一种检测农作物中三唑酮残留的试纸及其应用、制备方法与流程

本发明涉及一种检测农作物中三唑酮残留的试纸及其应用、制备方法，属于三唑酮检测技术领域。

背景技术：
三唑酮(Triadimefon)，1-(4-氯苯氧基)-3,3-二甲基-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-α-丁酮，是一种高效、低毒、低残留、持效期长、内吸性强的三唑类杀菌剂。被植物的各部分吸收后，能在植物体内传导，对锈病和白粉病具有预防、铲除、治疗、熏蒸等作用。在实际生产上三唑酮用途广泛，常被用来治疗农作物白粉病和其他真菌病害。由于三唑酮对人体有害，因此各国对三唑酮的残留限量制定了严格的标准。例如烟草中制定了中三唑酮最高残留限量为5mg/kg。从现有技术和相关检测标准看，目前针对三唑酮残留的检测方法主要是仪器方法，最常用的方法是GC-MS，仪器方法具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员，所以限制了其应用。因此，寻求成本低廉、更为快速的检测手段，具有重要的现实意义。

技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是：提供一种检测农作物中三唑酮残留的试纸及其应用、制备方法，具有操作简便、灵敏度高、成本低、制作方便，检测时间短等优点，可以克服现有技术的不足。本发明的技术方案是：一种检测农作物中三唑酮残留的试纸，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有三唑酮偶联抗原的检测线（T线）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线），所述结合物释放垫包被有三唑酮单克隆-胶体金标记物。所述三唑酮偶联抗原是由三唑酮半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白。所述三唑酮单克隆抗体-胶体金标记物是将三唑酮单克隆抗体加入胶体金中得到，其中所述胶体金是由柠檬酸三钠与氯金酸反应制取得到。所述三唑酮单克隆抗体是用三唑酮半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，然后将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选得到。所述三唑酮半抗原是由三唑酮与盐酸羟胺在固体氢氧化钾作催化剂存在下回流得肟产物，肟产物再与马来酸酐反应得到，其分子结构式为：。所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，其中所述结合物释放垫1/3-1/2被覆盖于样品吸收垫下。本发明还提供一种制备上述试纸的方法，其包括以下步骤：1）制备包被有三唑酮单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；2）制备具有包被有三唑酮偶联抗原的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸。具体地说，步骤包括：1）半抗原制备：三唑酮与盐酸羟胺在固体氢氧化钾作催化剂存在下回流得肟产物，肟产物与马来酸酐在吡啶或三乙胺催化下进行反应，获得半抗原；2）将三唑酮半抗原与载体蛋白偶联，得到三唑酮半抗原-载体蛋白偶联物，即三唑酮偶联抗原；3）用三唑酮半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到三唑酮单克隆抗体；4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；5）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；6）将步骤3）制备的三唑酮单克隆抗体加入步骤5）制备的胶体金中，得到三唑酮单克隆抗体-胶体金标记物；7）将三唑酮单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合物释放垫上，37℃烘60min后取出，密封并置于干燥环境中保存备用；8）三唑酮半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线（T线），并将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线（C线）；9）将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（体积百分含量）、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；10）在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，密封包装，4-30℃条件下可保存12个月。本发明另外还提供一种应用上述试纸检测农作物中三唑酮残留的方法，它包括步骤：（1）样品前处理；（2）用试纸进行检测；（3）分析检测结果。本发明的有益效果是：本发明的三唑酮快速检测试纸采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将三唑酮单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的三唑酮，在流动过程中，先与结合物释放垫上的三唑酮单克隆抗体-胶体金标记物，形成药物-抗体-胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的三唑酮偶联抗原物竞争结合三唑酮单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中三唑酮残留量。经发明人测试，本发明试纸对新鲜烟叶检测限为0.6mg/kg，干烟叶为3mg/kg。检测时，样品经处理后滴入试纸卡孔内，当三唑酮，在样品中的浓度低于检测限或为零时，三唑酮单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的三唑酮半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线（T线）和质控线（C线）内各出现一条红色条带；如果三唑酮在样品中的浓度等于或高于检测限，三唑酮单克隆抗体-胶体金标记物会与三唑酮全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与三唑酮半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。如图3所示。阴性：当质控线（C线）显示出红色条带，检测线（T线）同时也显示出红色条带，判为阴性。阳性：当质控线（C线）显示出红色条带，而检测线（T线）不显色，判为阳性。无效：当质控线（C线）不显示出红色条带，则无论检测线（T线）显示出红色条带与否，该试纸判为无效。本发明的试纸具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合面广、储存简单、保质期长的优点，是理想的快速筛选手段，能够更好地满足现场快速检测的要求。用本发明试纸检测三唑酮残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用，特别适合用于烟草中三唑酮残留的定性及半定量检测。附图说明图1：三唑酮半抗原合成路线图；图2：试纸剖面结构示意图；图3：试纸检测结果判定图。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。实施例1三唑酮检测试纸的制备该试纸的制备方法主要包括以下几个步骤：1）制备包被有三唑酮单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫2；2）制备具有包被有三唑酮偶联抗原的检测线5和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线6的反应膜3；3）将1）和2）制备好的结合物释放垫2、反应膜3与样品吸收垫1、吸水垫4和PVC底板7组装成试纸。下面分步详细叙述：1、三唑酮半抗原的制备三唑酮与盐酸羟胺在固体氢氧化钾作催化剂存在下回流得肟产物，肟产物再与马来酸酐在吡啶或三乙胺催化下进行反应，得半抗原如下，反应按图1方程式进行。2、免疫原制备三唑酮半抗原与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到免疫原。具体方法为：称取以上半抗原40.6mg，分别溶解于3mLN,N-二甲基甲酰胺溶液，分别加入NHS/EDC混合水溶液，活化16小时；活化后溶液分别加入到BSA溶液中（含BSA220mg），调pH9左右，室温反应24小时，转到透析袋中于PB溶液中透析3天，每天早晚换液。得到三唑酮免疫原，将所得免疫原注入到小鼠/兔子进行免疫反应，得到三唑酮结构的抗体。3、三唑酮单克隆抗体的制备方法（1）动物免疫将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。（2）细胞融合和克隆化小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌三唑酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株。细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射稳定的单克隆杂交瘤细胞株5×105个/只，7天后...