本发明属于生物化学领域，涉及疾病诊断标志物，具体涉及一组用于诊断冠心病的代谢标志物群。
背景技术：
冠心病亦称为缺血性心脏病，涉及供应心肌血液的动脉发生粥样硬化，即冠状动脉粥样硬化病变引起血管腔狭窄或斑块形成甚至破裂、完全堵塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致心脏缺血性疾病，从而引起临床上心绞痛、心肌梗死等一系列严重的心血管事件。冠心病是人类健康的主要杀手，具发病率高、致残率高、复发率高、病死率高、并发症多等特点，已经成为威胁我国人民健康的主要疾病。冠状动脉粥样硬化是冠心病的主要病因，是冠心病的早期病症。动脉粥样硬化是一种常见的进行性动脉疾病，病变主要累及中等大小的肌层动脉，动脉内膜脂质沉积，平滑肌细胞增生，形成局限性斑块，可使动脉壁变硬，严重时斑块破裂导致血栓、栓塞、出血，受累管腔部分或完全闭塞，临床表现为动脉粥样硬化血管并发症的发生，老年患者中最常见和最严重的血管并发症是冠心病(不稳定性心绞痛和心肌梗塞)。动脉粥样硬化早期病变可发生在10岁之前，病变引起动脉狭窄需经历20至30年时间，早期无临床症状，不易被发现和重视，因此对冠状动脉粥样硬化的早期预防和诊断可以有效地防止冠心病的发生。冠状动脉造影可以对冠状动脉的狭窄程度作出准确的判断，是诊断冠心病的金标准[冠状动脉造影金标准与临床常规诊断冠心病差异性比较研究，舒荣文等，海军医学杂志2015年04期]。作为冠心病诊断的金标准，冠脉造影只能发现血管狭窄程度，而且它还是一种介入测量手段，需要介入手术，且诊断昂贵。另一方面，医生还需要依据对患者的心电图、心动图、平板运动试验、CT等检查结果作出最终诊断，由于医生主观性判断、病人叙述不清等情况的出现，对冠心病的诊断仍存在较大的误诊和漏诊，这对病人的预后影响非常大。为了改善患者的生活质量，降低患者受到的生命威胁，我们亟需发展一种具有诊断率高、经济、无侵入性、操作简便等特性的诊断方法。代谢组学是研究生物体内源性代谢物质的整体及其随内因和外因变化的科学，是系统生物学的一个重要组成部分。它可以对体液如血液和尿液进行快速及无侵入性的分析，通过代谢谱的差异获得可以指示各种生化反应的代谢标志物。目前常用的分析技术包括核磁共振(NMR)、质谱(LC-MS/GC-MS)等。LC-MS/GC-MS具有对样本制备要求低、灵敏度高、动态范围宽等特点，可用于检测样本中浓度相差大的代谢物，因而成为代谢组学的研究中应用越来越多的技术平台。血浆分析是临床上常用的一种疾病诊断方法，因其简便、快速、经济且相对无创的优点而被广泛采用。目前尚未有人使用血浆代谢物水平对冠心病进行诊断。应用血浆代谢组学寻找代谢标志物以诊断冠心病对于临床早期快速确诊冠心病具有重要意义。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明第一目的在于提供一组用于诊断冠心病的代谢标志物群，该组代谢标志物群同时存在于血浆中，可同时分析测定；本发明的第二目的在于提供一种能够灵敏地分析检测所述代谢标志物群的方法；本发明的第三目的在于提供所述代谢标志物群在筛选治疗或缓解冠心病的药物中的应用；本发明的第四目的在于提供一种基于所述代谢标志物群的检测试剂盒，用于诊断冠心病，提高诊断便利性，促进诊断方法标准化；本发明的第五目的在于提供所述检测试剂盒在筛选治疗或缓解冠心病的药物中的应用。上述目的是通过如下技术方案得以实现的：一组用于诊断冠心病的代谢标志物群，包括一个或多个如下所述的代谢标志物：柠苹酸、甲硫氨酸、牛磺酸、苹果酸、苯丙氨酸、亚油酸；所述诊断包括诊断区分冠心病患者与冠状动脉正常人，还包括诊断区分冠心病患者与冠状动脉粥样硬化患者。进一步地，所述的代谢标志物群包括任意两个所述的代谢标志物。进一步地，所述的代谢标志物群包括任意三个所述的代谢标志物。进一步地，所述的代谢标志物群包括全部六个所述的代谢标志物。进一步地，所述代谢标志物为血浆代谢标志物。。一种定性或定量分析所述的代谢标志物群的方法，通过液质联用和/或气质联用对所述的代谢标志物定性或定量。液质和气质检测限低、灵敏度高，能灵敏地分析检测生物样本中的代谢标志物并对其定量。冠心病治疗或缓解后，会在代谢标志物群的表达水平上有所体现。因此，所述的代谢标志物群可以用于筛选治疗或缓解冠心病的药物。一种用于诊断冠心病的检测试剂盒，包括所述的代谢标志物群的标准品，所述标准品为各代谢标志物的化学单体或混合物。使用标准品可以对生物样本中的代谢标志物进行快速准确地定性、定量分析。试剂盒有助于实现检测标准化，提高检测便利性和重现性。进一步地，所述检测试剂盒还包括溶解所述标准品的溶剂和/或提取富集所述代谢标志物的溶剂。所述的检测试剂盒在筛选治疗或缓解冠心病的药物中的应用。本发明的优点：(1)本发明提供的代谢标志物能准确诊断冠心病，既能诊断区分冠心病患者与冠状动脉正常人，又能诊断区分冠心病患者与冠状动脉粥样硬化患者。ROC曲线评价方法中，ROC曲线下的面积值AUC在大于0.5的情况下，越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。经验证，本发明提供的代谢标志物群中的单个用于诊断区分冠心病患者与冠状动脉正常人或诊断区分冠心病患者与冠状动脉粥样硬化患者时，AUC均在0.7以上；多个联合应用时，AUC比单个更接近于1，诊断效果更好；六个联合应用时，AUC最接近于1，诊断区分效果最好。(2)本发明提供的分析检测所述代谢标志物群的方法灵敏度高，结果准确可靠。(3)本发明提供的代谢标志物群可以有效诊断冠心病的病情是否得到缓解，可以用于筛选治疗或缓解冠心病的药物。(4)本发明提供的试剂盒可以用于诊断冠心病，提高诊断便利性，促进诊断方法标准化。(5)本发明提供的基于所述代谢标志物群的试剂盒可以有效诊断冠心病的病情是否得到缓解，可以用于筛选治疗或缓解冠心病的药物。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本发明实质性内容。使用的仪器或试剂未做详细说明的均为常规仪器和试剂；未具体描述的试验操作方法均为本领域普通技术人员公知的常规操作方法。实施例1：冠心病患者与非冠心病患者(包括冠状动脉正常人和冠状动脉粥样硬化患者)之间血浆差异性代谢物的筛选表征一、对象和方法1、标本来源在取得患者同意后，收集江苏省人民医院2010年9月～2015年6月480例冠状动脉粥样硬化患者、867例冠心病患者和350例冠状动脉正常人的外周静脉血血浆，所有患者或冠状动脉正常人均经冠脉造影证实。冠状动脉正常人的年龄、性别与冠状动脉粥样硬化患者、冠心病患者相匹配。所有冠状动脉粥样硬化患者、冠心病患者和冠状动脉正常人均有正常的心肺肝肾及造血功能。采血时间均为清晨空腹状态。2、主要试剂乙腈及甲酸(UPLC纯)购于美国ROE公司；色谱级别甲醇和氯仿购于江苏汉邦科技有限公司；氯化甲氧胺及N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(含1％三甲基氯硅烷)购于美国Sigma-Aldrich公司；去离子水由美国密理博(Millipore)公司的MIlli-Q超纯水系统制备；标准品包括柠苹酸、甲硫氨酸、牛磺酸、苹果酸、苯丙氨酸和亚油酸，购于美国Sigma-Aldrich。3、血浆差异性代谢物的表征3.1UPLC-Q/TOF-MS筛选表征3.1.1样品制备利用响应面法进行提取溶剂优化：以质谱ESI+和ESI-检测模式下的峰个数和总峰面积为因素考察不同溶剂(乙腈、甲醇、乙醇、氯仿、水)对血浆中代谢物的提取富集效率。将实验测得数据进行多变量分析，利用PLS模型中重要性因子(variableimportancetoprojection，VIP值)反映变量对模型响应的重要性。乙腈、甲醇、乙醇、氯仿、水的VIP值依次为1.503，0.802，0.651，0.688和0.987，乙腈的提取效率最高，故选择乙腈作为血浆样本的提取溶剂。样品处理：取100μL血浆于1.5mL离心管中，加入400μL乙腈，涡旋30秒后混匀，13000rpm×10min离心(4℃)，取200μL上清于1.5mL离心管中，在室温下用氮吹仪吹干，所得残渣用300μL的20％乙腈水溶液溶解，即得。3.1.2检测表征UPLC-Q/TOF-MS条件：色谱分离采用超高效液相色谱(UPLC，Agilent1290，USA)。色谱柱为WatersBEHC18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)，柱温25℃，进样室温度为室温，进样量2μL。正、负离子模式流动相组成均是A为体积浓度0.1％甲酸水溶液，B为体积浓度0.1％甲酸乙腈溶液。梯度洗脱条件：0～1min为0～30％B相，2min内B相线性增加到60％，3～8min线性变化至90％B相，然后在8～9min线性增加至100％B相并保持1min；流速0.3mL/min，柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测。质谱分析采用四级杆-飞行时间质谱(Agilent6530Q-TOF/MS，USA)。以电喷雾离子源(ESI)正、负离子模式检测；干燥气流速为7L/min，干燥气温度为300℃，干燥气和锥孔气均为高纯氮气；离子源温度100℃，正离子和负离子模式下毛细管电压均为3000V，碰撞电压为100V；采用全扫描模式每秒进行三次数据采集，扫描质量范围：m/z100-1000道尔顿。3.2GC-Q/MS筛选表征3.2.1样品制备取200μL血浆于1.5mL离心管中，加入50μL1mg/mL的2-异丙基苹果酸溶液内标，涡旋20秒混匀，加入400μL甲醇、氯仿和水的混合溶液(比例为2.5∶1∶1)，然后在70℃的金属浴上振摇30min(1200rpm)，16000g×5min离心(4℃)，取500μL上清于1.5mL离心管中，加入500μL蒸馏水，涡旋混匀，然后16000g×5min离心(4℃)，取500μL上清于1.5mL离心管中，在室温下用氮吹仪吹干，所得残渣用80μL的甲氧胺吡啶溶液溶解，在50℃条件下肟化8h，加入60μLN-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，在70℃条件下衍生化2h，即得。3.2.2检测表征GC-Q/MS条件：美国Agilent7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪。色谱柱HP-5MS毛细管柱(30.0m×0.25mm，毛细管厚度0.25μm)；载气为高纯氦气，流速1.0mL/min；进样量2μL；程序升温：80℃恒温2min，80℃-300℃(5℃/min)恒温6min；不分流，进样温度300℃；接口温度300℃；离子源温度200℃；电子能量50eV；溶剂延迟3min；采用全扫描模式，扫描质量范围：m/z30-600道尔顿。4、数据处理和分析将UPLC-Q/TOF-MS和GC-Q/MS得到的数据导入SIMCA软件(version13.0.2，Umetrics)进行多元统计分析。通过建立OPLS-DA(正交偏最小二乘法-判别分析)模型，寻找冠心病患者与冠状动脉粥样硬化患者、冠状动脉正常人之间代谢轮廓贡献较大(VIP＞1.0且p＜0.01)的差异代谢物。通过HMDB(http：//www.hmdb.ca/)和Metline(http：//metlin.scripps.edu/)等数据库进行物质结构的检索，利用数据库中提供的精确分子量和质谱所得的MS/MS图谱初步鉴定上述差异代谢物的结构。最终通过购买标准品，用标准品的分子量、色谱保留时间和相应的多级MS裂解谱比对，确证差异代谢物的结构。二、结果共筛选表征6个差异代谢物，分别为：柠苹酸、甲硫氨酸、牛磺酸、苹果酸、苯丙氨酸和亚油酸。与冠状动脉正常人和冠状动脉硬化患者相比，上述6个差异代谢物在冠心病患者血浆中的表达水平出现上调或下调。通过标准品定量检测，与冠状动脉正常人和和冠状动脉硬化患者相比，上述差异代谢物在冠心病患者血浆中的表达水平上调或下调情况为：柠苹酸和苹果酸均下调0.7～0.8倍；甲硫氨酸、牛磺酸、苯丙氨酸和亚油酸均上调0.7～0.8倍。由此可见，上述6个差异代谢物在冠心病患者和非冠心病患者(包括冠状动脉正常人和冠状动脉粥样硬化)血浆中的表达水平明显不同，可用于诊断区分冠心病患者和非冠心病患者。实施例2：构建ROC曲线比较6个差异代谢物诊断区分冠心病患者和非冠心病患者(包括冠状动脉正常人和冠状动脉粥样硬化)的能力采用受试者工作曲线(ROC)法进行验证，通过冠心病患者和非冠心病患者(包括冠状动脉正常人和冠状动脉粥样硬化)血浆中差异代谢物的表达水平判断其用于诊断冠心病的能力。结果表明，柠苹酸、甲硫氨酸、牛磺酸、苹果酸、苯丙氨酸和亚油酸这6个差异代谢物单个用于诊断区分冠心病患者与冠状动脉正常人、冠心病患者与冠状动脉粥样硬化患者的能力较强，ROC曲线下面积(AUC)均大于0.7，具有临床诊断意义；这6个差异代谢物联合用于诊断时，AUC进一步提高，6个联合诊断区分冠心病患者与冠状动脉正常人的AUC达0.997，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为98.3％和99.3％；6个联合诊断区分冠心病患者与冠状动脉粥样硬化患者的AUC达0.996，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为99.6％和99.7％。单个及任意2～5个联合用于诊断时的AUC见表1～6。表1单个差异代谢物诊断区分冠心病患者与冠状动脉正常人的AUC单个差异代谢物AUC灵敏度特异性柠苹酸0.87186.7％88.6％甲硫氨酸0.85284.3％84.2％牛磺酸0.83083.0％83.4％苹果酸0.77476.8％80.0％苯丙氨酸0.74773.6％76.9％亚油酸0.73673.3％75.8％表2两个差异代谢物联合诊断区分冠心病患者与冠状动脉正常人的AUC表3任意三～五个差异代谢物联合诊断区分冠心病患者与冠状动脉正常人的AUC联合个数AUC灵敏度特异性三个≥0.924≥90.6％≥93.3％四个≥0.929≥91.5％≥95.7％五个≥0.940≥92.6％≥97.0％表4单个差异代谢物诊断区分冠心病患者与冠状动脉粥样硬化患者的AUC单个差异代谢物AUC灵敏度特异性柠苹酸0.87487.1％88.0％甲硫氨酸0.85584.7％83.6％牛磺酸0.83483.4％82.8％苹果酸0.77677.2％79.4％苯丙氨酸0.75074.0％76.3％亚油酸0.73973.7％75.2％表5两个差异代谢物联合诊断区分冠心病患者与冠状动脉粥样硬化患者的AUC表6任意三～五个差异代谢物联合诊断区分冠心病患者与冠状动脉粥样硬化患者的AUC联合个数AUC灵敏度特异性三个≥0.911≥89.9％≥92.3％四个≥0.922≥91.1％≥95.8％五个≥0.938≥92.6％≥96.8％从表1和4可以看出，这6个差异代谢物单个用于诊断区分冠心病患者与非冠心病患者(包括冠状动脉正常人和冠状动脉粥样硬化)的能力较强，AUC均大于0.7，灵敏度高、特异性强，具有临床诊断意义；从表2和5可以看出，这6个差异代谢物两两联合用于诊断时，AUC比单个用于诊断时更高，灵敏度高、特异性强，具有临床诊断意义；从表3和6可以看出，用这6个差异代谢物中的3～5个联合用于诊断时，AUC进一步提高，灵敏度高、特异性强，具有临床诊断意义。因此，这6个差异代谢物可以作为诊断冠心病的代谢标志物。实施例3：在筛选治疗或缓解冠心病的药物中的应用对185例冠心病患者药物治疗前和药物治疗后的血浆进行检测，结果表明：随着药物治疗疗程的增加，患者病情逐步缓解，本发明提供的6个代谢标志物在血浆中的水平逐渐趋于冠状动脉正常人的水平，且完全治愈后与冠状动脉正常人的血浆水平无显著性差异(P＞0.05)。该结果与冠脉造影的检测结果一致。因此，可利用本发明提供的代谢标志物筛选治疗或缓解冠心病的药物。实施例4：检测试剂盒的制备基于本发明提供的代谢标志物制备了检测试剂盒，该试剂盒包括如下成分：代谢标志物的标准品：包括柠苹酸、甲硫氨酸、牛磺酸、苹果酸、苯丙氨酸和亚油酸，各标准品分别封装；血浆代谢物提取溶剂：100％乙腈和20％乙腈水溶液(用于UPLC-Q/TOF-MS样品制备)；比例为2.5∶1∶1的甲醇、氯仿和水的混合溶液、甲氧胺吡啶和N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(用于GC-Q/MS样品制备)；UPLC-Q/TOF-MS筛选表征中，20％乙腈水溶液可以用作溶解标准品的溶剂；GC-Q/MS筛选表征中，用血浆代谢物提取溶剂按样品制备的方法制备标准品溶液；内标：2-异丙基苹果酸。当然，设计检测试剂盒时，并不需要完全包含上述6个代谢标志物的标准品，可以仅使用其中几个进行组合。这些标准品可以单独封装，也可以制成混合物封装。该试剂盒是基于本发明提供的代谢标志物群而设计的，可以用于筛选治疗或缓解冠心病的药物。综上所述，本发明有效克服了现有技术中的不足，且具高度产业利用价值。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。