一种蚜虫胚胎观察处理方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蚜虫胚胎观察处理方法。

背景技术：

蚜虫是一个典型的研究生态学、发育学和进化学问题的模式昆虫类群，尤其2010年国际蚜虫基因组联盟对豌豆蚜全基因组序列测定后，为进一步研究进化生物学和发育生物学问题提供了其它生物无可比拟的条件。蚜虫多型现象非常普遍，不仅具有色型和翅型分化，而且还具有生殖多型现象。孤雌生殖和有性生殖是蚜虫的两种繁殖方式。全世界至今已知5000种蚜虫都以孤雌生殖作为其年生活史当中主要的繁殖方式。因孤雌生殖繁殖速度快，世代周期短，世代数目多，导致蚜虫分布广泛、种群数量大、危害严重，也是农业生产上，蚜害问题难以解决的根本原因。

昆虫的生殖系统与昆虫的生殖密切相关。蚜虫种群数量的大小取决于其生殖力的大小，而卵巢小管数目和每个卵巢管中所产生的胚胎数是衡量蚜虫潜在生殖力的重要参数，而潜在生殖力是决定蚜虫种群数量大小的重要影响因子。对蚜虫胚胎学的研究，有助于了解蚜虫胚胎的形成过程和个体不同发育时期对生殖系统的影响、有助于了解同种蚜虫不同生物型的生殖和生态功能的差异、有助于了解不同种蚜虫生物学差异、有助于了解不同环境条件对蚜虫生殖发育的影响，有助于了解蚜虫不同地理种群的生物学差异，从而为研究生物进化和蚜虫的致灾机理奠定基础。而现在并没有一种用于观察蚜虫胚胎蚜虫胚胎的观察液和处理方法，蚜虫胚胎的观察手段依旧比较落后。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有技术缺陷，避免因为使用溶液的渗透作用导致的胚胎吸涨造成的卵巢管破裂和不完整性，以及胚胎组织内源性溶酶体酶对自身组织和细胞的自溶作用造成的视觉模糊和成像不清楚的缺陷,以及溶液溶剂蒸发导致的盐渍问题；本发明提供了一种简单有效的胚胎组织处理方法，通过本方法可以简便有效的观察和计数，同时有利于成像。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一、观察液的配制

(1)观察液配比为：醇类10-30份；乙酸乙酯1-5份；油类1-5份。

进一步的，观察液配比为：无水乙醇20份，乙酸乙酯1份，甘油1份。

进一步的，观察液制备方法为：

步骤一：常温常压下，使用移液器取无水乙醇20份，乙酸乙酯1份，甘油1份置入广口瓶中。

步骤二：将步骤一所述混合液摇匀，置于常温密封干燥条件下保存。

(2)具体制备方法

二、一种简单有效的蚜虫胚胎学组织观察处理方法，包括如下步骤：

(1)在凹形载玻片上使用滴管滴一滴蒸馏水，将一头不同龄期的无翅或有翅蚜虫用细毛笔移入凹形载玻片水中，以防止蚜虫逃逸；备用。

(2)在双目体视解剖镜下，用两支0号昆虫针将蚜虫腹面朝上，一个昆虫针固定于蚜虫中胸腹板，另一只昆虫针沿腹部中央从前往后将蚜虫腹部腹面轻轻剖开，用昆虫针摁住生殖腹板将卵巢全部拉出，去除母体虫壳等杂物。

(3)滴加2滴配制好的观察液，将胚胎组织完全浸没，立刻就会使卵巢管和胚胎的轮廓更加清晰，视觉效果提升。

(4)在双目解剖镜下即可计数卵巢管及每管胚胎数或在成像系统下照相。

本发明的有益效果：

该观察液有当前昆虫上使用最多的Bouin's固定液同等的效果，但该观察液无色，不会导致组织染色也有利于保持组织原有颜色，同时克服了Bouin's固定液中苦味酸和甲醛等试剂的缺点。无水乙醇能溶解解剖后蚜虫体内的脂肪，同时沉淀组织中的蛋白(增加视觉效果)；乙酸乙酯具有一定膨胀作用克服了乙醇对组织的收缩作用；甘油具有软化组织和保湿作用。无水乙醇单加之后组织表面硬化，使细胞失去柔韧性，脆性增加，无法分离。甘油本身黏稠，后期清洗也不方便,本发明配方克服所有缺陷,使原料能保证最大程度的优点同时克服缺陷。

该观察液能使卵巢管壁膜组织增强韧性胚胎不易散落、能使胚胎和细胞中的蛋白沉淀增强视觉效果，从而防止了原有技术使用中出现的卵巢管中胚胎易散落、细胞溶酶体自溶作用造成的无法计数和模糊不清的问题，为以后蚜虫生殖特性差异研究奠定基础。该方法安全、简单、作用速度快，效果明显；对于研究观察中缺乏特殊成像系统设备的研究者或研究单位，利用此方法借助普通体视解剖镜即可完成对蚜虫卵巢管数以及每条卵巢管中胚胎数目的计数观察。

附图说明

图1为观察液处理后蚜虫生殖系统(卵巢管和胚胎)效果照片(0.63X25)。

图2为观察液处理前蚜虫生殖系统(卵巢管和胚胎)效果照片(0.63X25)。

图3为蚜虫生殖系统纯水对照图。

图4为观察液比例为20：1：1时对照图。

图5为观察液比例为30：1：1时对照图。

图6为观察液比例为50：1：1时对照图。

具体实施方式

实施例1

常温常压下，使用移液器取无水乙醇20ml，乙酸乙酯1ml，甘油1ml；存于溶液瓶中密封备用。

在凹形载玻片上使用滴管滴一滴蒸馏水，将一头不同龄期的无翅或有翅蚜虫用细毛笔移入凹形载玻片水中，以防止蚜虫逃逸；备用。

在双目体视解剖镜下，用两支0号昆虫针将蚜虫腹面朝上，一个昆虫针固定于蚜虫中胸腹板，另一只昆虫针沿腹部中央从前往后将蚜虫腹部腹面轻轻剖开，用昆虫针摁住生殖腹板将卵巢全部拉出，去除母体虫壳等杂物。

滴加2滴配制好的观察液，将胚胎组织完全浸没，立刻就会使卵巢管和胚胎的轮廓更加清晰，视觉效果提升。

在双目解剖镜下即可计数卵巢管及每管胚胎数或在成像系统下照相。

实施例2

常温常压下，使用移液器取无水乙醇30ml，乙酸乙酯1ml，甘油1ml；存于溶液瓶中密封备用。

在凹形载玻片上使用滴管滴一滴蒸馏水，将一头不同龄期的无翅或有翅蚜虫用细毛笔移入凹形载玻片水中，以防止蚜虫逃逸；备用。

在双目体视解剖镜下，用两支0号昆虫针将蚜虫腹面朝上，一个昆虫针固定于蚜虫中胸腹板，另一只昆虫针沿腹部中央从前往后将蚜虫腹部腹面轻轻剖开，用昆虫针摁住生殖腹板将卵巢全部拉出，去除母体虫壳等杂物。

滴加2滴配制好的观察液，将胚胎组织完全浸没，立刻就会使卵巢管和胚胎的轮廓更加清晰，视觉效果提升。

在双目解剖镜下即可计数卵巢管及每管胚胎数或在成像系统下照相。

实施例3

常温常压下，使用移液器取无水乙醇50ml，乙酸乙酯1ml，甘油1ml；存于溶液瓶中密封备用。

在凹形载玻片上使用滴管滴一滴蒸馏水，将一头不同龄期的无翅或有翅蚜虫用细毛笔移入凹形载玻片水中，以防止蚜虫逃逸；备用。

在双目体视解剖镜下，用两支0号昆虫针将蚜虫腹面朝上，一个昆虫针固定于蚜虫中胸腹板，另一只昆虫针沿腹部中央从前往后将蚜虫腹部腹面轻轻剖开，用昆虫针摁住生殖腹板将卵巢全部拉出，去除母体虫壳等杂物。

滴加2滴配制好的观察液，将胚胎组织完全浸没，立刻就会使卵巢管和胚胎的轮廓更加清晰，视觉效果提升。

在双目解剖镜下即可计数卵巢管及每管胚胎数或在成像系统下照相。

实施例4

如图1和图2所示，使用ZEISS显微镜(0.63X)在AxioVisionSE64Re14.8成像系统软件中拍样取照。由图中可以看出，使用观察液处理的蚜虫卵巢管和胚胎边界清晰，尤其是卵巢小管端部生殖区清晰可见，明显观察效果优于图2。

实施咧5

如图3至图6可以看出，使用观察液处理的蚜虫卵巢管和胚胎明显清晰于对照，其中30:1:1比例为最优，边界清晰，并且细胞壁韧性强。50:1:1比例细胞壁韧性减弱，效果不如30:1:1比例。

实施例6

当前动物组织处理中常见观察液对蚜虫生殖系统(卵巢管以及卵巢管中的胚胎)处理对照：

①10％AA液：10％福尔马林(甲醛水溶液)具有刺鼻气味，眼睛不舒服，组织收缩作用不明显，不能增加胚胎的视觉效果。

②FAA液:甲醛:无水乙醇:冰醋酸＝1:8.5:0.5有刺激性气味，有浓缩增加视觉效果作用，但整个卵巢管组织已破裂，整个卵巢管不具备完整性。

③Carnoy固定液：无水乙醇:冰醋酸＝3：1；或无水乙醇：氯仿：冰醋酸6：3：1有浓缩增加视觉效果作用，但组织已破裂，导致卵巢管壁破坏，其中的胚胎散落，无法拉出整个卵巢。

④4％中性甲醛(NBF)：具有刺鼻气味眼睛不舒服无收缩作用不能增加胚胎的视觉效果。

⑤Bouin氏液：苦味酸饱和液(1.22％)75ml福尔马林25ml冰醋酸5ml有浓缩增加视觉效果作用，组织不破裂，保存细胞和组织的原有形态结构，观察液能阻止内源性溶酶体酶对自身组织和细胞的自溶、抑制细菌和霉菌的生长(与该发明作用特点相同)。缺点是苦味酸(2,4,6-三硝基苯酚)是炸药的一种，属于危险品不安全，受热，接触明火、高热或受到摩擦震动、撞击时可发生爆炸。苦味酸纯净物室温下为略带黄色的结晶。有很强的酸性，和强烈的苦杏仁味。其难溶于四氯化碳，不溶于冷水，微溶于二硫化碳，溶于热水、乙醇、乙醚，以用于丙酮、苯等有机溶剂。人体吸入、食入或经皮吸收，使皮肤黄染，引起接触性皮炎、结膜炎和支气管炎。可引起头痛、头晕、恶心呕吐、食欲减退、腹泻和发热等慢性中毒症状，严重时有时可引起末梢神经炎、膀胱刺激症状以及肝、肾损害。另外不稳定，与强氧化剂可发生反应，与重金属粉末能起化学反应生成金属盐，增加敏感度，燃烧(分解)产物：一氧化碳、二氧化碳、氮氧化物。

⑥Helly氏固定液：2.5g重铬酸钾+5g升汞+5mL 40％甲醛水溶液+1％铬酸+1g硫酸钠+1 000mL蒸馏水主要用于白细胞颗粒的固定。

⑦0.075M KCI增加渗透势，胚胎吸涨，解剖时容易卵巢管破裂、胚胎散落。照相时由于渗透液挥发导致胚胎失水、KCI晶体析出形成盐渍，影响拍照成像。

⑧冰醋酸或丙酸：作用速度快，对胚胎组织有膨胀作用，但破坏卵巢管的完整性导致胚胎散落。

⑨无水乙醇或甲醇：醇类物质有引起蛋白沉淀浓缩的作用，但容易引起组织硬化，降低柔韧性。

⑩氯仿(三氯乙酸)：基本无作用，有粘性。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。