一种羽绒水解物修饰的金纳米簇及其制备方法与流程

本发明属于功能生物纳米材料技术领域,具体涉及一种羽绒水解物修饰的荧光金纳米簇的制备方法。将羽绒处理得到的小分子量的角蛋白以及多肽分子作为模板与氯金酸溶液反应，合成荧光金纳米簇。

背景技术：

金纳米簇是纳米材料领域一个新的研究热点。直径2-3纳米的金纳米簇(auncs)具有显著的尺寸效应和荧光特性，绿色无毒，并且具有优良的电学和化学性质。金纳米簇已成为当今材料学、化学以及分析传感领域的研究热点，并被广泛应用于荧光标记以及重金属离子检测与药物传递等领域。

目前，金纳米簇的制备思路主要是利用三价au离子作为金源，利用液相的还原反应将其还原为零价的au原子，进而形成具有荧光特性的金纳米簇。但是这种方法合成的金纳米簇容易聚集形成粒径较大且没有荧光的金纳米颗粒。为了解决这个问题，科学家们利用各种配体分子作为模板参与到金纳米簇的还原制备过程中，控制金纳米簇的尺寸，并增强金纳米簇在液相中的分散性及稳定性。由此可见，选择合适的表面修饰模板分子对于金纳米簇的成功制备起到了至关重要的作用。这些模板分子通常具有良好的液相分散性，且具有能够与金原子具有较强相互作用的功能基团，主要包括蛋白质、高聚物、硫醇盐、dna、树枝状大分子以及其他一些小分子等。例如cn105363043a公布了一种以bsa为模板制备荧光金纳米簇的方法，kennedy等以柠檬酸钠为还原剂，合成了一种以单链dna为模板的蓝色荧光的金纳米簇，并且发现以30个胞嘧啶构成的单链dna为模板在低ph值且dna过量的情况下可以产生荧光，而以30个腺嘌呤构成的单链dna为模板只有在中性条件且dna与au的比例为1：1的情况下才可以产生荧光。本课题组前期也利用含有半胱氨酸的特定序列的短肽分子作为模板，合成了两种具有红色荧光特性的金纳米簇并将其应用于细胞核仁的选择性标记(cn106085420a，cn106010513a)利用生物分子为模板制备荧光金纳米簇，其优点是方法简单快速，产品性状稳定且绿色环保，但是蛋白质、短肽及核糖核酸分子的合成费时且成本较高，限制了相应的金纳米簇的合成规模。

技术实现要素：

为了克服上述不足，本发明提供了一种羽绒水解物修饰的金纳米簇的制备方法，解决了现有荧光金纳米簇制备过程中，所用模板合成费时，成本高的问题。

为了实现上述目的，本发明涉及的一种羽绒水解物修饰的金纳米簇，以羽绒水解物作为模板与氯金酸进行水热反应合成，水热反应溶液中羽绒水解角蛋白含量为5－30mg/ml，氯金酸含量为0.1－3mmol/l。

本发明涉及的一种以羽绒水解蛋白为模板的金纳米簇的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将经过预处理的羽绒放入氢氧化钠溶液中，在60－100℃下水解，然后固液分离得到粗制羽绒水解溶液；

(2)用截留分子量为500－3000d的透析袋对粗制角蛋白溶液进行透析，得到纯化后的羽绒水解溶液；

(3)向纯化后的羽绒水解溶液中加入氯金酸，调节溶液中角蛋白溶液的浓度为5－30mg/ml，氯金酸溶液的浓度为0.1－3mmol/l，ph＝8－13，然后在60－100℃，水热反应4－10h，冷却至室温后，离心去除大分子，得到金纳米簇溶液。

优选地，所述步骤(1)预处理过程具体为：将洗净后的羽绒，置于脱脂剂中进行脱脂，然后采用0.22μm滤膜抽滤，得到的不溶物即为预处理的羽绒。

优选地，所述步骤(1)预处理过程也可以为：将洗净后的羽绒，置于脱脂剂中，室温下搅拌1-2h后采用0.22μm滤膜抽滤，得到脱脂后的羽绒，再在室温下，将脱脂后的羽绒置于1－3mol/l的盐酸或1－3mol/l的亚硫酸盐溶液中搅拌1-2h，然后采用0.22μm滤膜抽滤，得到的不溶物即为预处理的羽绒。

优选地，所述中羽绒为鸭绒或鹅绒；脱脂剂包括但不限于95％的乙醇。

优选地，所述步骤(1)中，氢氧化钠溶液的浓度为0.1－1mol/l，水解时间为4-10h；采用0.22μm滤膜抽滤进行固液分离。

优选地，所述步骤(2)中，透析时间为12-48h。

优选地，步骤(3)中，还向纯化后的羽绒水解溶液中加入还原剂硼氢化钠或tcep，调节后溶液中硼氢化钠的浓度为0.001－1mmol/l，tcep的浓度为1－10mmol/l，离心过程中转速为2000－5000rpm，时间为10－30min。

本发明涉及的羽绒水解物修饰的荧光金纳米簇用于生物标记、重金属分析、电极复合材料制备、抗体偶联以及复合光催化剂制备等各个方向。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)有效地利用廉价的羽绒为原料制得具有荧光特性的金纳米簇，实现羽绒的高附加值和无害转化；(2)制备方法工艺简单、操作性强、成本低、可以实现大规模的金纳米簇的制备，易于产业化，对环境友好；(3)制备的荧光金纳米簇用于生物标记、重金属分析、抗体标记和细胞染色；(4)羽绒水解物中不但含有大量的角蛋白，还有多肽等多种物质，特别适合作为模板用于制备荧光金纳米簇。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的金纳米簇的荧光发射光谱。

图2为本发明实施例1制备的金纳米簇的紫外可见吸收光谱。

图3为本发明实施例1制备的金纳米簇的透射电子显微镜表征图。

图4为本发明实施例1制备的金纳米簇的产品在白光(a)以及365nm紫外灯(b)照射下的照片。

图5为本发明实施例1制备的金纳米簇的与细胞共育之后在激光连续照射下的成像效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明做进一步说明。

实施例1：

(1)将用超纯水清洗后的10g鸭绒放入200ml，95％乙醇中，室温下搅拌1h，溶液呈黄色，然后使用0.22μm滤膜抽滤，完成羽绒脱脂，得到预处理后的羽绒。

(2)将预处理后的羽绒放入200ml，0.5mol/l的氢氧化钠溶液中，然后在磁力搅拌下于水浴锅中在80℃下加热7h，使羽绒水解，最后冷却至室温，使用0.22μm滤膜抽滤，得到粗制羽绒水解溶液。

(3)利用1000d的透析袋对粗制羽绒水解溶液进行透析，时间为24h，得到纯化后的羽绒水解溶液，并用nanodrop测定羽绒水解溶液中角蛋白的质量浓度为28.9mg/ml。

(4)向步骤(3)中得到纯化后的羽绒水解溶液中加入氯金酸，再加入超纯水和1mol/l的氢氧化钠溶液调整溶液的浓度和ph，调整后溶液ph＝13，角蛋白的浓度为20mg/ml，氯金酸的浓度为1mmol/l。

(5)将步骤(4)调整后的溶液放入水浴锅中在80℃下反应8h，冷却至室温，得到淡黄色的溶液。再放入离心机中以3000rpm的转速离心30min，除去不溶解的沉淀，最后得到金纳米簇溶液。

对实施例1制备的荧光金纳米簇进行表征，结果如图1-3所示。从荧光发射谱图可以看出在400nm激发下，金纳米簇在400-600nm区间有很强的荧光发射，最大发射峰在500nm附近。吸收光谱显示产品没有出现典型的金纳米颗粒在520nm处的吸收峰，证明产品应为尺寸更小的金纳米簇。从透射电镜表征图可以看出制备得到的荧光金纳米簇粒径分布相对不均匀，但基本都小于5nm。白光照射金纳米簇溶液，呈淡黄色，在紫外灯照射下，金纳米簇溶液显示蓝绿色，具有荧光性，见图4。

应用例1：

将实施例1制备的羽绒水解物修饰的金纳米蔟与hela细胞在37℃,co2含量5％的恒温培养箱内共同孵育8小时得到细胞爬片。将上述细胞爬片用4％多聚甲醛固定后，用共聚焦激光扫描系统成像。成像条件：100x油镜在405nm的激光激发，信号收集通道662-737nm。

实施例2：

(1)将用超纯水清洗后的15g鸭绒放入200ml，95％乙醇中，室温下搅拌1h，溶液呈黄色，然后使用0.22μm滤膜抽滤，完成羽绒脱脂，得到预处理后的羽绒。

(2)将预处理后的羽绒放入200ml，0.5mol/l的氢氧化钠溶液中，然后在磁力搅拌下于水浴锅中在80℃下加热8h，使羽绒水解，最后冷却至室温，使用0.22μm滤膜抽滤，得到粗制羽绒水解溶液。

(3)利用500d的透析袋对粗制羽绒水解溶液进行透析，时间为24h，得到纯化后的羽绒水解溶液，并用nanodrop测定其角蛋白的质量浓度为34mg/ml。

(4)向步骤(3)中得到纯化后的羽绒水解溶液中加入氯金酸，再加入超纯水和1mol/l的氢氧化钠溶液调整溶液的浓度和ph，调整后溶液ph＝13，角蛋白的浓度为20mg/ml，氯金酸的浓度为1mmol/l。

(5)将步骤(4)调整后的溶液放入水浴锅中在80℃下反应8h，冷却至室温，得到淡黄色的溶液。再放入离心机中以4000rpm的转速离心30min，除去不溶解的沉淀，得到金纳米簇溶液。

实施例3

(1)将用超纯水清洗后的5g鸭绒放入200ml，95％乙醇中，室温下搅拌1h，溶液呈黄色，然后使用0.22μm滤膜抽滤，对羽绒进行脱脂，将脱脂后的羽绒置于33mol/l的亚硫酸盐中，室温下搅拌1h，破坏羽绒纤维的膜结构，使羽绒更加松散，再使用0.22μm滤膜抽滤，得到预处理后的羽绒。

(2)将预处理后的羽绒放入200ml，0.1mol/l的氢氧化钠溶液中，然后在磁力搅拌下于水浴锅中以60℃加热4h，使羽绒水解，最后冷却至室温，使用0.22μm滤膜抽滤，得到粗制羽绒水解溶液。

(3)利用500d的透析袋对粗制羽绒水解溶液进行透析，时间为12h，得到纯化后的羽绒水解溶液，并用nanodrop测定其角蛋白的质量浓度为15mg/ml。

(4)向步骤(3)中得到纯化后的羽绒水解溶液中加入氯金酸和硼氢化钠，再加入超纯水和1mol/l的氢氧化钠溶液调整溶液的浓度和ph，调整后溶液ph＝8，角蛋白的浓度为5mg/ml，氯金酸的浓度为0.1mmol/l，硼氢化钠浓度为0.001mmol/l。

(5)将步骤(4)调整后的溶液放入水浴锅中在60℃下反应4h，冷却至室温，得到淡黄色的溶液。再放入离心机中以2000rpm的转速离心10min，除去不溶解的沉淀，得到金纳米簇溶液。

实施例4

(1)将用超纯水清洗后的10g鸭绒放入放入200ml，95％乙醇中，室温下搅拌2h，溶液呈黄色，然后使用0.22μm滤膜抽滤，对羽绒进行脱脂，将脱脂后的羽绒置于1mol/l的盐酸中，室温下搅拌1h，破坏羽绒纤维的膜结构，使羽绒更加松散，再使用0.22μm滤膜抽滤，得到预处理后的羽绒。

(2)将预处理后的羽绒放入200ml，1mol/l的氢氧化钠溶液中，然后在磁力搅拌下于水浴锅中以100℃加热10h，使羽绒水解，最后冷却至室温，使用0.22μm滤膜抽滤，得到粗制羽绒水解溶液。

(3)利用3000d的透析袋对粗制羽绒水解溶液进行透析，时间为24h，得到纯化后的羽绒水解溶液，并用nanodrop测定其角蛋白的质量浓度为20mg/ml。

(4)向步骤(3)中得到纯化后的羽绒水解溶液中加入氯金酸和tcep，再加入超纯水和1mol/l的氢氧化钠溶液调整溶液的浓度和ph，调整后溶液ph＝12，角蛋白的浓度为30mg/ml，氯金酸的浓度为3mmol/l，tcep的浓度为10mmol/l。

(5)将步骤(4)调整后的溶液放入水浴锅中在100℃下反应10h，冷却至室温，得到淡黄色的溶液。再放入离心机中以5000rpm的转速离心30min，除去不溶解的沉淀，得到金纳米簇溶液。