本发明涉及一种荧光金纳米簇，尤其涉及一种表面修饰寡聚精氨酸的荧光金纳米簇和该荧光金纳米簇的制备方法，及其基于该荧光金纳米的活性氧(ros)检测方法和包含该荧光金纳米簇的试剂盒，以及该荧光纳米簇和该试剂盒的应用。
背景技术：
为了观察细胞内的ros的情况，研究人员设计并合成有机荧光探针用于ros的检测。有研究表明有机荧光探针对特定的ros具有高选择性，并且在研究特定ros的生理机制方法有巨大潜力。然而，这些有机荧光探针的光漂白性，生物毒性和自发的自氧化性等局限性阻碍了其在细胞中的大规模和长时间的应用。
ros是代谢过程中产生的重要的信号分子，它包括超氧化物(o2-)，单线态氧(o21)，过氧化氢(h2o2)，氢氧自由基(·oh)，次氯酸根(clo-)，过氧亚硝基(onoo-)等。活性氧与很多严重的人类疾病如癌症、心血管疾病、老年痴呆症和神经退行性疾病等有关。最近研究表明ros在调节各种生理功能中作为第二信使扮演关键角色，因此ros吸引了很多化学、生物学和医学等领域的研究者对其进行研究。并且，在各种活性氧中，·oh、clo-和onoo-被认为是高度活性氧(hros)，这是因为它们的强氧化特性，可以直接氧化活细胞内的核酸、蛋白质、脂类等，导致潜在的严重损害。因此，hros在细胞环境中的检测也是非常重要的，它可以帮助我们更好地理解hros在活细胞中的生理作用。
技术实现要素：
因此，基于上述已有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种表面修饰寡聚精氨酸的荧光金纳米簇和该荧光金纳米簇的制备方法，及其基于该荧光金纳米簇的活性氧(ros)检测方法和包含该荧光金纳米簇的试剂盒，以及该荧光纳米簇和该试剂盒的应用。
针对上述发明目的，本发明的第一方面提供了一种荧光金纳米簇，所述荧光金纳米簇的表面修饰有寡聚精氨酸。所述寡聚精氨酸优选为八到二十个精氨酸组成的短肽。最优选为九聚精氨酸。
本发明的第二方面提供了一种制备方法，其用于制备本发明第一方面的荧光金纳米簇，其中，所述制备方法包括：将氯金酸、寡聚精氨酸肽和保护剂混合得到混合液；将所述混合液恒温加热合成所述荧光金纳米簇。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述保护剂选自谷胱甘肽、抗坏血酸和半胱氨酸中的一种或多种。
根据本发明第二方面的制备方法，其中：所述氯金酸与所述寡聚精氨酸肽的摩尔比为0.1～10：1，优选为0.2～2.5：1，最优选为2.4:1。和/或所述保护剂与寡聚精氨酸的摩尔比为0～10:1，最优选为2:1。
根据本发明第二方面的制备方法，其中：所述恒温加热温度为40～120℃，优选为50～100℃，最优选为70℃。和/或所述恒温加热时间为12～48h，优选为18～30h，最优选为24h。
本发明的第三方面提供了一种活性氧检测方法，其基于本发明第一方面的荧光金纳米簇或采用本发明第二方面的方法制备的荧光金纳米簇，其中，所述检测方法包括：
(1)向待测样本中加入所述荧光金纳米簇并反应；优选地，
所述反应温度为20～40℃，更优选为20～37℃，最优选为25℃或37℃，
所述反应时间为10～60min，更优选为10～30min，最优选为15min或20min，
所述荧光金纳米簇的浓度为100～400μg/ml，进一步优选为200～400μg/ml，更进一步优选为200～300μg/ml，和/或
所述荧光金纳米簇的体积为100～300μl，进一步优选为150～250μl，更进一步优选为160～200μl；
(2)测量所述待测样本的荧光以检测所述活性氧的存在或浓度；
优选地，所述待测样本为溶液或细胞，和/或
优选地，所述活性氧选自超氧化物、单线态氧、过氧化氢、氢氧自由基、次氯酸根和过氧亚硝基中的一种或多种。
根据本发明第三方面的活性氧检测方法，其中，当所述待测样本为溶液时，步骤(2)中检测所述活性氧的存在或浓度通过标准曲线法进行。优选地，所述步骤(2)包括绘制标准曲线，绘制所述标准曲线包括以下步骤：(a)向不同浓度的所述活性氧溶液中加入所述荧光金纳米簇并反应，(b)检测所述活性氧溶液的荧光强度，根据所述荧光强度和所述活性氧溶液的浓度绘制标准曲线。更优选地，所述活性氧溶液的浓度分别为0nm、40nm、100nm、200nm、400nm、1μm、4μm、20μm、40μm、60μm、80μm和250μm。
根据本发明第三方面的活性氧检测方法，其中，当所述待测样本为细胞时，步骤(1)中的所述反应为孵育。优选地，在步骤(1)之后，所述检测方法还包括洗去没有进入所述细胞的所述荧光金纳米簇。
在一种实施方案中，上述活性氧检测方法可以包括：
(1)将所述荧光金纳米簇与细胞孵育；
(2)洗去没有进入所述细胞的荧光金纳米簇；
(3)测量所述细胞的荧光以检测所述活性氧的存在或浓度。
其中，步骤(3)中测量所述细胞的荧光可以采用酶标仪测量光密度(od)值或流式细胞仪测量荧光强度。
本发明的第四方面提供了一种试剂盒，该试剂盒包括本发明第一方面的荧光金纳米簇或采用本发明第二方面的制备方法而制备的荧光金纳米簇。
本发明的第五方面提供了一种应用，该应用为本发明第一方面的荧光金纳米簇、采用本发明第二方面的制备方法制备的荧光金纳米簇或本发明第四方面的试剂盒在制备用于检测选自以下一种或多种病症的产品中的应用：癌症、心血管疾病、老年痴呆症和神经退行性疾病。
本发明的第六方面提供了一种检测选自以下一种或多种病症的方法：癌症、心血管疾病、老年痴呆症和神经退行性疾病，所述方法通过本发明第三方面的活性氧检测方法进行。
本发明的第七方面提供了一种用于检测选自以下一种或多种病症的荧光金纳米簇：癌症、心血管疾病、老年痴呆症和神经退行性疾病，所述荧光金纳米簇为本发明第一方面的荧光金纳米簇或采用本发明第二方面的制备方法而制备的荧光金纳米簇。
具体地，本发明提供了利用一步法合成寡聚精氨酸修饰的荧光金纳米簇并利用该荧光金纳米簇作为纳米传感器来检测细胞中的ros。所述荧光金纳米簇作为一种新型的探针不同于传统的有机荧光分子探针，它有强大的抗光漂白性、抗光闪烁性和良好的生物相容性等。所述荧光金纳米簇能穿过细胞膜进入细胞并在可见光激发下发出较强的红色荧光。当细胞内产生过多ros时，金纳的荧光被淬灭并且荧光淬灭的程度与细胞内ros的量是有线性关系的。因此利用所述荧光金纳米簇这一特性来实时监控和检测细胞中的ros。本发明为细胞内ros的检测开辟了一种有前途的新方法。
本发明所述的荧光金纳米簇是通过一步法制备的，这大大缩短了合成时间，提高了合成效率。与商用试剂盒中使用的有机荧光分子相比，所述的荧光金纳米簇具有更好的光学性能和生物相容性、更强的抗光漂白性和更低的生物毒性，有利于长时间检测。本发明提供的基于所述荧光金纳米簇的活性氧检测方法具有方法简单、反应条件温和，即常温常压、水相和ph中性附近的特性，有利于所述荧光金纳米簇的生物应用。而所述荧光纳米簇表面修饰有穿膜肽，这更好地帮助所述荧光纳米簇进入细胞，从而实现细胞内ros的检测。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了所述荧光金纳米簇(auncs)合成及应用示意图，其中haucl4即为氯金酸，gsh即为谷胱甘肽，auncs即为荧光金纳米簇；hv即为光照，hros即为高度活性氧，em：620nm即为发射620nm波长的荧光；
图2示出了所述auncs的紫外可见吸收光谱、荧光光谱和在激发光为430nm时的发射光谱，以及所述auncs的溶液和溶液荧光图；
图3示出了所述auncs对于不同浓度的·oh响应的荧光光谱图；
图4示出了所述auncs用于溶液中ros检测的标准曲线；
图5示出了所述auncs对ros检测的选择性实验；
图6示出了使用cck-8试剂盒检测的所述auncs毒性实验结果；
图7示出了检测所述auncs毒性时的细胞形态图；
图8示出了huvec细胞内所述auncs在光照下不同时间的荧光图；
图9示出了huvec细胞内所述auncs的荧光曲线图；
图10示出了利用所述auncs与商用试剂盒所测量的细胞内ros；
图11示出了利用所述auncs检测细胞内ros的流式细胞术结果；
图12示出了利用商用试剂盒检测细胞内ros的流式细胞术结果；
附图标记说明：
1、所述auncs溶液图；2、所述auncs溶液的荧光图；3和5、控制组的细胞形态图；4和6、加入所述auncs后的细胞形态图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
以下实施例中，除具体指明的试验材料、条件以及操作方法外，实施例中所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的。因此，本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
氯金酸、谷胱甘肽、过氧化钾，过氧化氢，氯化铜，过氧亚硝基铁，购自sigma；
寡聚精氨酸购自上海吉尔生化公司合成；
cck-8试剂盒，购自dojindo；
ros商用试剂盒，购自ebioscience。
仪器：
酶标仪，购自美国perkinelmer公司，型号enspire；
紫外分光光度计，购自日本shimadzu公司，型号uv-2450；
荧光光谱仪，购自日本shimadzu公司，型号rf-5301pc；
流式细胞仪，购自美国bd公司，型号bdlsrfortessasorp。
浓度单位mm即为mmol/l，μm即为μmol/l，nm即为nmol/l。
实施例1：合成荧光金纳米簇
本实施例用于说明本发明提供的荧光金纳米簇。
所述的荧光金纳米簇制备方法如图1，具体为：
混合300μl浓度为120mm的氯金酸(haucl4)、10ml浓度为1.5mm的配体(ligand，即寡聚精氨酸肽)和10ml浓度为3mm的谷胱甘肽(gsh)得到混合液；将所述混合液70℃加热24小时合成所述荧光金纳米簇(auncs)。
该实施例所合成的荧光金纳米簇溶液如图2附图标记1，颜色为浅黄绿色，该荧光金纳米簇溶液的荧光颜色如图2附图标记2，颜色为橘红色。使用荧光分光光度计测量所述荧光金纳米簇溶液的吸收光谱、激发光谱以及在430nm波长下的发射光谱如图2。
试验例1：溶液中ros检测的灵敏度实验
采用实施例1合成的auncs进行溶液中ros的检测。
所述检测灵敏度实验具体为：
所述溶液中的ros为由芬顿反应所制备的·oh。
向不同浓度(0nm、40nm、100nm、200nm、400nm、1μm、4μm、20μm、40μm、60μm、80μm和250μm)的·oh水溶液中分别加入180μl浓度为300μg/ml的auncs并在25℃下反应15min；采用酶标仪测量荧光光谱。
所述检测灵敏度的部分荧光光谱如图3，说明随着ros浓度的增加，荧光会逐级减弱。从测试结果可知，所述auncs作为纳米传感器用于溶液中检测ros具有良好的灵敏度和检测限，并且最低的检测限可达到100nm。
试验例2：绘制检测溶液中ros的标准曲线
采用实施例1合成的auncs进行绘制检测溶液中ros的标准曲线。
具体方法包括：
(a)向不同浓度(0nm、40nm、100nm、200nm、400nm、1μm、4μm、20μm、40μm、60μm、80μm和250μm)的·oh水溶液中分别加入180μl浓度为300μg/ml的auncs并在25℃下反应20min；
(b)检测·oh水溶液的荧光强度，根据所述荧光强度和所述活性氧溶液的浓度绘制标准曲线。
所述标准曲线如图4，横坐标为·oh的浓度，纵坐标为(f0-f)/f0的计算结果，其中f为所述不同浓度溶液的荧光强度(fl强度)，f0为溶液中·oh浓度为0时的fl强度。
试验例3：检测溶液中ros的选择性实验
采用实施例1合成的auncs进行溶液中ros的检测。
所述选择性实验具体为：
向待测溶液(分别包含100μm的clo-、100μm的onoo-、100μm的·oh、1mm的h2o2、1mm的o2-以及通常出现在生物矩阵中的其他物质，即1mm的ca2+、1mm的zn2+、1mm的fe2+、1mm的谷氨酸(glutamicacid)、1mm的甘氨酸(glycine)、1mm的葡萄糖(glucose)和1mm的牛血清白蛋白(bsa))中分别加入180μl浓度为300μg/ml的auncs并在25℃下反应20min；采用酶标仪测量所述溶液荧光强度。
测试结果如图5，从测试结果可知，所述auncs可以检测溶液中clo-、onoo-和·oh。
试验例4：细胞毒性和细胞形态观察实验
采用huvec细胞和a375细胞在cck-8试剂盒中检测实施例1合成的auncs毒性。
细胞毒性实验具体为：
将所述auncs进行梯度稀释，稀释后最终浓度分别为0μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、160μg/ml和320μg/ml；将10μl的不同浓度的auncs水溶液分别加入一定数目的细胞中并在37℃下孵育24h；加入cck-8试剂；用酶标仪测量其在450nm处的od值。
细胞形态观察实验具体为：
向所述细胞中分别加入10μl浓度为160μg/ml的所述auncs水溶液；在37℃下孵育24小时，使用显微镜观察加入auncs是否对细胞的形态有影响。
细胞毒性实验结果如图6，由测试结果可知，auncs水溶液浓度低于160μg/ml时，细胞的存活率达85％以上。细胞形态观察实验如图7，与控制组相比，即不加auncs水溶液的细胞，细胞的形态没有显著的变化。综上可知，所述荧光金纳米簇的细胞毒性小，有较好的生物相容性。
试验例5：细胞内ros成像
把实施例1合成的20μl浓度为320μg/ml的auncs与huvec细胞在37℃下孵育3小时；然后洗去没有进入细胞的auncs；向存在auncs的细胞内加入不同的ros(h2o2或hclo)；同时在荧光共聚焦下观察并且每隔3min记录一次数据。
检测结果如图8和图9，其中图9的横坐标为观察时间，纵坐标为f/f0的计算结果，f为所述不同浓度溶液的荧光强度(fl强度)，f0为溶液中ros浓度为0时的fl强度。由测试结果可知，细胞中的auncs在连续光照下的荧光信号无明显变化。
试验例6：检测细胞内ros
首先将实施例1合成的20μl浓度为320μg/ml的auncs和ros商用试剂盒中的探针与细胞在37℃下孵育20min；洗去没有进入细胞的auncs和探针；向所述细胞中加入不同浓度(0、0.1、0.2、0.4、1和2mm)的h2o2，然后利用流式细胞仪去测每个细胞的荧光强度并统计分析。
图10为所述auncs和商用试剂盒测量不同浓度的h2o2溶液的测试结果，其中，图10横坐标为h2o2溶液的浓度，纵坐标为(f0-f)/f0的计算结果，其中f为所述不同浓度溶液的荧光强度(fl强度)，f0为溶液中h2o2浓度为0时的fl强度。图11为由所述auncs检测细胞内h2o2的流式细胞术结果；图12为由所述商用试剂盒检测细胞内h2o2的流式细胞术结果。结果表明，由auncs检测的检测结果和用所述商用试剂盒检测的检测结果趋势一致，并且没有显著的差异。
尽管在此，已对本发明进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，所属领域技术人员可进行各个条件的适当变化。可以理解的是，本发明不限于所述实施方案概括和具体实例，其权利归于权利要求的范围，并包括所述每个因素的等同替换。