分的条形码，从而允许不同强度水平的明确检测。与几何条形码相比，强度条形码的优点在于它们既不需要构造也不需要检测空间可分辨的荧光特征。因此，强度条形码可以小得多。
现有的强度条形码是庞大的微米级的结构。这种大的空间大小确保强度水平之间的鲁棒分离，因为这些条形码缺乏荧光团数量、间距和定位的分子可编程性，导致不想要的光物理效应，例如自淬灭和染料分子之间的
核酸纳米结构
本公开内容的实施方案提供了包含染料分子的特定种类、数量和/或排列的核酸纳米结构。如本文所用的“核酸纳米结构”是指形成(例如，自组装)二维(2d)或三维(3d)形状的核酸(例如，综述于w.m.shih,c.lin,curr.opin.struct.biol.20,276(2010)，通过引用并入本文)。可以使用任何核酸折叠或杂交方法形成纳米结构。一种这样的方法是dna折纸(参见例如通过引用并入本文的rothmund,p.w.k.nature440(7082):297-302(2006))。在dna折纸方法中，通过与多个较短的“订书钉”寡核苷酸的杂交折叠较长的“支架”核酸链来产生纳米结构，每个“订书钉”寡核苷酸与支架链内的两个或多个非连续区域杂交。在一些实施方案中，支架链的长度至少为100个核苷酸。在一些实施方案中，支架链长度为至少500，至少1000，至少2000，至少3000，至少4000，至少5000，至少6000，至少7000，或至少8000个核苷酸。支架链可以是天然或非天然存在的。订书钉链通常长度小于100个核苷酸；然而，取决于应用和支架链的长度，它们可以更长或更短。在一些实施方案中，订书钉链长度可以为15至100个核苷酸。在一些实施方案中，订书钉链长度为25至50个核苷酸。
在一些实施方案中，核酸纳米结构可以在不存在支架链的情况下组装(例如，无支架结构)。例如，可以组装多个寡核苷酸(例如，小于200个核苷酸或小于100个核苷酸的长度)以形成核酸纳米结构。
用于组装核酸纳米结构的其它方法是本领域已知的，其中任何一种可以在本文中使用。这样的方法描述于例如bellotg.等人,naturemethods,8:192-194(2011)；liedlt.等人,naturenanotechnology,5:520-524(2010)；shihw.m.等人,curr.opin.struct.biol.,20:276-282(2010)；key.等人,j.am.chem.soc,131:15903-08(2009)；dietzh.等人,science,325:725-30(2009)；hogbergb.等人,j.am.chem.soc,131:9154-55(2009)；douglass.m.等人,nature,459:414-418(2009)；jungmannr.等人,j.am.chem.soc,130:10062-63(2008)；shihw.m.,naturematerials,7:98-100(2008)；andshihw.m.,nature,all:618-21(2004)，其各自的全部内容通过引用并入本文。
核酸纳米结构可以组装成许多限定和预定形状之一，包括但不限于半球体，立方体，立方体样，四面体，圆柱体，锥体，八面体，棱柱体，球体，金字塔形，十二面体，管，不规则形状和抽象形状。纳米结构可以具有空隙体积(例如，其可以是部分或全部中空的)。在一些实施方案中，空隙体积可以是纳米结构体积的至少25％，至少50％，至少75％，至少85％，至少90％或更多。因此，在一些实施方案中，核酸纳米结构不包含固体核。在一些实施方案中，核酸纳米结构的形状不是圆形或接近圆形。在一些实施方案中，核酸纳米结构不是固体核心球。取决于预期用途，核酸纳米结构可以被组装成像二维薄片那样简单的形状或与三维晶格(或甚至更复杂)一样复杂的形状。
核酸纳米结构可以由dna，rna，修饰的dna，经修饰的rna或其组合制成或包含dna，rna，修饰的dna，经修饰的rna或其组合。
在一些实施方案中，合理设计核酸纳米结构。如果基于指导核酸杂交的预先确定的可预测的核苷酸碱基配对相互作用来选择形成纳米结构的核酸，则认为核酸纳米结构被“合理地设计”。例如，可以在其合成之前设计核酸纳米结构，并且可以在合成过程中使用某些选择的核苷酸(例如寡核苷酸)来规定和控制其大小，形状，复杂性和修饰。每个核酸在结构中的位置可以是已知的，并且在合成特定形状的纳米结构之前提供。设计例如自组装核酸纳米结构的基本原理是选择核酸链中的序列互补性，使得通过配对互补区段，核酸链在适当的物理条件下自组织成预定义的纳米结构。因此，在一些实施方案中，核酸纳米结构是自组装的。
根据本公开内容使用的核酸纳米结构的实例包括但不限于晶格(e.winfree,等人nature394,539(1998)；h.yan,等人science301,1882(2003)；h.yan,等人proc.natl.acad.ofsci.usa100,8103(2003)；d.liu,等人j.am.chem.soc.126,2324(2004)；p.w.k.rothemund,等人plosbiology2,2041(2004))，带(s.h.park,等人nanolett.5,729(2005)；p.yin,等人science321,824(2008))，管(h.yanscience(2003)；p.yin(2008))，具有定义形状的有限二维(2d)和三维(3d)物体(j.chen,n.c.seeman,nature350,631(1991)；p.w.k.rothemund,nature440,297(2006)；y.he,等人nature452,198(2008)；y.ke,等人nano.lett.9,2445(2009)；s.m.douglas,等人nature459,414(2009)；h.dietz,等人science325,725(2009)；e.s.andersen,等人nature459,73(2009)；t.liedl,等人naturenanotech.5,520(2010)；d.han,等人science332,342(2011))，宏观晶体(j.p.meng,等人nature461,74(2009))，单链瓦片(sst)(参见例如，weib.等人nature485:626,2012和公布于2014年5月15日的国际公开号wo2014/074597，各自通过引用并入本文)和由核酸“砖”组装的结构(参见例如，key.等人science388:1177,2012；国际公开号wo2014/018675a1，公开于2014年1月30日，各自通过引用并入本文)。可以如本文提供的那样使用其它核酸纳米结构。
在一些实施方案中，本公开内容的核酸纳米结构具有200nm或更小的尺寸(例如，直径，长度，宽度和/或高度)。例如，核酸纳米结构可以具有小于200nm，小于175nm，小于150nm，小于125nm，小于100nm或小于50nm的尺寸。在一些实施方案中，核酸纳米结构可以具有100nm或更小的尺寸。
染料分子
在一些实施方案中，本公开内容的核酸纳米结构包含染料分子的至少两个光物理上不同的子集。“染料分子”是指表现出一种或多种光物理过程的分子。如果染料分子或染料分子的子集可以基于染料分子或染料分子的子集所表现出的一个或多个光物理过程与其它染料分子区分开，则其被认为是“光物理上不同的”。光物理过程的实例包括但不限于能量转移和电子(或电荷)转移。基于能量转移和/或电子转移的特定性质包括例如光谱性质，光稳定性，光可切换性质，闪烁动力学，对缓冲液交换的反应，荧光寿命和量子产率。
在一些实施方案中，染料分子是“光谱上不同的”。光谱上不同的染料分子相对于彼此可以具有不同的发射光谱，但具有相同的激发光谱，或相对于彼此具有相同的发射光谱但具有不同的激发光谱。可以使用例如依赖于滤波或“线性解混合”算法的仪器(例如，硬件或软件)来检测发射和/或激发光谱的差异(参见例如averbuch等人remotesens.2012,4,532-560)。例如，atto647n，atto655，cy5和alexa647(红色)与atto565，cy3和cy3b(绿色)(其与atto488和alexa488(蓝色)在光谱上不同)在光谱上不同。相比之下，atto647n，atto655，cy5和alexa647(红色)是光谱重叠的染料分子。类似地，atto565，cy3和cy3b(绿色)是光谱重叠的染料分子，atto488和alexa488(蓝色)是光谱重叠的染料分子。
在一些实施方案中，基于光稳定性区分染料分子。例如，不同的染料分子可能具有不同的漂白动力学。“漂白动力学”是指染料分子漂白或失去荧光的能力的反应的动力学(例如速率)。在一些实施方案中，染料分子在光谱上重叠但具有不同的漂白动力学。例如，atto647n和alexa647在光谱上重叠但具有不同的漂白动力学。
在一些实施方案中，染料分子基于可光切换性质来区分。“可切换的”染料分子是指具有荧光的分子，其在一定波长的激发下可以以可逆的方式被光切换打开或关闭。可以通过例如分子的化学环境(例如，不含或含有盐，硫醇和/或酶的缓冲液中的分子)影响可切换的性质。
染料分子的“光物理上不同的子集”是指相同染料分子(例如，一组atto647n染料分子，cy3染料分子的子集，或一组atto488染料分子)的子集，其基于该子集的染料分子的光物理性质的染料分子而其它子集区分开。例如，“红色”atto647n染料分子的一个子集被认为是与“绿色”cy3染料分子的一个子集光物理上不同(更具体而言，在光谱上不同)。同样，“红色”atto647n染料分子的子集与“蓝色”atto488染料分子的子集是光物理上不同的，并且“蓝色”atto488染料分子的子集在光物理上不同于“绿色”cy3染料分子。
在一些实施方案中，光物理上不同的染料分子子集之间的距离大于染料分子自淬灭的距离。淬灭是指降低染料分子的荧光强度的方法。(例如，相同种类的两个染料分子)当一对的染料分子彼此的邻近度使得它们的荧光强度相对于该对的分离的染料分子的荧光强度降低至少5％时，它们被认为是“自猝灭”的。这可能通过接触淬火或fret发生。在一些实施方案中，当染料分子彼此的邻近度使得它们的荧光强度降低至少5％至100％时，它们被认为是自淬灭的。例如，当染料分子彼此的邻近度使得它们的荧光强度降低至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少85％，至少90％，至少95％或至少100％时，它们被认为是“自猝灭”的。
染料分子(例如，荧光分子)自淬灭的距离部分地取决于染料分子的种类(例如，atto647n，cy3，atto488)，包括其光物理性质。在一些实施方案中，染料分子(例如，荧光分子)自淬灭的距离范围为从染料分子的大致中心测量的接触(例如，0.1nm至50nm)或更多。在一些实施方案中，染料分子(例如，荧光分子)自淬灭的距离为至少5nm，至少10nm或至少15nm。在一些实施方案中，染料分子(例如，荧光分子)自淬灭的距离可以小于5nm(例如，4nm，3nm，2nm或1nm)。在一些实施方案中，染料分子(例如，荧光分子)自淬灭的距离为5nm至50nm。例如，染料分子(例如荧光分子)自淬灭的距离可以是5nm，6nm，7nm，8nm，9nm，10nm，11nm，12nm，13nm，14nm，15nm，16nm，17nm，18nm，19nm，20nm，21nm，22nm，23nm，24nm，25nm，26nm，27nm，28nm，29nm，30nm，31nm，32nm，33nm，34nm，35nm，36nm，37nm，38nm，39nm，40nm，41nm，42nm，43nm，44nm，45nm，46nm，47nm，48nm，49nm或50nm。在一些实施方案中，染料分子(例如，荧光分子)自淬灭的距离可以为5nm至100nm，5nm至75nm，5nm至50nm，5nm至25nm，5nm至15nm，或5nm至10nm。
在一些实施方案中，任何一对染料分子之间的距离，来自一个光物理上不同的子集(例如，atto647n染料分子的子集)的一个染料分子和来自另一个光物理上不同的子集(例如，cy3染料分子的子集)的另一染料分子之间的距离，至少是该对染料分子的
一对染料分子(例如，荧光分子)的fret半径部分地取决于染料分子的种类(例如，atto647n，cy3，atto488)，包括其光物理性质。在一些实施方案中，一对染料分子(例如，荧光分子)的fret半径为1nm至100nm或更多。例如，一对染料分子(例如荧光分子)的fret半径可以是1nm，2nm，3nm，4nm，5nm，6nm，7nm，8nm，9nm，10nm，11nm，12nm，13nm，14nm，15nm，16nm，17nm，18nm，19nm，20nm，21nm，22nm，23nm，24nm，25nm，26nm，27nm，28nm，29nm，30nm，31nm，32nm，33nm，34nm，35nm，36nm，37nm，38nm，39nm，40nm，41nm，42nm，43nm，44nm，45nm，46nm，47nm，48nm，49nm，50nm，55nm，60nm，65nm，70nm，75nm，80nm，85nm，90nm，95nm或100nm。在一些实施方案中，一对染料分子(例如，荧光分子)的fret半径可以是1nm至100nm，1nm至75nm，1nm至50nm，1nm至25nm，1nm至15nm，10nm至100nm，10nm至75nm，10nm至50nm，10nm至25nm，10nm至15nm。在一些实施方案中，一对染料分子(例如，荧光分子)的fret半径可以是至少5nm，至少10nm，至少15nm或至少20nm。在一些实施方案中，一对染料分子(例如，荧光分子)的fret半径可以小于10nm(例如，9nm，8nm，7nm，6nm或5nm)。
光物理上不同的染料分子子集可以是在纳米结构的限定区域内分组在一起的均质子集。例如，图1a显示了染料分子的三个光物理上不同(例如，光谱上不同)的子集：含有“红色”种类的子集，含有“蓝色”种类的子集，以及含有“绿色”种类的子集。三个光物理上不同的子集中的每一个含有均匀的(例如相同的)染料分子群体。光物理上不同的“红色”子集的染料分子和光物理上不同的“蓝色”子集的染料分子之间的距离至少为任何一对染料分子(一个分子来自“红色”子集和一个分子来自“蓝色”子集)的fret半径。同样，光物理上不同的“蓝色”子集的染料分子与光物理上不同的“绿色”子集的染料分子之间的距离至少为任何一对染料分子(一个分子来自“蓝色”子集和一个分子来自“绿色”子集)的fret半径。
在一些实施方案中，光物理上不同的染料分子子集可以与另一个光物理上不同的染料分子子集混合，只要任何一对染料分子之间的距离，来自一个光物理上不同的子集的一个染料分子(例如，“红色“)和来自另一个光物理上不同的子集(例如”蓝“)的另一个染料分子之间的距离，至少是该对的fret半径。因此，在一些实施方案中，核酸纳米结构包含含有不具有自淬灭或fret方法的光物理不同染料分子的混合群体的区域。
在一些实施方案中，染料分子间接连接到核酸纳米结构(即，纳米结构被染料分子间接“标记”)。例如，染料分子可以通过“柄”和“抗柄”(rothemund，nature440,297-302(2006)，通过引用并入本文)间接附着于核酸纳米结构。在染料分子拟连接的位置，纳米结构的核酸可以用被称为“柄”的短单链核酸延伸。在一些实施方案中，柄的长度为10核苷酸(nt)至100nt。例如，柄的长度可以为10至90nt，10至80nt，10至70nt，10至60nt，10至50nt，10至40nt，10至30nt，15至100nt，15至90nt，15至80nt，15至70nt，15至60nt，15至50nt，15至40nt或15至30个核苷酸。在一些实施方案中，柄的长度可以是10nt，11nt，12nt，13nt，14nt，15nt，16nt，17nt，18nt，19nt，20nt，21nt，22nt，23nt，24nt，25nt，26nt，27nt，28nt，29nt或30个核苷酸。被称为“抗柄”的互补单链核酸用旨在附着于纳米结构的染料分子进行功能化。在一些实施方案中，染料分子共价连接到抗柄上。在一些实施方案中，染料分子非共价连接到抗柄上。抗柄被设计成与纳米结构上的柄互补并与之杂交。柄/抗柄赋予染料分子可编程性。例如，参照图1a，使用正交柄和抗柄序列，将三个不同颜色的(例如，红色，蓝色和绿色)分子“编程”以附着到纳米结构作为分子的均匀组。柄和/或抗柄可以是例如dna或rna柄和/或抗柄。
在一些实施方案中，用染料分子标记核酸纳米结构可以通过与纳米结构上的dna或rna链直接杂交(例如，柄/抗柄结合)实现或通过使用用于蛋白质标记的抗体或小分子粘合剂来介导(参见例如liu,y.,等人angewchemintedengl44,4333-4338(2005)；rinker,s.,等人natnanotechnol3,418-422(2008)，通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，直接用染料分子标记核酸纳米结构。例如，染料分子可以共价或非共价连接到纳米结构的核酸链上。在一些实施方案中，多于一种染料分子可以共价或非共价连接到纳米结构的核酸链上。例如，核酸链可以在其3'末端、其5'末端含有染料分子和/或其可以被内部标记(3'和5'末端之间的任何区域)。
本公开内容的纳米结构可以包括各自可以基于一个或多个光物理过程进行区分的光物理上不同的染料分子子集。在一些实施方案中，核酸纳米结构包含染料分子的至少两个光物理上不同的子集。例如，核酸纳米结构可以包含至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，或至少10个或更多个光物理上不同的染料分子子集。在一些实施方案中，核酸纳米结构包含染料分子的2至10个，3至10个，4至10个或5至10个光物理上不同的子集。光物理上不同的染料分子子集可以是光谱上不同的，具有不同的漂白动力学，具有不同的可光切换性质，或者例如上述任何两种或三种的组合。
染料分子的光物理不同子集中的染料分子的数目可以根据子集的期望强度而变化。在一些实施方案中，光物理上不同的染料分子子集包含5至100个染料分子。例如，光物理上不同的染料分子子集可以包含5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,28,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50个染料分子。在一些实施方案中，染料分子的光物理不同子集可以含有50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100或更多个染料分子。
本发明的核酸纳米结构通常具有染料分子的至少两个光物理上不同的子集，每个子集含有相同或不同数量的染料分子。例如，纳米结构可以包含光物理上不同的子集x，光物理上不同的子集y和光物理上不同的子集z，其中子集x包含n个染料分子，子集y包含m个染料分子，并且子集z包含o个染料分子，并且其中n，m和o是任何整数(例如，5至100)。如本文别处所述，纳米结构可以含有2、3、4、5或更多个光物理上不同的染料分子子集，每个子集包含相同或不同数量的染料分子。
本文还提供了多个(例如，至少两个)核酸纳米结构，其中的每个纳米结构包含独特的染料分子集合，其包括染料分子的至少两个光物理上不同的子集，其中单个光物理上不同的子集的染料分子之间的距离大于染料分子自淬灭的距离，以及任何一对染料分子之间的距离，来自一个光物理上不同子集的一个染料分子和来自另一个光物理上不同子集的另一个染料分子之间的距离，至少是该对染料分子的
在图3c中由白色圆圈突出显示的纳米结构包含27个红色alexa647染料分子，44个蓝色atto488染料分子和27个绿色cy3染料分子。白色圆圈正下方的纳米结构包含14个红色alexa647染料分子，44个蓝色atto488染料分子和27个绿色cy3染料分子。紧接在白色圆圈左侧的纳米结构包含14个红色alexa647染料分子，44个蓝色atto488染料分子和14个绿色cy3染料分子。因此，每个纳米结构含有染料分子的独特“集合”。
在图3c的多个核酸纳米结构内的是核酸纳米结构的子集，其中该子集的每个纳米结构包含至少三个光物理上不同的染料分子子集，每个光物理上不同的染料分子子集具有不同数量的染料分子，并且子集的核酸纳米结构的强度分布是不重叠的。
探针和靶分子
本公开内容的元荧光团通常用作可检测标记或“标签”。例如，在一些实施方案中，使用元荧光团来检测靶分子。探针和靶分子(例如，结合配偶体)的实例包括但不限于蛋白质，糖(例如多糖)，脂质，核酸(例如dna，rna，微rna，sirna)，小分子，有机和无机颗粒和/或表面。在一些实施方案中，靶核酸是反义分子，例如dna反义合成寡核苷酸(aso)。考虑了其它探针和靶分子。
在一些实施方案中，本文公开的元荧光团通过“柄”和“抗柄”链策略附着于探针，如本文别处所述的。在一些实施方案中，通过中间接头分子，将元荧光团与探针连接(例如共价或非共价)。在一些实施方案中，中间接头包括n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)接头。其它中间接头可以包括生物素和/或链霉抗生物素蛋白。例如，在一些实施方案中，元荧光团和探针可以各自被生物素化(即，连接至少一个生物素分子)并且通过生物素与中间链霉抗生物素蛋白分子结合而彼此连接。本文提供的中间接头可以用于将元荧光团连接到探针上，将元荧光团连接到染料分子上，或将元荧光团连接到基底(例如玻璃)上。
触发组装
本公开内容的核酸纳米结构(元荧光团)具有独特的数字可编程光学性能。此外，动态dna纳米技术使得有可能以环境响应的方式对元荧光团的形成进行编程：例如，可以将元荧光团编程为仅在检测到用户指定的触发器时形成。元荧光团的触发形成对于原位成像应用尤其有用，例如：荧光发夹单体在检测到与靶相连的触发器(例如mrna或蛋白质)时，形成原位附着在触发器上的元荧光团。与非原位预制的元荧光团相比，原位形成的元荧光团具有至少两个优点。首先，单体的尺寸小于元荧光团，因此可以更容易地以更快的扩散动力学渗入深层组织。第二，由于仅在靶部位形成明亮的元荧光团，所以可以避免由预组装的条形码与细胞成分的非特异性相互作用引起的可能的假阳性，并且由于荧光单体的触发聚集引起的靶位点的信号扩增将有助于增加信背比。
因此，本公开内容的一些方面提供了包含与第一染料分子连接的核酸捕获链、比捕获链长的核酸触发链和部分双链的核酸的系统(或试剂盒)，所述核酸触发链包含(a)与捕获互补的捕获结构域链和(b)各自包含两个子结构域的至少两个串联结构域，所述部分双链的核酸包含具有与串联结构域的两个子结构域中的一个子结构域互补的核苷酸序列的单链支点结构域、与第二染料分子连接并且具有与串联结构域的两个子结构域中的另一个互补的核苷酸序列的双链区域以及具有与单链支点结构域互补的核苷酸序列的单链发夹环。
“核酸捕获链”是指与“核酸触发链”互补并结合的单链核酸。图4a描绘了用染料分子标记的核酸捕获链的实例。在一些实施方案中，核酸捕获链具有5-100个核苷酸的长度。例如，核酸捕获链可以具有5-90,5-80,5-70,5-60,5-50,5-40,5-30,5-20,10-100,10-90,10-80,10-70,10-60,10-50,10-40,10-30,10-20,15-100,15-90,15-80,15-70,15-60,15-50,15-40,15-30,20-100,20-90,20-80,20-70,20-60,20-50,20-40,20-30,25-100,25-90,25-80,25-70,25-60,25-50,25-40,25-30,30-100,30-90,30-80,30-70,30-60,30-50或30-40个核苷酸的长度。在一些实施方案中，核酸捕获链具有4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,333,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50个核苷酸的长度。在一些实施方案中，核酸捕获链的长度为15±5,20±5,25±5,30±5,35±5,40±5,45±5或15±5个核苷酸。
在一些实施方案中，核酸捕获链连接到表面(例如，基底或基底的表面)。基底可以是例如玻璃或其它聚合物。在一些实施方案中，将核酸捕获链通过接头连接到表面。接头可以包括例如生物素和/或链霉抗生物素蛋白。因此，在一些实施方案中，(至少一种)核酸捕获链可以偶联到表面诸如玻璃表面。
在一些实施方案中，核酸捕获链用染料分子(第一染料分子)标记(包括或连接至染料分子)，例如如图4a所示。染料分子(例如，荧光分子)在本文其他地方描述。通常，捕获链的染料分子与下文描述的部分双链的核酸的染料分子不同(不相同)。
“核酸触发链”是指单链核酸链，其包含(a)与捕获链互补(或与捕获链上的结构域互补)的捕获结构域，和(b)至少两个串联结构域，其各自包括两个子结构域(参见例如图4a“触发”，其中“c*”表示捕获结构域，“1”表示子结构域中的一个(2中的1)，“a”表示另一个子结构域(2中的2)。在一些实施方案中，核酸触发链具有100-5000个核苷酸的长度，例如，核酸触发链可以具有100-4500,100-4000,100-3500,100-3000,100-2500,100-2000,100-1500,100-1000,100-500,200-5000,200-4500,200-4000,200-3500,200-3000,200-2500,200-2000,200-1500,200-1000或200-500个核苷酸的长度。在一些实施方案中，核酸触发链具有50,75,100,125,150,175,200,225,250,275,300,325,350,375,400,425,450,475,500,525,550,575,600,625,650,675,700,725,750,775,800,825,850,875,900,925,950,975或1000个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，核酸触发链的“捕获结构域”与捕获链或捕获链上的结构域互补(完全(100％)互补)。在一些实施方案中，捕获结构域与捕获链互补部分(小于100％)。在一些实施方案中，捕获结构域具有10-100个核苷酸的长度。例如，捕获结构域可以具有10-90,10-80,10-70,10-60,10-50,10-40,10-30,10-20,20-100,20-90,20-80,20-70,20-60,20-50,20-40,20-30,30-90,30-80,30-70,30-60,30-50或30-40个核苷酸的长度。在一些实施方案中，捕获结构域具有5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100个核苷酸的长度。
“串联结构域”是指以连续方式重复的核酸序列，例如如图4a所示。串联结构域通常包含至少两个子结构域，其中一个与部分双链的核酸的支点结构域(如下所述)互补，另一个与部分双链的核酸的双链区域的结构域互补(也在下文中描述)。作为实例，图4a描绘了含有四个串联结构域的核酸触发链，各自具有子结构域“1”和子结构域“a”。子结构域“1”与部分双链“发夹”核酸的结构域“1*”互补，子结构域“a”与部分双链的核酸的支点结构域“a*”互补。在一些实施方案中，核酸触发链的串联结构域具有15-100个核苷酸的长度。例如，串联结构域可以具有15-90,15-80,15-70,15-60,15-50,15-40,15-30,15-20,20-100,20-90,20-80,20-70,20-60,20-50,20-40,20-30,30-100,40-100,40-90,40-80,40-70,40-60,40-50,50-100,50-90,50-80,50-70或50-60个核苷酸。在一些实施方案中，串联结构域具有10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30个核苷酸。
在一些实施方案中，串联结构域的两个子结构域中的至少一个具有5-50个核苷酸的长度。例如，子结构域可以具有5-40,5-30,5-20,5-10,10-50,10-40,10-30,10-20,15-50,15-40,15-30或15-10个核苷酸的长度。在一些实施方案中，子结构域具有5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，串联结构域的两个子结构域中的一个比该两个子结构域中的另一子结构域长。例如，一个子结构域(例如，5'子结构域)可以比串联结构域的其他子结构域(例如，3'子结构域)长2-20个核苷酸。在一些实施方案中，一个子结构域可以比另一个子结构域长2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20个核苷酸。在一些实施方案中，一个子结构域可以比另一个子结构域长10％-100％(例如10％，15％，20％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％)。
在一些实施方案中，核酸触发链包含至少两个串联结构域。例如，核酸触发链可包含至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，至少19个或至少20个串联结构域。在一些实施方案中，核酸触发链包含2-100个串联结构域。例如，核酸触发链可以包含2-90,2-80,2-70,2-60,2-50,2-40,2-30,2-20,2-10,2-5,5-100,5-90,5-80,5-70,5-60,5-50,5-40,5-30,5-20,5-10,10-100,10-90,10-80,10-70,10-60,10-50,10-40,10-30,10-20,20-100,20-90,20-80,20-70,20-60,20-50,20-40或2-30个串联结构域。在一些实施方案中，核酸触发链包含2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100个串联结构域。
“部分双链的核酸”是指自发杂交以形成发夹环的核酸链，例如如图4a所示。部分双链的核酸包含具有与串联结构域的两个子结构域中的一个子结构域(例如，3'子结构域)互补的核苷酸序列的单链“支点”结构域，连接到染料分子并且具有与串联结构域的两个子结构域中的另一个(例如，5'子结构域)互补的核苷酸序列的的双链区域，和具有与单链支点结构域互补的核苷酸序列并因此与触发链的串联结构域的两个子结构域中的一个子结构域(例如，3'子结构域)互补的单链发夹环。
在一些实施方案中，部分双链的核酸的长度为20-500个核苷酸。例如，部分双链的核酸的长度可以为20-400,20-300,20-200,20-100,20-90,20-80,20-70,20-60,20-50,20-40,30-500,30-400,30-300,30-300,30-100,30-90,30-80,30-70,30-60,30-50,30-40,40-500,40-400,40-300,40-400,40-100,40-90,40-80,40-70,40-60,40-50,50-500,50-400,50-300,50-500,50-100,50-90,50-80,50-70或50-60个核苷酸。在一些实施方案中，部分双链的核酸具有20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，单链的支点结构域具有5-50个核苷酸的长度。例如，支点结构域可以具有5-40,5-30,5-20,5-10,10-50,10-40,10-30,10-20,15-50,15-40,15-30或15-10个核苷酸的长度。在一些实施方案中，支点结构域的长度为5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30个核苷酸。
在一些实施方案中，双链区域具有10-100个核苷酸碱基对的长度。例如，双链区域可以具有10-90,10-80,10-70,10-60,10-50,10-40,10-30,10-20,20-100,20-90,20-80,20-70,20-60,20-50,20-40,20-30,30-90,30-80,30-70,30-60,30-50或30-40个核苷酸碱基对的长度。在一些实施方案中，双链区域的长度为5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100个核苷酸碱基对。
在一些实施方案中，单链发夹环具有5-50个核苷酸的长度。例如，发夹环可以具有5-40,5-30,5-20,5-10,10-50,10-40,10-30,10-20,15-50,15-40,15-30或15-10个核苷酸的长度。在一些实施方案中，发夹环具有5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30个核苷酸的长度。
核酸触发链通常比核酸捕获链长。例如，触发链可以比捕获链长2-20个核苷酸。在一些实施方案中，触发链比捕获链长2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20个核苷酸。在一些实施方案中，触发链比捕获链长10％-100％(例如，10％，15％，20％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％)(比另一个子结构域长)。
在一些实施方案中，将(至少一个)核酸捕获链连接到表面(或基底的表面)。例如，可以将1-1000,1-500,1-100,1-50,1-25或1-10个核酸捕获链连接到表面。在一些实施方案中，将1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100或更多个核酸捕获链连接到表面。在一些实施方案中，表面是玻璃表面。
在一些实施方案中，本公开内容的系统或试剂盒包含至少两种部分双链发夹核酸。例如，系统或试剂盒可以包括2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100或更多种部分双链发夹核酸。
在一些实施方案中，至少一种部分双链的核酸与触发核酸结合，例如如图4a所示。
在一些实施方案中，将至少十个(例如10-100个)部分双链的核酸组装在与单链捕获链结合的单链触发核酸上，从而形成包含至少10个染料分子的核酸纳米结构。
图4a显示了由十个亚稳定的cy3标记的dna发夹链构成的三角形元荧光团的触发组装的实例的示意图。核酸捕获链(用alexa647标记)通过生物素-链霉抗生物素蛋白偶联连接到玻璃表面。较长的触发链可以与捕获链杂交。触发链包含四个串联结构域“1-a”，其中子结构域“1”长度为20个核苷酸，子结构域“a”长度为12个核苷酸。发夹链在没有触发链的情况下共同亚稳定地存在，并且仅在暴露于触发链时才组装成所需的结构。例如，引入重复单链触发链引发动力学捕获的荧光发夹单体的组装，其产生第二排结合位点。这些结合位点进一步使得能够组装单体的连续排，每排比前一排含有少一个单体。在将10个发夹(用cy3标记))组装到单触发链之后，不再显示另外的触发序列并终止组装，产生具有固定尺寸的三角形的元荧光团。图4b示出了在玻璃表面上原位组装的三角形的荧光图像。捕获链用alexa647标记，发夹用cy3标记。将具有10个cy3和44个atto488染料分子的dna折纸作为强度参照添加到样品中。可以在atto488和cy3信号共同定位的位置识别dna折纸结构。在叠加荧光图像下面的示意图中，一个暗点表示atto488标记的折纸标记物，较浅的灰点表示alexa647标记的捕获链和由cy3标记的发夹单体组成的三角形的预期重叠。灰色“x”符号表示发夹与表面的非特异性结合。图4c显示三角形的元荧光团(浅灰色)和参照dna折纸(深灰色)的强度分布是重叠的，表明三角形的形成。
本文还提供了组装元荧光团的方法，包括在导致部分双链的发夹自组装(杂交)成元荧光团的条件下使包含多个捕获链的表面与触发链和多个部分双链发夹接触。
其它实施方案
i：双色fret，几何编码，染料仅在其光谱上不同
本文提供了包含染料分子的至少两个光谱上不同子集的核酸纳米结构，其中任何一对染料分子(来自一个光谱上不同子集的一个染料分子和来自另一个光谱上不同子集的另一个染料分子)之间的距离，来自一个光谱上不同子集的一个染料分子和来自另一个光谱上不同子集的另一个染料分子之间的距离，在发生
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的一种受体染料。(r1-g1)
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的几个受体染料。(r1-g1-r1)
ii：多色fret，几何编码，染料仅在其光谱上不同
本文还提供了包含染料分子的至少三个光谱上不同子集的核酸纳米结构，其中任何一对染料分子之间的距离，来自一个光谱上不同子集的一个染料分子和来自另一个光谱上不同子集的另一个染料分子之间的距离，在发生
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的光谱上不同的染料分子的子集之一的一种受体染料。(r1-g1^r1-b1)
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的光谱上不同的染料分子的子集之一的几种受体染料。(r1-g1-r1^r1-b1-r1)
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的光谱上不同的染料分子的几个子集的几种受体染料。(例如r1-g1-b1)
iii：双色fret，几何编码，染料在光动力学上不同
本文提供了包含至少三个光物理上不同的染料分子子集的核酸纳米结构，其中光物理上不同的染料分子子集中的至少两个在光谱上重叠，并且其中任何一对染料分子之间的距离，光谱上不同的子集的一个染料分子和另一个光谱上不同子集的另一个染料分子之间的距离，在发生
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的光谱上不同的子集的一种受体染料。(r1-g1^r2-g1)
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的光谱上不同的子集之一的几种受体染料。(r1-g1-r1^r2-g1-r1)
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的光谱上不同的任何子集的几种受体染料。(r1-g1-r2)
iv：多色fret，几何编码，染料在光谱和光动力学上不同
本文还提供了包含至少三个光物理上不同的染料分子子集的核酸纳米结构，其中任何一对染料分子之间的距离，来自一个光谱上不同子集的一个染料分子和来自另一个光谱上不同子集的另一个染料分子之间的距离，在发生
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的光物理不同的子集的一种受体染料。(r1-g1^r2-g1^r1-b1^r2-b1)
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的光物理不同的子集之一的几种受体染料。(r1-g1-r1^r2-g1-r2^r1-b1-r1^r2-b1r2)
在一些实施方案中，这种fret对的供体染料具有与其紧邻的光物理不同的任何子集的几种受体染料。(r1-g1-r2^r1-b1-r2)
本文还提供了多个(例如，至少两个)核酸纳米结构，每个纳米结构包含独特的染料分子集合。
应用和试剂盒
本公开内容的元荧光团可以用作探针的标记，例如用于多重靶检测，荧光相关光谱(fcs)，流式细胞术和通过高密度标记显微镜的信号放大。
在一些实施方案中，方法包括在基底(例如玻璃基底)的表面上捕获靶分子(例如dna或rna)，使得捕获的靶与本文提供的条形码化的元荧光团接触，并通过荧光显微镜鉴定靶。本文考虑了其它应用。
本公开内容的方面还提供了包含如本文提供的任何两种或更多种组分或试剂的试剂盒。
本公开内容的其他方面包括以下编号的段落：
1.一种核酸纳米结构，其包含至少两个光物理上不同的染料分子子集，其中单个光物理上不同的子集的染料分子之间的距离大于染料分子自淬灭的距离，以及任何一对染料分子之间的距离，来自一个光物理上不同的子集的一个染料分子和来自另一个光物理上不同的子集的另一个染料分子之间的距离，至少是该对染料分子的
2.段落1的核酸纳米结构，其中单个光物理上不同的子集的任何一对染料分子之间的距离为至少5nm。
3.段落2的核酸纳米结构，其中单个光物理上不同的子集的任何一对染料分子之间的距离为5nm至100nm。
4.段落1-3中任一项的核酸纳米结构，其中任何一对染料分子之间的距离，来自一个光物理上不同的子集的一个染料分子和来自另一个光物理上不同的子集的另一个染料分子之间的距离，为至少10纳米。
5.段落4的核酸纳米结构，其中任何一对染料分子之间的距离，来自一个光物理上不同的子集的一个染料分子和来自另一个光物理上不同的子集的另一个染料分子之间的距离，为10nm至100nm。
6.根据段落1-5中任一项所述的核酸纳米结构，其中所述核酸纳米结构具有5nm至200nm的尺寸。
7.段落1-6中任一项的核酸纳米结构，其中每个光物理上不同的子集的染料分子间接附着于纳米结构的核酸。
8.段落7的核酸纳米结构，其中每个光物理上不同的染料分子子集通过至少一条单链核酸间接附着于纳米结构的核酸。
9.段落8的核酸纳米结构，其中所述至少一条单链核酸的长度为15至100个核苷酸。
10.段落1-9中任一项的核酸纳米结构，其中单个光物理上不同的子集的染料分子在纳米结构的限定区域内分组在一起。
11.段落1-10中任一项的核酸纳米结构，其包含至少三个光物理上不同的染料分子子集。
12.段落11的核酸纳米结构，其包含三至十个光物理上不同的染料分子子集。
13.段落1-12中任一项的核酸纳米结构，其中光物理上不同的染料分子子集是染料分子的光谱上不同的子集。
14.段落1-12中任一项的核酸纳米结构，其中光物理上不同的染料分子子集具有不同的相对于彼此的漂白动力学。
15.段落1-12中任一项的核酸纳米结构，其中所述光物理上不同的染料分子子集具有相对于彼此不同的可光切换性质。
16.多个核酸纳米结构，每个纳米结构包含独特的染料分子集合，其中每个染料分子集合包括至少两个光物理上不同的染料分子子集，其中单个光物理上不同的子集的染料分子之间的距离大于染料分子自淬灭的距离，并且任何一对染料分子之间的距离，来自一个光物理上不同的子集的一个染料分子和来自另一个光物理上不同的子集的另一个染料分子之间的距离，至少为该对染料分子的
17.段落16的多个核酸纳米结构，其中所述核酸纳米结构具有非重叠的强度分布。
18.段落16或17的多个核酸纳米结构，其中单个光物理上不同的子集的任何一对染料分子之间的距离为至少5nm。
19.段落18的多个核酸纳米结构，其中单个光物理上不同的子集的任何一对染料分子之间的距离为5nm至50nm。
20.段落16-19中任一项的多个核酸纳米结构，其中在单个纳米结构上，任何一对染料分子之间的距离，来自一个光物理上不同的子集的一个染料分子和来自另一个光物理上不同的子集的另一个染料分子子集之间的距离，至少为10nm。
21.段落20的多个核酸纳米结构，其中在单个纳米结构上，任何一对染料分子之间的距离，来自一个光物理上不同的子集的一个染料分子和来自另一个光物理上不同的子集的另一个染料分子之间的距离，为10nm至100nm。
22.段落16-21中任一项所述的多个核酸纳米结构，其中所述核酸纳米结构具有小于200nm的尺寸。
23.段落16-22中任一项所述的多个核酸纳米结构，其中每个光物理上不同的子集的染料分子间接附着于纳米结构的核酸。
24.根据段落16-23中任一项所述的多个核酸纳米结构，其中每个光物理上不同的子集的染料分子经由至少一条单链核酸间接附着于所述多个纳米结构的核酸。
25.段落24的多个核酸纳米结构，其中所述至少一条单链核酸的长度为15至100个核苷酸。
26.段落16-25中任一项的多个核酸纳米结构，其中单个光物理上不同的子集的染料分子在多个纳米结构的限定区域内分组在一起。
27.段落16-26中任一项的多个核酸纳米结构，其中纳米结构上的每个染料分子集合包含至少三个光物理上不同的染料分子子集。
28.段落27的多个核酸纳米结构，其中纳米结构上的每个染料分子集合包含三至十个光物理上不同的染料分子子集。
29.段落16-28中任一项所述的多个核酸纳米结构，其中所述光物理上不同的染料分子子集是染料分子的光谱上不同的子集。
30.段落16-28中任一项所述的多个核酸纳米结构，其中所述光物理上不同的染料分子子集相对于彼此具有不同的漂白动力学。
31.段落16-28中任一项所述的多个核酸纳米结构，其中所述光物理上不同的染料分子子集具有相对于彼此具有不同的可光切换性质。
32.段落16-31中任一项所述的核酸纳米结构的子集，其中所述子集的每个纳米结构包含至少三个光物理上不同的染料分子子集，每个光物理上不同的染料分子子集具有不同的数目的染料分子，并且子集的核酸纳米结构的强度分布是不重叠的。
33.段落1-15中任一项的核酸纳米结构与与核酸靶的第一区域互补的第一单链寡核苷酸连接。
34.段落33的核酸纳米结构，其中第一单链寡核苷酸与核酸靶的第一区域结合。
35.段落34的核酸纳米结构，其中所述核酸靶包含与第二单链寡核苷酸互补并与其结合的第二区域，其中所述第二单链寡核苷酸附着于基底。
36.段落35的核酸纳米结构，其中第二单链寡核苷酸被生物素化。
37.段落36的核酸纳米结构，其中表面被涂覆在链霉抗生物素蛋白中，第二生物素化的单链寡核苷酸通过生物素-链霉抗生物素蛋白结合相互作用附着到基底上。
38.段落35-37中任一项的核酸纳米结构，其中所述基底是玻璃或塑料基底。
39.一种基底，其在所述基底的表面上包含多个生物素化的单链寡核苷酸，其中所述生物素化的单链寡核苷酸中的至少一些与靶核酸的区域互补并结合，并且其中段落33的核酸纳米结构的第一单链寡核苷酸与靶核酸的另一区域互补并结合。
40.定量核酸靶的方法，包括
(a)将靶核酸施加于在基底的表面上包含多个生物素化的单链寡核苷酸的基底，其中所述靶核酸包含第一和第二区域，并且其中所述生物素化的单链寡核苷酸与靶核酸的第二区域互补；(b)在导致核酸纳米结构与核酸靶结合的条件下，向(a)的基底施加段落33的多个核酸纳米结构；和(c)定量与核酸靶结合的核酸纳米结构。
41.一种系统(或试剂盒)，其包含：与第一染料分子连接的核酸捕获链；比捕获链长的核酸触发链，并且所述核酸触发链包含(a)与捕获链互补的捕获结构域和(b)各自包含两个子结构域的至少两个串联结构域；和部分双链的核酸，其包含：具有与串联结构域的两个子结构域中的一个子结构域互补的核苷酸序列的单链支点结构域，与第二染料分子连接并且具有与串联结构域的两个子结构域中的另一个互补的核苷酸序列的双链区域，以及具有与单链支点结构域互补的核苷酸序列的单链发夹环。
42.段落41的系统(或试剂盒)，其中所述核酸捕获链具有10-100个核苷酸的长度。
43.段落41或42的系统(或试剂盒)，其中染料分子是荧光染料分子。
44.段落41-43中任一项所述的系统(或试剂盒)，其中所述核酸触发链长度为100-5000个核苷酸。
45.段落44的系统(或试剂盒)，其中所述核酸触发链具有100-1000个核苷酸的长度。
46.段落41-45中任一项所述的系统(或试剂盒)，其中所述捕获结构域具有10-100个核苷酸的长度。
47.段落41-46中任一项的系统(或试剂盒)，其中核酸触发链的串联结构域具有15-100个核苷酸的长度。
48.段落41-47中任一项的系统(或试剂盒)，其中串联结构域的两个子结构域中的至少一个具有5-50个核苷酸的长度。
49.段落41-48中任一项的系统(或套件)，其中串联结构域的两个子结构域中的一个比两个子结构域中的另一子结构域长。
50.段落41-49中任一项的系统(或试剂盒)，其中所述部分双链的核酸的长度为20-500个核苷酸。
51.段落41-50中任一项所述的系统(或试剂盒)，其中所述单链支点结构域具有5-50个核苷酸的长度。
52.段落41-51中任一项的系统(或试剂盒)，其中双链区域具有10-100个核苷酸的长度。
53.段落41-52中任一项所述的系统(或试剂盒)，其中所述单链发夹环具有5-50个核苷酸的长度。
54.根据段落41-53中任一项所述的系统(或试剂盒)，其中所述核酸捕获链与基底连接。
55.段落41-54中任一项的系统(或试剂盒)，其还包含至少两个部分双链的核酸。
56.段落55的系统(或试剂盒)还包含至少十个部分双链的核酸。
57.段落41-56中任一项的系统(或试剂盒)，其中至少一个部分双链的核酸与触发核酸结合。
58.段落56的系统(或试剂盒)，其中至少十个部分双链的核酸组装在与单链捕获链结合的单链触发核酸上，由此形成包含至少10个染料分子的核酸纳米结构。
实施例
实施例1
使用dna纳米结构设计元荧光团
本实施例提供了用于组装具有可编程性质的纳米尺度的元荧光团的基于核酸的平台。例如，dna折纸利用长的单链dna分子(称为“支架”)，其通过约200个短的单链dna链(称为“订书钉”)折叠成可编程形状。每个订书钉都有一个确定的顺序，并将支架的某些部分特异性结合在一起。纳米结构通常使用热退火在一锅反应中组装。在完成自组装之后，将支架“折叠”成所需的形状，其中订书钉链在最终折纸中的规定位置。
使用二维矩形dna纳米结构，其包含24个平行dna双螺旋，尺寸为90×60nm2(图1a，图5，表1和m13mp18支架序列(seqidno：185))。该纳米结构包含184个独特可寻址的订书钉链(序列如表1所示)。指定的颜色与图5所示的cadnano布局中描述的颜色相匹配。第一列表示根据cadnano布局的订书钉链的位置。第一个数字表示5’-末端所在的螺旋(y坐标)，后面的方括号中的数字表示边界与5’-末端(x坐标)之间的碱基对数量。第二对数字以类似的方式对应于3'末端。
表1：dna折纸订书钉序列
使用“柄”和“抗柄”链策略将感兴趣的染料分子附着到分子钉板上。在染料分子拟连接的位置，订书钉链用约21个核苷酸长的单链柄序列(参见表2序列)延伸。互补的单链抗柄序列用旨在与dna纳米结构连接的染料分子进行功能化(图1a)。连接到柄序列和功能化的抗柄链的订书钉链通常是一锅组装混合物的一部分。不同的靶种类可以通过使用正交柄链序列连接到折纸钉板(参见例如lin,c.naturechemistry4,832-839(2012)，通过引用并入本文)。
表2：荧光标记的单链序列。
可调亮度
dna纳米结构设计为具有规定数目的染料和染料分子，范围从6到132(图1a和图6)。每种纳米结构种类使用订书钉链混合物组装，其中含有以2.25:1摩尔比的染料标记的抗柄和柄链(参见材料和方法)。在自组装和纯化后，将元荧光团(携带8个生物素化的捕获链)固定在定制的流动室中的链霉抗生物素蛋白包被的玻璃载玻片上(参见材料和方法)。在一些情况下，元荧光团载有1-200个生物素化的链。在某些情况下，以不同的方式固定元荧光团。在一些情况下，将抗体和/或纳米抗体或适体连接到生物素和/或其它粘合剂上。
在含有约1000个dna折纸结构的约100×100μm2的区域上进行成像，并且在倒置表面荧光显微镜上使用led照明获得10秒的单次图像(参见材料和方法)。图像采集后，使用斑点检测算法来识别单个dna折纸结构(在荧光图像中出现亮点)。在随后的步骤中，在包含斑点的10×10px2区域内进行2维高斯拟合。高斯函数下的体积用作强度的度量。
在测量精度内，元荧光团显示荧光强度对染料数量呈依赖性。对于atto647n，cy3和atto488染料的线性依赖性通过使用每个结构携带多达132个染料分子的元荧光团确认(图1b-1d，图7a-7c和图8a-8c)。染料分子在纳米结构上大致等距间隔(见图示)，并且对所有种类的测量进行独立分析约10,000个纳米结构。在评估最佳采集设置之后进行所有测量(图9a-9c和图10a-10c)。
测量的荧光强度中的固有变化可能是由于染料数量上的结构间变化以及染料本身的荧光发射的随机性质引起的。从样本到样本的外在变化主要来自图像采集的差异，例如稍微不同的焦平面或光漂白。如果染料分子的荧光发射没有以完美的聚焦获得，则会收集较少的光子，因此测量的强度将会降低。为了最小化这种效果，使用自动对焦系统来保持恒定的焦距。间断重新聚焦的相同样品的重复图像采集产生约5％的平均值间变化(图11c-11c)。此外，根据染料的类型，每个图像采集“漂白”样品约0.8-2.8％(图12a-12c)。
在某些情况下，元荧光团的一个重要特征是其纳米级尺寸。当它们用于在原位设置(例如，细胞内)标记生物分子时，这可能变得尤其重要。为了工程化和构建紧密的元荧光团，染料分子必须紧密地间隔，同时防止不需要的染料间相互作用，如自淬灭。为了证明染料间相互作用主动地阻止了元荧光团，使用携带具有低标记密度(约16nm染料间距离)的14个染料分子和具有高密度(约5nm染料间距离)的14个染料分子的dna纳米结构进行实验，并比较其荧光强度分布(图1e-1g和图13a-13f)。具有低和高标记密度的atto647n-，cy3-和atto488标记的结构在测量精度内显示出相同的荧光强度。
可调颜色
如上所述，用多个正交柄链“功能化”元荧光团，该柄链进而能够结合光谱上不同的染料标记的抗柄链。接下来，设计了用atto647n，cy3，atto488或其组合标记的结构。
如果光谱上不同的荧光团紧密接近(例如，比10nm更近)，则它们可能表现出
为了在使用元荧光团中的多个荧光颜色的情况下维持规定的荧光强度，必须防止光谱上不同的染料分子之间的可能的fret。以下实验研究了fret是否发生在元荧光团中，从而限制精确设计其荧光强度和颜色的能力。研究了分别具有44个随机排列的atto647n，cy3和atto488染料分子的元荧光团设计(图2a-2c和图14a-14h)。通过比较两种不同的元荧光团(一种包含所有三种染料，一种仅含有一种荧光染料)，测试了这种随机排列。所得到的强度分布表明，atto488和cy3作为fret供体，因为它们显示含有可能的受体荧光团的元荧光团的荧光强度显著降低。相对于仅具有单一荧光颜色的对照种类，atto488和cy3染料的平均强度分别降低了50％和40％。然而，atto647n的平均荧光强度不变，因为该染料缺乏潜在的fret受体荧光团。
在随机标记的结构中fret确实可以将荧光发射强度改变多达50％的发现可能会限制独立地控制荧光颜色和强度的能力。然而，基于核酸的纳米结构(例如dna折纸)的精确可编程性允许增加光谱上不同染料的间隔，从而防止fret同时保持高标记密度和纳米级结构尺寸。
为了改善染料布局，选择三种染料种类的“柱状”排列以将fret供体和受体染料分开成空间较远的区域(图2d-f和图15a-15d)。重复如图2a-2c所示的相同实验，多色和单色种类之间的荧光强度不变，因此改进的“柱状”布局防止fret(图2d-2f)。这样可以独立调节元荧光团的亮度和颜色。
实施例2
多路标签
在确定了精确设计光物理性能(如强度和颜色)的能力后，接下来研究了这些元荧光团的潜在应用。特别地，研究了基于强度和颜色组合的作为多路标记的元荧光团的性能。可编程的元荧光团的一个重要特征是其作为用于高度多路靶检测的标记探针的有用性。
由于随机光子发射、不完全标记和不完全的倒数第结合，对于确定数量的染料分子，元荧光团显示出有限的强度分布(图3a)。如果将两个不同条形码水平(或每个结构的染料分子数量)的强度分布设计为没有重叠，则每个测量的强度值可以明确地分配给特定的条形码。
不同条形码种类n的数量按n＝ab进行缩放，其中b是光谱上不同颜色的数量，以及a是每个颜色可区分的强度水平的数量。
在可用于修饰和三个不同的染料的最大数量的132个订书钉链的情况下，每个结构的每个颜色的染料分子数量最多为132/3＝44。使用标准的倒置荧光显微镜可以强烈检测到的染料分子最小数量是约6。
通过测量不同数量的染料在元荧光团上的强度分布的宽度，确定了用于条形码应用的总共四个非重叠水平，分别对应于6、14、27和44个染料分子(图16a-16c)。使用三种光谱上不同的染料和五种强度水平(包括0)的组合标记在此处提供的示例设计的情况下允许最多为53-1＝124个条形码，。
首先，测试了设计、制造和强力识别所有124种可能的条形码的能力。在条形码的自组装和纯化之后，将条形码汇集并固定在链霉抗生物素蛋白修饰的流动室中(图3b和3c)。按顺序进行图像采集，从最长波长开始，随后对较短波长进行成像，以使光漂白最小化。如上所述，分别对每个颜色通道进行数据分析(例如，斑点检测和强度测量)。在图像分析期间，每个检测到的斑点(因此条形码)被分配了每个颜色的坐标和相应的强度值。将共定位斑点合并并分配到相同的元荧光团。
为了识别具有特定条形码识别的元荧光团，将测量的强度值与参照表进行比较，以便分配正确的条形码水平。可以通过创建所有测量的强度值的直方图来获得每个样本采集的新参照表(图16a-16c)。这有利于对样品性能进行“实时”检查。相邻分布的重叠是条形码化性能的重要量度，因为它表示不能明确地分配至特定条形码水平的强度水平。为了量化该重叠并丢弃相应的条形码，将高斯函数拟合到每个强度分布上。计算相邻高斯的交点，随后用于确定重叠区域。
制作和识别一个样品中所有可能的124个条形码的能力如图3d所示。条形码计数的变化是由于不同的纳米结构浓度引起的，这可能在其折叠和纯化过程中引入。
为了对元荧光团的条形码化性能进行基准测试，对条形码子集进行了研究，并引入了以下量度。从所有检测到的元荧光团中，具有有效强度值(例如，重叠强度分布的外部水平)的那些是合格的条形码。由于条形码子集被测量，这些合格的条形码可能由两个子群组成：期望的(或正确的)条形码和非期望的(或假阳性的)条形码。因此，信噪比(或snr)被定义为<期望的>/<非期望的>。这些量度在一起确定了条形码系统的整体性能。
第一个子集包含25个随机选择的条形码(图3e和表3)。测量了2,155个点，其中13.5％被丢弃为具有在重叠区域内的强度值的不合格条形码。丢弃的点包括错误折叠的结构以及包括多个条形码的点(例如，间隔比成像系统的空间分辨率更近)。对于这个该25-条形码子集，期望有87.4％的合格条形码。这里，确定了27的snr。大量的假阳性是具有低荧光强度的单色条形码(例如，被鉴定为“6-0-0”，“0-6-0”或“0-0-6”)。不受理论束缚，这可能是由荧光表面杂质产生的假象。
如果不需要最大多路复用容量，则可以设计具有更高性能的更鲁棒的条形码集。这可以通过减少强度水平的数量来实现，从而使它们进一步间隔开，从而减少重叠的强度分布。另外，仅使用三色条形码使得检测和识别更加鲁棒(例如，允许拒绝单色和双色斑点)。
例如，可以使用元荧光团设计来构建总共64个三色条形码。这些条形码通过获得12个结构的子集进行了基准测试(图3f和表3)。在这里，检测到512个斑点，92.5％为合格条形码，其中95.4％为期望的条形码。snr确定为90。
表3.25/124强度条形码子集
可以通过排除两个条形码水平并将剩余水平(例如，0、14和44染料分子)进一步间隔开来构建更鲁棒的条形码。此外，条形码包含至少两种颜色，因此最多可以实现20种可区分的条形码。以100％的合格比率测量5种条形码的子集(n＝664)，例如，所有检测到的点都被确定为有效的条形码(图3g和表4)。这里只计数了3个假阳性，产生99.6％的期望条形码。
假阳性可能被低估。由于所识别的条形码也可能是所使用的子集的一部分，所以可能不经意地对某个点进行了假的识别。因此，较小的子集可以产生更高的识别精度。
表4.12/64强度条形码子集
表5：5/20强度条形码子集
基于核酸的自组装纳米结构(被称为元荧光团)可以认为是一种具有数字可调光学特性的新型染料，在任意规定的强度水平情况下数百倍更亮，并且具有数字可调的“颜色”。本文提供的结果证明了基于核酸的纳米结构的高标记密度(约5nm染料间距离)，同时防止自淬灭。此外，对纳米结构上的染料位置的精确的空间控制允许构建纳米尺度的多色元荧光团，其中防止光谱上不同的染料之间的fret。
结合这些可编程特征，构建了124个独特的强度条形码用于高含量成像。证明了该方法的可行性，对体外表现进行了基准测试，并且显示出高特异性、鉴定准确性和低假阳性率。
除了基于表面的显微镜应用之外，元荧光团的高亮度、小尺寸和高多路复用能力的组合使得它们成为用于高通量鉴定的应用诸如流式细胞术和荧光相关光谱(fcs)的理想探针。通过使用最近开发的单链瓦组装方法(wei,b.,等人nature485,623-626(2012)；ke,y.,等人science338,1177-1183(2012)；myhrvold,c.,等人nanoletters13,4242-4248(2013)，通过引用并入本文)，本公开内容的元荧光团可以扩展到甚至更小尺寸的结构。此外，元荧光团可以容易地增加用于当前超分辨率技术56(例如(非线性)结构照明显微镜(sim)57)的信号强度和多路复用。
最后，基于触发组装的元荧光团可能特别有助于提高定量单分子fish应用中的信噪比和标记效率。
实施例3
触发组装
从“干净”的体外环境转移到原位细胞标记应用带来了更多的挑战。虽然由非原位自组装核酸结构制成的多色的元荧光团的尺寸是纳米级的，但它们仍然比单一的小分子标记如单一染料或核酸链大得多。由于这对于体外应用仍然是可接受的(这里主要限制由扩展结构的扩散速度引起的反应动力学)，它可能在原位应用(例如在密集的细胞环境中标记小蛋白质或核酸)中具有重大影响。另外，预组装的条形码与细胞成分的可能的非特异性相互作用可能导致假阳性。
为了克服这两个挑战，本文提供了一种在靶检测时触发元荧光团自组装的方法。使用短荧光标记的亚稳态发夹，只有当存在作为触发剂的靶分子时，其才能组装成有限的三角结构(图4a和表6)。证明了使用触发链的定义尺寸(10个染料)三角形元荧光团的体外触发组装，通过染料标记的捕获链固定在玻璃表面上。
首先，将alexa647标记的和生物素化的捕获链和触发链退火并固定在bsa-生物素-链霉抗生物素蛋白涂覆的玻璃表面上。第二，将cy3标记的亚稳发夹流入并孵育60分钟。最后，携带44个atto488和10个cy3标记的链的基于dna纳米结构的元荧光团作为强度参照结合到表面。
通过顺序记录alexa647，cy3，atto488通道进行图像采集(图4b)。alexa647和cy3通道中的共定位表示三角形，而atto488和cy3共定位表示纳米结构参照。
为了对三角形的形成性能进行基准测试，将折纸参照结构的强度与cy3通道中三角形的强度进行比较(图4c)。高斯拟合两个强度分布显示出几乎完美的重叠，平均值间差异小于2％，表明预期的三角形的形成。通过形成凝胶测定法进一步证实在触发存在情况下三角形的形成和在触发不存在情况下发夹的亚稳定性。
如本文提供的触发的元荧光团组装方法相对于现有的组装方法具有几个优点。例如，与单分子荧光原位杂交(smfish)相比，例如通过使用用于编程现场复杂结构组装的转导剂(引发剂)分子，元荧光团的可编程性可以在靶部位组装更复杂的结构。不同于产生未指定长度的线性聚合物结构的杂交链反应方案(hcr)，使用如本文提供的触发组装方法形成精确限定的尺寸和形状的结构。另外，不同于使用大量独特单体种类的限定尺寸结构的组装的先前方法，在一些实施方案中，本文中的方法仅使用一种单体种类，并且元荧光团的最后的尺寸和形状由触发链的长度控制。与杂交链反应(hcr)相比，例如，元荧光团定义的大小和由此受控的强度导致更高的多路复用能力。
表6.触发的组装序列。
实施例4
超灵敏、定量和多路核酸检测。
下面描述在多路体外核酸检测测定中实施元荧光团。每个核酸靶(这里是8条合成的dna链)与一个元荧光团相连。通过将八个生物素化的订书钉(先前用于将元荧光团附着到表面上)替换为在5'端延伸有靶互补21nt长序列的八个订书钉，所选择的元荧光团被编程以特异性地结合靶。为了在显微镜载玻片上检测靶-元荧光团双链体-与图3a-3f的实验相当，引入与靶上第二个21nt区域互补的生物素化dna链('捕获链')(参见图22a和22b)。将三种组分在杂交缓冲液中组合并孵育24小时(参见材料和方法)。使用浓度为1nm的生物素化捕获链和每个靶约250pm的元荧光团。以不同的量加入靶以证明精确的定量和灵敏度(图22c)。孵育后，如前所述将混合物加入到链霉抗生物素蛋白包被的流动室中，并孵育10分钟。随后洗涤并密封腔室。使用扫描共聚焦显微镜进行数据采集，以证明可以以鲁棒的方式独立地鉴定出这些元荧光团。
为了评估该核酸检测平台的精确度和灵敏度，设计了八个捕获-靶-绿色荧光三联体，并将不同量的六个靶加入到反应中。剩下的两个靶没有被添加，因此，像以前一样指示假阳性。检测到的三联体的数量与初始靶浓度成正比，因此可以相对量化靶。图22c显示了初始浓度为13.5pm，4.5pm和1.5pm的靶的成功检测和精确定量；后者对应的靶量只有约100fg。使用具有同等浓度的靶的校准样品校正了计数的元荧光团的数量，以最小化差异初始浓度的影响。
实施例5
另外的可编程的元荧光团性质。
除了亮度和颜色之外，还可以使用额外的染料性能来扩展元荧光团的可编程性。这通过用显示所需性质的荧光分子集合进行的元荧光团的受控制的修饰来实现。合适的染料性质包括例如荧光寿命，光活化和转换的能力以及光稳定性。这些参数可以独立调整，与亮度和颜色相似，从而呈现可编程性的附加正交轴。这对于多路复用标签特别有价值，因为明确标签的数量随独立参数的幂而变化。
在这里，基于染料的光稳定性区分和鉴定了元荧光团。设计了含有两种具有相似发射光谱的染料，但在我们的成像条件下具有不同光稳定性的元荧光团。选择atto647n作为具有较慢漂白常数(更稳定的)的染料，并且alexa647作为具有更快的漂白常数(较少的光稳定性)的染料。在时间推移图像采集实验中，含有alexa647染料的元荧光团比具有atto647n染料的元荧光团更快漂白。随着荧光强度指数下降，测量衰减常数，然后将其用作光稳定性的参数。
图21a示出了一种样品中两种类型的元荧光团的时间推移系列图像，其中一个种类比另一个种类更快地漂白。可以在多维图中识别含有多个正交性质的元荧光团(图21b)。例如，可以绘制漂白(或衰减)常数相对荧光强度的图。可以容易地分离和识别对应于不同的元荧光团构型的不同群体(图21b)。衰减常数的一维直方图(图21c)清楚地表明，光稳定性可以用作正交可调的元荧光团性质，类似于上面讨论的强度。
实施例6
强度条形码化是用于在荧光显微镜中多路复用应用的强大工具。然而，条形码的总量受到光谱上不同颜色的可用性的限制。为了解决这个限制，引入了另外的基于漂白动力学的“虚拟”颜色。漂白进一步使得能够将fret用于编码强度标志中的染料布置，进一步提高多路复用能力。使用漂白动力学作为附加的条形码化轴直接适用于强度条形码。
漂白条形码
可以通过改变与dna纳米结构结合的荧光团的量来构建强度条形码。如图18a中的示意图所示，荧光团的定义数量产生不同的强度水平，因此测量的强度可以仅归因于一个群体。这是在相邻强度水平之间不存在重叠的情况。引入光谱上不同的染料和强度水平的组合标记，可以产生大量可区分的结构。可能的条形码的量|x|作为每种颜色的可能的强度水平i和颜色c的所有组合(图18b)。
|x|＝ic
对于三种颜色和每种颜色的四种强度水平，可以构建43＝64个条形码。为了增加条形码数量，创建了基于漂白动力学的“虚拟颜色”。
荧光团漂白
荧光团在经受荧光发射的同时可以在其激发能量状态中被化学破坏。它们因此失去了发荧光的能力：它们变得光漂白。由于这种荧光衰减是染料特异性的，可以通过其漂白速率来表征不同的染料类型。当记录和平均多个荧光团的时间依赖性荧光强度时，可以确定这些速率。由于漂白是一个随机过程，因此不可能通过观察单一的染料漂白事件来分配精确的漂白率。
通过将其在dna纳米结构中紧密放置，可以将一个衍射极限点中的个体荧光强度相加。所得到的时间过程是染料特异性的，并且可以用于引入用于条形码化目的的另外的“虚拟”颜色，如图18c所示。因此，染料可以是光谱重叠的，但仍然通过其漂白速率来区分。
fret
漂白动力学的应用也可用于利用fret相互作用。如已经观察到的那样，紧密靠近的染料对可能容易出现fret。使用染料的“光漂白”将使fret具有时间依赖性。因此，可以在纳米结构内对几何信息进行编码和解码，同时仍然仅观察衍射受限的“无结构”点。
图19a示出了纳米结构上的染料分子的可能布置，描绘了“伪几何”编码。预期的fret-标志取决于具有fret-配偶体的染料数量。随着fret对数量的增加，供体通道中的信号将减少，而当没有fret对存在时，信号将不变。由于fret可以在多种颜色之间发生，因此可以进行几种重叠布置(图19b)。当组合不同的组大小(强度水平)时，可以进一步增加可能的布置的数量，因为供体染料可能具有多个受体染料。图19c示出当组合低与高强度水平时，与供体染料紧密靠近的多至三种受体染料的变化。虽然alexa647染料(深灰色)的衰减对于所有不同的结构保持不变，但cy3(浅灰色)通道强度增加的时间过程变化。对于更多的受体配偶体，由于所有的受体染料都需要首先漂白，因此供体通道的增加会延迟。因此，可以对结构中的几何信息进行编码，并进一步增加条形码量。
实施例7
用于检测小靶标的多路复用条形码
基于强度的条形码具有高多路复用能力，而不依赖于空间分辨率，几何信息或延时记录。因此，它们通常理想地用于高通量技术，如流式细胞术，荧光相关光谱(fcs)和宽视野显微术中。
如果条形码不仅需要识别，还要检测靶分子，那么它们必须明确地指示靶的阳性检测。对于基于表面的检测或原位研究，通过洗涤步骤后条形码的存在来指示靶的阳性检测。然而，这不适用于基于高通量解决方案的技术。在这种情况下，靶的检测应该产生条形码的激活和/或切换。
这种激活和/或切换可以通过在检测到靶分子时触发两个条形码的双链体形成来实现。与条形码单体区别的样品溶液中的条形码二聚体的检测表明在下面的溶液中存在靶分子。通过识别条形码，可以识别靶种类。
双链体形成
双链体形成机制取决于靶。本文所述的机理基于核酸检测。
如果靶是具有已知序列的长(例如，30个核苷酸或更长)单链核酸(例如，dna或rna)，条形码将各自具有一个或多个具有与已知靶序列的区域互补的序列的柄。如果靶链存在于样品溶液中，它将最终连接两条条形码并形成二聚体(图18a)。
如果靶链太短而无法稳定地连接两个条形码柄(例如，短于30个核苷酸)，则可能需要额外的步骤。在发夹构象中的每个靶的辅助核酸链存在于溶液中。这种辅助链具有特异性识别靶链的支点，并且在检测时打开发夹。现在打开的发夹显示两个先前隔离的结合结构域，其允许结合两个相应的条形码(图18b)。
辅助链可以是条形码柄之一的一部分。靶的结合打开发夹并显示随后结合二聚体报告物的结构域(图18d)。
条形码类型
条形码是基于强度的。取决于检测方法，例如，它们可以是基于比率的或者使用绝对强度。较小的条形码可能具有更快的扩散速率，因此使标记更有效率。高条形码浓度可能也会如此。条形码应具有足够的信号强度，以便所需仪器的检测。它们应具有足够的用于所需靶标池的多路复用能力。此外，条形码应该用靶序列进行特异性标记。
可用于二聚化的可能的条形码包括基于dna的元荧光团，量子点和荧光珠。二聚体报告物(见下文)另外包括纳米颗粒(例如金，银和金刚石)和磁珠。
两个条形码种类
在一些实施方案中，优选使用两个不同的条形码种类。一个种类可用于鉴定靶(“识别条形码”)，第二个靶表明成功的二聚化(“二聚体报告物”)(图18c)。识别条形码可以具有两种颜色(例如，红色和蓝色)，从而允许组合强度条形码化。每个靶可以对应于由特定条形码柄序列检测的一个条形码。二聚体报告物可以使用识别条形码未使用的单一颜色(例如绿色)。在检测到所有三种颜色时(例如，在单个斑点中，在单个时间点)，识别二聚体，并且通过分析条形码颜色来识别靶。
流式细胞术
流式细胞术特征在于高通量的细胞、液滴和珠粒。通过足够大的条形码或仪器的足够的分辨率，二聚体可以通过前-和侧-散射而可视化，而不依赖于荧光。在这样的实施方案中，整个荧光光谱可用于条形码。报告物二聚体可以是散射的非荧光纳米颗粒(例如，金颗粒)。结合来自识别条形码的阳性荧光信号，检测二聚体和从而检测靶。
荧光相关光谱(fcs)
fcs和交替激光激发(alex)允许以良好的统计学快速探测靶溶液。如本文所提供的，单体必须是发荧光且小的以便快速扩散。fcs/alex可以检测基于核酸纳米结构的单条形码双链体，即使只附着少量染料分子。
蛋白质检测
如果靶足够大，则它本身可以作为二聚体报告物。
珠和条形码
如果二聚体报告物是大的微球或磁珠，报告物可以在反应后容易地从溶液中回收。未二聚化的条形码将保留在溶液中。在珠的表面沉积之后，可以读出附加的条形码(无论存在于何处)，从而可以鉴定出链可以被识别。
定量
靶浓度的估计可以通过在溶液中具有确定浓度的已知靶链和比较产率来进行。二聚体/单体比率也可以指示浓度。
考虑到条形码过量，检测到的靶的比率必须与探针溶液中的靶比率相对应。
材料和方法
材料
未经修饰的dna寡核苷酸购自integrateddnatechnologies。荧光修饰的dna寡核苷酸购自biosynthesis。链霉抗生物素蛋白购自invitrogen(目录号：s-888)。生物素标记的牛白蛋白(bsa-生物素)得自sigmaaldrich(目录号：a8549)。载玻片和盖玻片从vwr购买。m13mp18支架获自newenglandbiolabs。从bio-rad订购了“freezensqueeze”柱。
两个缓冲液用于样品制备和成像：
缓冲液a(10mmtris-hcl，100mmnacl，0.05％tween-20，ph8)。
缓冲液b(5mmtris-hcl，10mmmgcl2，1mmedta，0.05％tween-20，ph8)。
dna折纸自组装
以总体积为20μl在含有折叠缓冲液(1×tae缓冲液，12.5mmmgcl2)中的10nm支架链(m13mp18)、100nm折叠订书钉和150nm生物素化链、具有染料-柄延伸的100nm链和225nm荧光标记的抗柄的一锅反应中进行自组装。将溶液加热至65℃进行5分钟，随后在1小时内冷却至4℃。通过琼脂糖凝胶电泳(1.5％琼脂糖，具有12.5mmmgcl2的1×tae缓冲液)以4.5v/cm在冰上纯化dna折纸1.5小时。将凝胶带切割，粉碎并填充到“freeze‘nsqueeze”柱中，并在4℃下以1000×g旋转5分钟。
显微镜样品制备
用异丙醇清洗盖玻片(no.1.5,18×18mm2,≈0.17mm厚)和显微镜载玻片(3×1英寸2,1mm厚)。流动室是通过在盖玻片和载玻片之间夹住两条双面粘性带而制成的，产生约20μl体积的通道。将通道与缓冲液a(10mmtris-hcl，100mmnacl，0.05％tween-20，ph8)中的20μl1mg/mlbsa-生物素溶液孵育2分钟。随后用40μl缓冲液a洗涤室，然后与缓冲液a中的20μl0.5mg/ml链霉抗生物素蛋白溶液孵育2分钟。接下来，通过用40μl缓冲液a洗涤室，然后用40μl缓冲液b(5mmtris-hcl，10mmmgcl2，1mmedta，0.05％tween-20，ph8)洗涤室来进行缓冲液交换。最后，加入20μl具有约300pmdna折纸元荧光团的缓冲液b，孵育2分钟，然后用40μl缓冲液b洗涤。最后，在成像前用环氧树脂密封腔室。
在表面上的触发组装
在即将在具有12.5mmmgcl2与0.05％吐温20的1×tae中以1μm加入样品之前，在热循环仪中对捕获(cap)和触发(t)链进行退火(85℃5分钟，梯度为15分钟的从85℃至10℃)。在即将在具有12.5mmmgcl2的1×tae中以1μm加入样品之前，在热循环仪中对发夹(hp)链退火(85℃5分钟，梯度为15分钟的从85℃至10℃)。用三层胶带制备流动室(见上文)，产生约60μl的体积。然后将该室用缓冲液a中的60μl1mg/mlbsa-生物素溶液孵育2分钟，然后用120μl缓冲液a洗涤。接下来，将室用缓冲液a中的60μl0.5mg/ml链霉抗生物素蛋白溶液孵育2分钟，然后用120μl缓冲液a进行洗涤步骤。随后，通过加入120μl缓冲液c(具有12.5mmmgcl2与0.05％tween-20的1xtae)进行缓冲液交换。然后加入具有25pm退火的cap-t双链体的60μl缓冲液c并孵育1分钟。用120μl缓冲液c洗涤室，并用60μl100pmdna折纸标准物孵育2分钟。用120μl缓冲液c洗涤后，加入60μl具有30nm退火hp的缓冲液c。20分钟后，该室用120μl缓冲液c洗涤。hp孵育重复3次。最后，用120μl缓冲液c洗涤该室，并在成像之前用环氧树脂密封。
在溶液和凝胶测定中的触发组装
在一锅反应中进行用用于凝胶测定的三角形的触发组装。以不同的化学计量比加入捕获链(cap)，触发链(t)和荧光标记的发夹(hp)，总体积为40μl。cap链的终浓度为100nm，t链为110nm，hp链为550nm(5x)、1.325μm(12x)或2.2μm(20x)。将链用具有12.5mmmgcl2的1xtae稀释。将hp链在热循环仪中进行退火，然后立即在具有12.5mmmgcl2的1×tae中以10μm加入至触发组装反应(85℃5分钟，梯度为15分钟的从85℃至10℃)。对照样品不含t链，而含有1.325μm(12x)的hp链。在低保留pcr管中在30℃或24℃下进行各自2小时的组装。
使用2％琼脂糖凝胶在具有12.5mmmgcl2的1xtae中，在冰上以4.5v/cm进行凝胶电泳3小时。凝胶用typhoon扫描仪扫描。
图像采集参数
图1，2，3和20a：10s积分时间和60％led功率。图20b：5s积分时间和60％led功率。衰变常数通过获得一系列的10个连续帧并用单指数衰减函数拟合强度相对时间来确定。
多路复用核酸检测
在基于ssc的杂交缓冲液(4xssc，5xdenhardt's溶液，5％硫酸葡聚糖，0.1％吐温20，0.1毫克/毫升鲑鱼精dna)中，在室温下进行孵育。流动室体积设计为约5μl。数据采集在zeisslsm780共焦显微镜上进行。
光学设置
在具有确定焦点和zeisscolibriled照明系统(atto488：470nm，cy3：555nm，atto647n：625nm)的zeissaxioobserverz1倒置荧光显微镜上进行基于dna折纸的元荧光团成像。使用zeissplan消色差(63x/1.40油)浸油物镜和hamamatsuorca-flash4.0scmos照相机。
atto488:zeiss滤光组38:(bp470/40,ft495,bp525/50)。
cy3:zeiss滤光组43(bp545/25,ft570,bp605/70)。
atto647n:zeiss滤光组50(bp640/30,ft660,bp690/50)。
使用具有油浸物镜(cfiapotirf100×，数值孔径(na)1.49，油)的nikontirf照明器，在倒置nikoneclipseti显微镜上进行触发组装成像。
激光器：488nm(标称200mw，coherentsapphire)，561nm(标称200mw，coherentsapphire)和647nm(标称300mw，mbpcommunications)。
相机：ixonx3du-897emccd(andortechnologies)
激发滤光器：(zt488/10，zet561/10和zet640/20，chromatechnology)
多频段分束器：(zt488rdc/zt561rdc/zt640rdc，chromatechnology)
发射滤光器：(et525/50m，et600/50m和et700/75m，chromatechnology)
斑点检测，强度分析(软件)
图像采集后，使用定制的labview脚本[ref2014natmeth]进行斑点检测。斑点检测导致坐标列表，它被馈送到基于matlab的强度分析脚本中。在这里，围绕中心点的10x10px2区域内拟合2d高斯。2d高斯的体积与光子计数成比例，从而被定义为强度。最后，获得具有空间坐标和相应强度值两者的分子列表。
条形码识别(软件)
所有强度值都绘制为直方图，局部最大值(峰值)用高斯拟合。基于这些拟合的交点，可以确定不同的强度水平间隔。
必须识别两个峰之间的重叠区域，并且具有相应强度的条形码必须被分类为不合格。为了识别两个峰之间的重叠间隔，确定相应拟合的交点高度(x计数)。通过以其交点高度的一半(x/2计数)确定两个高斯的交点，定义重叠间隔。
在去除不合格强度的斑点后，分子列表中的强度值被替换为条形码水平指标。通过组合来自三个分子列表(对应于三个记录的颜色)的斑点来识别各个条形码，其非常接近(即<500nm)。
触发组装(软件)
通过如上所述确定斑点坐标和斑点强度来进行触发组装评估。alexa647和cy3斑点的共定位分组为三角形(浅灰色)和atto488和cy3共定位为dna折纸(深灰色)。将两个组合在一起作图导致图4c。
附加序列
m13mp18支架序列：
ttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtgacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaatgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttaaatatttgcttatacaatcttcctgtttttggggcttttctgattatcaaccggggtacatatgattgacatgctagttttacgattaccgttcatcgattctcttgtttgctccagactctcaggcaatgacctgatagcctttgtagatctctcaaaaatagctaccctctccggcattaatttatcagctagaacggttgaatatcatattgatggtgatttgactgtctccggcctttctcacccttttgaatctttacctacacattactcaggcattgcatttaaaatatatgagggttctaaaaatttttatccttgcgttgaaataaaggcttctcccgcaaaagtattacagggtcataatgtttttggtacaaccgatttagctttatgctctgaggctttattgcttaattttgctaattctttgccttgcctgtatgatttattggatgttaatgctactactattagtagaattgatgccaccttttcagctcgcgccccaaatgaaaatatagctaaacaggttattgaccatttgcgaaatgtatctaatggtcaaactaaatctactcgttcgcagaattgggaatcaactgttatatggaatgaaacttccagacaccgtactttagttgcatatttaaaacatgttgagctacagcattatattcagcaattaagctctaagccatccgcaaaaatgacctcttatcaaaaggagcaattaaaggtactctctaatcctgacctgttggagtttgcttccggtctggttcgctttgaagctcgaattaaaacgcgatatttgaagtctttcgggcttcctcttaatctttttgatgcaatccgctttgcttctgactataatagtcagggtaaagacctgatttttgatttatggtcattctcgttttctgaactgtttaaagcatttgagggggattcaatgaatatttatgacgattccgcagtattggacgctatccagtctaaacattttactattaccccctctggcaaaacttcttttgcaaaagcctctcgctattttggtttttatcgtcgtctggtaaacgagggttatgatagtgttgctcttactatgcctcgtaattccttttggcgttatgtatctgcattagttgaatgtggtattcctaaatctcaactgatgaatctttctacctgtaataatgttgttccgttagttcgttttattaacgtagatttttcttcccaacgtcctgactggtataatgagccagttcttaaaatcgcataaggtaattcacaatgattaaagttgaaattaaaccatctcaagcccaatttactactcgttctggtgtttctcgtcagggcaagccttattcactgaatgagcagctttgttacgttgatttgggtaatgaatatccggttcttgtcaagattactcttgatgaaggtcagccagcctatgcgcctggtctgtacaccgttcatctgtcctctttcaaagttggtcagttcggttcccttatgattgaccgtctgcgcctcgttccggctaagtaacatggagcaggtcgcggatttcgacacaatttatcaggcgatgatacaaatctccgttgtactttgtttcgcgcttggtataatcgctgggggtcaaagatgagtgttttagtgtattcttttgcctctttcgttttaggttggtgccttcgtagtggcattacgtattttacccgtttaatggaaacttcctcatgaaaaagtctttagtcctcaaagcctctgtagccgttgctaccctcgttccgatgctgtctttcgctgctgagggtgacgatcccgcaaaagcggcctttaactccctgcaagcctcagcgaccgaatatatcggttatgcgtgggcgatggttgttgtcattgtcggcgcaactatcggtatcaagctgtttaagaaattcacctcgaaagcaagctgataaaccgatacaattaaaggctccttttggagccttttttttggagattttcaacgtgaaaaaattattattcgcaattcctttagttgttcctttctattctcactccgctgaaactgttgaaagttgtttagcaaaatcccatacagaaaattcatttactaacgtctggaaagacgacaaaactttagatcgttacgctaactatgagggctgtctgtggaatgctacaggcgttgtagtttgtactggtgacgaaactcagtgttacggtacatgggttcctattgggcttgctatccctgaaaatgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggttctgagggtggcggtactaaacctcctgagtacggtgatacacctattccgggctatacttatatcaaccctctcgacggcacttatccgcctggtactgagcaaaaccccgctaatcctaatccttctcttgaggagtctcagcctcttaatactttcatgtttcagaataataggttccgaaataggcagggggcattaactgtttatacgggcactgttactcaaggcactgaccccgttaaaacttattaccagtacactcctgtatcatcaaaagccatgtatgacgcttactggaacggtaaattcagagactgcgctttccattctggctttaatgaggatttatttgtttgtgaatatcaaggccaatcgtctgacctgcctcaacctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttccggtggtggctctggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttggcgctggtaaaccatatgaattttctattgattgtgacaaaataaacttattccgtggtgtctttgcgtttcttttatatgttgccacctttatgtatgtattttctacgtttgctaacatactgcgtaataaggagtcttaatcatgccagttcttttgggtattccgttattattgcgtttcctcggtttccttctggtaactttgttcggctatctgcttacttttcttaaaaagggcttcggtaagatagctattgctatttcattgtttcttgctcttattattgggcttaactcaattcttgtgggttatctctctgatattagcgctcaattaccctctgactttgttcagggtgttcagttaattctcccgtctaatgcgcttccctgtttttatgttattctctctgtaaaggctgctattttcatttttgacgttaaacaaaaaatcgtttcttatttggattgggataaataatatggctgtttattttgtaactggcaaattaggctctggaaagacgctcgttagcgttggtaagattcaggataaaattgtagctgggtgcaaaatagcaactaatcttgatttaaggcttcaaaacctcccgcaagtcgggagg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在本说明书和权利要求中使用的不定冠词“一个”和“一种”除非明确指出相反，应理解为“至少一个/种”。
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