一种应用流式细胞仪分析评价小鼠骨髓红细胞生成功能的方法与流程

本发明涉及流式细胞术技术领域，具体涉及一种利用流式细胞仪分析评价小鼠骨髓红细胞生成功能的方法。

背景技术：
成熟红细胞是机体血液中数量最多的一种血细胞，是机体通过血液运送氧气的最主要的媒介，近年来研究发现红细胞也是机体重要的免疫活性细胞，在抗疾病、抗肿瘤中亦扮演重要角色。而成熟红细胞是由骨髓红细胞系统中的红系祖细胞经原红细胞、幼红细胞和网织红细胞逐步分化发育而来。因此，检测各时期红细胞数量比例用以分析评价骨髓红细胞生成功能，对于进一步探究红细胞在机体中发挥的作用具有重要的意义。小鼠作为最为常用的实验动物已广泛应用于食品、化妆品、药品、生物制品、工业产品和医学及生命科学等的安全性、毒性和效力等方面的实验和检验。传统用于评价小鼠骨髓红细胞生成功能的方法主要是骨髓涂片镜检进行人工计数，这种方法费时、工作量大，受人的主观因素影响比较大，观察的数量较少，且一般只能计数200-400个细胞，所以存在一定误差。目前，用流式细胞仪来分析评价小鼠骨髓红细胞生成功能已经越来越受到人们的关注。由于流式细胞仪检测速度可达每秒2000个细胞，共计数20,000个细胞，极大提高了检测的准确性，并为样本数量较多的实验设计提供了一个快速、准确、可行的实验方法。有报道使用小鼠细胞表面标记物CD71和Ter119进行双参数标记进行小鼠红系细胞的研究，但该方法无法区分网织红细胞和成熟红细胞，且抗体价格普通高昂，同时使用CD71和Ter119两种抗体使得检测成本偏高，不利于推广应用。

技术实现要素：
本发明是为克服现有评价分析小鼠骨髓红细胞生成功能技术中的不足之处，提供一种利用流式细胞仪快速、准确、简单易行且成本较低的分析评价小鼠骨髓红细胞生成功能的方法。本发明采用的技术方案如下：一种应用流式细胞仪分析评价小鼠骨髓红细胞生成功能的方法，包括如下步骤：1.取小鼠骨髓细胞，计数，取一定数量的细胞；2.向小鼠骨髓细胞加入噻唑橙染色液孵育，洗涤，离心，弃上清；3.加入大鼠IgG进行孵育；4.加入APCRatAnti-MouseTer119进行孵育；5.加入PBS，流式细胞仪检测分析；6.收集一定数量细胞，采用流式软件分析荧光群体的细胞分布。优选的，所述步骤1中所取小鼠骨髓细胞数为100万；优选的，所述步骤2中噻唑橙使用浓度为0.05-1μg/ml，使用量为每百万小鼠骨髓细胞添加0.1-2ml，小鼠骨髓细胞与噻唑橙孵育温度为室温，孵育时间为5-60分钟；优选的，所述步骤3中大鼠IgG使用浓度为0.1mg/ml，使用量为每百万小鼠骨髓细胞添加0.1-0.2ml，小鼠骨髓细胞与大鼠IgG孵育温度为4℃，孵育时间为10min；优选的，所述步骤4中APCRatAnti-MouseTer119的使用浓度为1-20μg/ml，使用量为每百万小鼠骨髓细胞添加0.1-0.2ml，小鼠骨髓细胞与APCRatAnti-MouseTer119的孵育温度为4-20℃，孵育时间为10-60min；优选的，所述步骤5中PBS添加量为每百万小鼠骨髓细胞添加0.1ml；优选的，所述步骤6中收集细胞数为2万。本发明作用机理：Ter119在原红细胞、幼红细胞、网织红细胞和成熟红细胞的细胞膜上均有表达，而在红系祖细胞、白细胞以及造血干细胞等细胞中不表达，采用APC荧光标记的抗Ter119抗体标记小鼠骨髓细胞，可将细胞整体分为Ter119阳性细胞和Ter119阴性细胞。噻唑橙可以与细胞中的RNA和DNA结合并产生荧光，成熟红细胞中无RNA和DNA，网织红细胞中有少量RNA和DNA，而原红细胞和幼红细胞(包括早幼红细胞、中幼红细胞和晚幼红细胞)中有大量RNA和DNA。因此，采用噻唑橙染色可以将Ter119阳性的细胞群体再分成三群，分别是成熟红细胞(Ter119+噻唑橙-)，网织红细胞(Ter119+噻唑橙+)，幼红细胞和原红细胞(Ter119+噻唑橙++)。本发明的有益效果是：(1)本发明采用Ter119设门策略，以纯化目的细胞，从而减少了小鼠骨髓中其它细胞群体的影响，降低了背景染色，使结果更可靠。(2)本发明按照先加入噻唑橙，再加入APCRatAnti-MouseTer119的顺序加入两种标记试剂，有效提高了对小鼠红系细胞的染色效果，避免了Ter119受后加入的噻唑橙影响从而产生荧光强度不稳定的现象。(3)本发明Ter119采用APC进行荧光标记，在进行流式细胞检测时有效避免了与噻唑橙荧光的相互干扰，且不需要调补偿，节约检测时间，有利于实验的标准化建立。(4)本发明采用噻唑橙和APCRatAnti-MouseTer119双参数标记小鼠骨髓细胞进行流式细胞仪检测，定量分析成熟红细胞(Ter119+噻唑橙-)，网织红细胞(Ter119+噻唑橙+)，幼红细胞和原红细胞(Ter119+噻唑橙++)在骨髓整体细胞中的比例，而这三类群细胞分别是红细胞发育后期的不同阶段，据此能够有效分析评价小鼠骨髓的红细胞生成功能。(5)本发明快速、准确、简单易行且成本较低，有利于推广应用。附图说明图1为实验组1噻唑橙(thiazoleorange)和APCRatAnti-MouseTer119双参数标记小鼠骨髓细胞流式双染散点图，其中图1A为对照组的双染散点图，图1B为实验组的双染散点图，图中标出的P2部分代表Ter119+噻唑橙-细胞群，P3部分代表Ter119+噻唑橙+细胞群，P4部分代表Ter119+噻唑橙++细胞群；图2为实验组2噻唑橙(thiazoleorange)和APCRatAnti-MouseTer119双参数标记小鼠骨髓细胞流式双染散点图，其中图2A为对照组的双染散点图，图2B为实验组的双染散点图，图中标出的P2部分代表Ter119+噻唑橙-细胞群，P3部分代表Ter119+噻唑橙+细胞群，P4部分代表Ter119+噻唑橙++细胞群。具体实施方式实施例11.取BALB/c小鼠骨髓细胞，计数，取100万细胞；2.向小鼠骨髓细胞加入1ml噻唑橙染色液，所述噻唑橙染色液浓度为0.2μg/ml，室温孵育30分钟，洗涤，离心，弃上清；3.加入0.1ml大鼠IgG进行封闭，所述大鼠IgG浓度为0.1mg/ml，4℃孵育10min；4.加入0.1mlAPCRatAnti-MouseTer119，所述APCRatAnti-MouseTer119浓度为4μg/ml，4℃孵育30min；5.加入0.1mlPBS，流式细胞仪检测分析，噻唑橙激发光488nm，发射光530nm，APC激发光638nm，发射光660nm；6.收集两万细胞，采用流式软件分析荧光群体的细胞分布。实施例21.取BALB/c小鼠骨髓细胞，计数，取100万细胞；2.向小鼠骨髓细胞加入0.1ml噻唑橙染色液，所述噻唑橙染色液浓度为1μg/ml，室温孵育5分钟，洗涤，离心，弃上清；3.加入0.1ml大鼠IgG进行封闭，所述大鼠IgG浓度为0.1mg/ml，4℃孵育10min；4.加入0.1mlAPCRatAnti-MouseTer119，所述APCRatAnti-MouseTer119浓度为20μg/ml，6℃孵育10min；5.加入0.1mlPBS，流式细胞仪检测分析，噻唑橙激发光488nm，发射光530nm，APC激发光638nm，发射光660nm；6.收集两万细胞，采用流式软件分析荧光群体的细胞分布。实施例31.取BALB/c小鼠骨髓细胞，计数，取100万细胞；2.向小鼠骨髓细胞加入2ml噻唑橙染色液，所述噻唑橙染色液浓度为0.05μg/ml，室温孵育60分钟，洗涤，离心，弃上清；3.加入0.15ml大鼠IgG进行封闭，所述大鼠IgG浓度为0.1mg/ml，4℃孵育10min；4.加入0.15mlAPCRatAnti-MouseTer119，所述APCRatAnti-MouseTer119浓度为1μg/ml，10℃孵育60min；5.加入0.1mlPBS，流式细胞仪检测分析，噻唑橙激发光488nm，发射光530nm，APC激发光638nm，发射光660nm；6.收集两万细胞，采用流式软件分析荧光群体的细胞分布。实施例41.取BALB/c小鼠骨髓细胞，计数，取100万细胞；2.向小鼠骨髓细胞加入0.5ml噻唑橙染色液，所述噻唑橙染色液浓度为0.1μg/ml，室温孵育40分钟，洗涤，离心，弃上清；3.加入0.1ml大鼠IgG进行封闭，所述大鼠IgG浓度为0.1mg/ml，4℃孵育10min；4.加入0.2mlAPCRatAnti-MouseTer119，所述APCRatAnti-MouseTer119浓度为10μg/ml，15℃孵育25min；5.加入0.1mlPBS，流式细胞仪检测分析，噻唑橙激发光488nm，发射光530nm，APC激发光638nm，发射光660nm；6.收集两万细胞，采用流式软件分析荧光群体的细胞分布。实施例51.取BALB/c小鼠骨髓细胞，计数，取100万细胞；2.向小鼠骨髓细胞加入1.5ml噻唑橙染色液，所述噻唑橙染色液浓度为0.5μg/ml，室温孵育10分钟，洗涤，离心，弃上清；3.加入0.2ml大鼠IgG进行封闭，所述大鼠IgG浓度为0.1mg/ml，4℃孵育10min；4.加入0.1mlAPCRatAnti-MouseTer119，所述APCRatAnti-MouseTer119浓度为15μg/ml，20℃孵育20min；5.加入0.1mlPBS，流式细胞仪检测分析，噻唑橙激发光488nm，发射光530nm，APC激发光638nm，发射光660nm；6.收集两万细胞，采用流式软件分析荧光群体的细胞分布。对比例11.取BALB/c小鼠骨髓细胞，计数，取100万细胞；2.向小鼠骨髓细胞加入1ml噻唑橙染色液，所述噻唑橙染色液浓度为0.2μg/ml，室温孵育30分钟，洗涤，离心，弃上清；3.加入0.1ml大鼠IgG进行封闭，所述大鼠IgG浓度为0.1mg/ml，4℃孵育10min；4.加入0.1mlPBS，流式细胞仪检测分析，噻唑橙激发光488nm，发射光530nm；5.收集两万细胞，采用流式软件分析荧光群体的细胞分布。对比例1仅使用噻唑橙单独染色，则仅将小鼠骨髓细胞分为噻唑橙+细胞群、噻唑橙++细胞群和噻唑橙-细胞群，由于缺乏APCRatAnti-MouseTer119的设门策略，根本无法区分小鼠骨髓红细胞系统中各时期红细胞与小鼠骨髓中其他细胞类群。对比例21.取BALB/c小鼠骨髓细胞，计数，取100万细胞；2.加入0.1ml大鼠IgG进行封闭，所述大鼠IgG浓度为0.1mg/ml，4℃孵育10min；3.加入0.1mlAPCRatAnti-MouseTer119，所述APCRatAnti-MouseTer119浓度为4μg/ml，4℃孵育30min；4.加入0.1mlPBS，流式细胞仪检测分析，APC激发光638nm，发射光660nm；5.收集两万细胞，采用流式软件分析荧光群体的细胞分布。对比例2仅使用APCRatAnti-MouseTer119，则将骨髓细胞分为2种类群即Ter119+细胞群和Ter119-细胞群，由于Ter119仅在小鼠骨髓红细胞系统中的成熟红细胞、网织红细胞、幼红细胞和原红细胞上表达，在小鼠骨髓中的其他细胞类群不表达，则该方法仅能区分小鼠骨髓红细胞系统细胞和非小鼠骨髓红细胞系统细胞，而无法区分各时期红细胞。对比例31.取小鼠骨髓细胞，计数，取100万细胞；2.加入0.1ml大鼠IgG进行封闭，所述大鼠IgG浓度为0.1mg/ml，4℃孵育10min；3.加入0.1mlAPCRatAnti-MouseTer119，所述APCRatAnti-MouseTer119浓度为4μg/ml，4℃孵育30min；4.向小鼠骨髓细胞加入1ml噻唑橙染色液，所述噻唑橙染色液浓度为0.2μg/ml，室温孵育30分钟，洗涤，离心，弃上清；5.加入0.1mlPBS，流式细胞仪检测分析，噻唑橙激发光488nm，发射光530nm，APC激发光638nm，发射光660nm；6.收集两万细胞，采用流式软件分析荧光群体的细胞分布。对比例3仅将APCRatAnti-MouseTer119和噻唑橙两种染色剂添加的顺序对调，实验结果表明染色效果差，Ter119的荧光强度不稳定。对比例41.取BALB/c小鼠骨髓细胞，计数，取100万细胞；2.向小鼠骨髓细胞加入1ml噻唑橙染色液，所述噻唑橙染色液浓度为0.2μg/ml，室温孵育30分钟，洗涤，离心，弃上清；3.加入0.1ml大鼠IgG进行封闭，所述大鼠IgG浓度为0.1mg/ml，4℃孵育10min；4.加入0.1mlFITCRatanti-mouseTer-119，所述FITCRatanti-mouseTER-119浓度为4μg/ml，4℃孵育30min；5.加入0.1mlPBS，流式细胞仪检测分析，噻唑橙激发光488nm，发射光530nm，FITC激发光488nm，发射光525nm；6.收集两万细胞，采用流式软件分析荧光群体的细胞分布。对比例4将APCRatAnti-MouseTer119替换为FITCRatanti-mouseTer119，实验结果表明FITCanti-mouseTer-119和噻唑橙在同一个荧光通道上，相互干扰无法检测。对比例51.取BALB/c小鼠骨髓细胞，计数，取100万细胞；2.向小鼠骨髓细胞加入1ml噻唑橙染色液，所述噻唑橙染色液浓度为0.2μg/ml，室0温孵育30分钟，洗涤，离心，弃上清；3.加入0.1ml大鼠IgG进行封闭，所述大鼠IgG浓度为0.1mg/ml，4℃孵育10min；4.加入0.1mlPERatanti-mouseTer119，所述PERatanti-mouseTer119浓度为4μg/ml，4℃孵育30min；5.加入0.1mlPBS，流式细胞仪检测分析，噻唑橙激发光488nm，发射光530nm，PE激发光488nm，发射光575nm；6.收集两万细胞，采用流式软件分析荧光群体的细胞分布。对比例5将APCRatAnti-MouseTer119替换为PERatanti-mouseTer119，实验结果表明PEanti-mouseTer119和噻唑橙有较大的交叉荧光，需要调整补偿，不利于实验的标准化，且耗费时间。对比例61.取BALB/c小鼠骨髓细胞，计数，取100万细胞；2.向小鼠骨髓细胞加入1ml噻唑橙染色液，所述噻唑橙染色液浓度为0.2μg/ml，室温孵育30分钟，洗涤，离心，弃上清；3.加入0.1mlAPCRatAnti-MouseTer119，所述APCRatAnti-MouseTer119浓度为4μg/ml，4℃孵育30min；4.加入0.1mlPBS，流式细胞仪检测分析，噻唑橙激发光488nm，发射光530nm，APC激发光638nm，发射光660nm；5.收集两万细胞，采用流式软件分析荧光群体的细胞分布。对比例6未加入大鼠IgG进行封闭，实验结果表明小鼠骨髓中非红细胞系统细胞亦被染色，即产生非特异染色，干扰实验结果，影响实验结果准确度。实验例1BALB/c小鼠，尾静脉注射顺铂10mg/kg，每两天给药一次，共计给药三次，第三次给药1天后，处死小鼠，余下步骤同实施例1，同时设置对照组。为验证本发明效果，在本实验例中，首先向实验组小鼠体内注射顺铂(cisplatin)，顺铂是临床上常用抗肿瘤药物，具有破坏肾功能从而抑制骨髓造血的作用。如图1所示，同对照组相比，采用顺铂处理小鼠后，小鼠骨髓中Ter119+噻唑橙-细胞群比例明显升高，而Ter119+噻唑橙+细胞群和Ter119+噻唑橙++细胞群比例明显降低，即成熟红细胞群升高，而网织红细胞群，原红细胞与幼红细胞群降低，实验结果与预期相符。实验例2BALB/c雄性小鼠，皮下注射促红细胞生成素200IU/kg，每天给药一次，共计给药4次，第四次给药后3小时，处死小鼠，余下步骤同实施例1，同时设置对照组。为验证本发明效果，在本实验例中，首先向实验小鼠体内注射促红细胞生成素，促红细胞生成素(EPO)临床上用于治疗贫血，具有促进红系祖细胞分化作用，促进骨髓红细胞生成，如图2所示，同对照组相比，采用EPO处理小鼠后，小鼠骨髓中Ter119+噻唑橙++细胞群比例明显升高，即原红细胞与幼红细胞群比例升高，实验结果与预期相符。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围。