一种利用定量核磁共振技术测定甾醇含量的方法与流程

本发明提供一种利用核磁共振氢谱测定甾醇和/或其衍生物含量的方法。

背景技术：

甾醇及其衍生物包括天然和合成的甾醇及其衍生物。天然甾醇及其衍生物包括植物和动物甾醇及其衍生物。其中，植物甾醇(phytosterols,plant sterols)是一类以环戊烷全氢菲(甾核)为骨架的天然醇类化合物，是植物体内构成细胞膜的成分之一。该类化合物结构类似于胆固醇，具有降低胆固醇、防治心血管疾病等作用，是一类安全有效的天然植物化学物。1999年，美国食品药品监督管理局(FDA)就已批准添加植物甾醇的食品可使用“有益健康”标签。2000年，美国FDA通过了对植物甾醇的健康声明，含植物甾醇的人造奶油和色拉酱被列入功能食品，广泛用于人群慢性病的预防。2001年美国国家胆固醇教育项目(ATPIII)建议：在特定人群的膳食中每日补充2g植物甾醇可以降低血浆中胆固醇以及低密度脂蛋白胆固醇的水平，从而降低冠心病的发病风险。目前，欧、美、日等国已将植物甾醇作为食品添加剂广泛用于人造黄油、烹调油等功能食品。在我国，2010年植物甾醇被批准为新资源食品。

因甾醇及其衍生物分子中没有紫外特征吸收，进行含量测定时无法直接采用最常见的紫外-可见分光光度法。目前，测定甾醇含量的方法主要有(1)衍生化后的紫外-可见分光光度法。该法的样品预处理步骤繁琐，重现性较差，线性范围窄；(2)气相色谱法(GC)。通常采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)，需要先将样品皂化后，再进行TMS酯化衍生反应，然后经气相色谱进行基线分离，通过建立主要单体化合物的含量测定方法后，最后利用加和单体含量来代表有效部位总含量。该方法只能测定几种已知甾醇的含量，忽略结构相似的其他未知组分，使总含量的结果不够准确。也有采用核磁共振技术测定甾醇含量的报道，但所选用的定量峰，容易受到其它峰干扰，测定结果同样不够准确。谋求一种准确、快速、简便易行的甾醇含量精确测定方法十分必要。

技术实现要素：

为了克服现有测定甾醇含量方法中存在的不足之处，本发明提供一种核磁共振氢谱测定甾醇及其衍生物含量的方法，该方法利用核磁共振内标法，选择特定的甾醇及其衍生物定量峰，测定甾醇及其衍生物的含量，具有快速、简便、准确等优点。

为此，本发明一方面提供一种利用核磁共振技术测定甾醇和/或其衍生物含量的方法，所述方法包括以下步骤：将含甾醇和/或其衍生物的样品溶于内标溶液，配制供试液，测定供试品的核磁共振氢谱，选择甾醇和/或其衍生物的定量峰和内标定量峰进行积分，分别得到甾醇和/或其衍生物的定量峰积分面积A_f及内标定量峰积分面积A_s，由面积A_f及面积A_s得到甾醇和/或其衍生物的含量，其中，甾醇和/或其衍生物包括选自甾醇、甾醇酯、甾醇糖苷和甾醇醚中的一种或两种以上化合物，其特征在于所述甾醇和/或其衍生物的定量峰为3位的H峰。

优选地，在上述方法中，甾醇和/或其衍生物的含量根据以下公式(1)进行计算：

$W_f=W_s\×\frac{A_f}{A_s}\×\frac{N_s}{N_f}\×\frac{M_f}{M_s}\×P_s---\left(1\right)$

其中：W_f为甾醇和/或其衍生物的质量；W_s为内标物的质量；A_f为甾醇和/或其衍生物定量峰的积分面积；A_s为内标物定量峰的积分面积；N_f为甾醇和/或其衍生物定量峰所包含的氢个数；N_s为内标物定量峰所包含的氢个数；M_f为甾醇和/或其衍生物的分子量；M_s为内标物的分子量；P_s为内标物的纯度校正因子。

优选地，上述方法中，所述的甾醇和/或其衍生物为天然的甾醇和/或其衍生物、或者合成的甾醇和/或其衍生物。所述的天然的甾醇和/或其衍生物为植物的甾醇和/或其衍生物、动物甾醇和/或其衍生物、或者微生物甾醇和/或其衍生物。优选所述甾醇和/或其衍生物为植物的甾醇和/或其衍生物。

优选地，上述方法中，所述的甾醇和/或其衍生物包括选自β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、Δ⁵-燕麦甾醇、Δ⁷-燕麦甾醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、马尾藻甾醇、24-氢过氧基-24-乙烯基胆甾醇、24R,28R-环氧-24-乙基胆甾醇、24S,28S-环氧-24-乙基胆甾醇、24-氢过氧基豆甾-5,24(28)-二烯-3β-醇、24-乙烯氧基胆甾-5,23-二烯-3β-醇、豆甾-3β-羟基-5,23,25-三烯、胆甾-5,22-二烯-3β-羟基-24-酮、24-羰基-胆甾醇、24-亚甲基-胆甾醇、3β,28ξ-二羟基-24-乙基-5,23(Z)胆甾二烯；它们与棕榈酸、亚油酸、亚麻酸、EPA、DHA、琥珀酸、烟酸、阿魏酸、绿原酸、磷脂等形成的酯；以及它们与葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、古洛糖醛酸等形成的糖苷中的一种或两种以上化合物。

优选地，上述方法中，所述含甾醇和/或其衍生物的样品为含有选自甾醇、甾醇酯、甾醇糖苷和甾醇醚中的两种以上化合物的样品，所述甾醇和/或其衍生物含量为甾醇和/或其衍生物的总含量。优选地，以岩藻甾醇或其相应衍生物、或者β-谷甾醇或其相应衍生物的分子量作为M_f以代表总甾醇和/或其衍生物的分子量，根据所述公式(1)进行计算。

优选地，上述方法中，所述内标物为选自1,3,5-三甲基苯、对苯二酚、1,3,5-三氧六环、1,2,4,5-四氯苯，2,3,4,5-四氯硝基苯，1,4-二硝基苯，对苯二酸，对苯二甲酸二甲酯，对苯二甲酸单甲酯，苯甲酸苄酯和顺丁烯二酸酐中的一种或两种以上。

优选地，上述方法中，内标溶液使用氘代溶剂配制；优选所述氘代溶剂为选自氘代氯仿、氘代二甲基亚砜、氘代甲醇、氘代丙酮、氘代水、氘代二氯甲烷、氘代乙腈、氘代吡啶和氘代乙酸中的一种或两种以上的混合物。

优选地，上述方法中，所述供试品溶液的浓度为使甾醇和/或其衍生物在核磁共振氢谱中的定量峰面积为内标物定量峰面积的0.05至15倍范围的浓度；优选地，所述供试品溶液的浓度为0.1-25mg/ml。

优选地，上述方法中，其中核磁共振氢谱测试的脉冲角为30-90度，弛豫时间大于或等于10s，测试温度为20-45℃。扫描次数可以是大于等于1次。例如，测试条件可以为：脉冲角45度，弛豫时间15s，测试温度25℃，扫描次数32次。

本发明另一方面还提供上述方法用于测定动物、植物和/或微生物的提取物；食品；药品；或者化妆品中的甾醇和/或其衍生物含量的用途。

本发明利用定量核磁共振氢谱测定甾醇和/或其衍生物含量的方法，甾醇和/或其衍生物定量峰选用3-H峰，相对于现有技术，能够更加精确地测定甾醇和/或其衍生物的含量。本发明通过选择特定的定量峰，实现混合物中多个成分的定量分析，尤其是实现了总甾醇类化合物的含量测定。

具体实施方式：

以下实施例仅是示例性的，不对本发明保护范围构成限制。

实施例1：海藻中植物甾醇总含量的测定

(1)供试品溶液的制备

准确称取羊栖菜粗粉750mg，加入4.8mL蒸馏水，室温浸润15min；加入12mL甲醇、6mL二氯甲烷(含0.01％BHT)，震荡2min；加入6mL二氯甲烷震荡30s；加入6mL水震荡30s；5000rpm离心15min，弃上清；加入15g无水硫酸钠，摇床1h，过滤，浓缩得总脂。向总脂中加入1mL 1M KOH/80％乙醇，室温、避光皂化反应15h；向反应液中加入2mL水，用3mL乙醚萃取，共两次；合并乙醚层，4mL水洗至中性，N₂吹干，得乙醚萃取物。

以2,3,4,5-四氯硝基苯为内标，氘代氯仿为溶剂，配制浓度为1.0mg/ml的内标溶液。准确移取0.4ml内标溶液溶解上述干燥乙醚萃取物，充分溶解后，即得供试品溶液。

(2)核磁共振氢谱测定植物甾醇总含量的条件

采用Agilent DD2 500M核磁共振波谱仪，将供试液置于5mm核磁管中密封，按照以下条件进行核磁共振氢谱的测定：脉冲角为45°，弛豫时间d1＝15s，扫描次数nt＝32，测定温度25℃，窗函数lb＝0.3Hz。

选择3-H，δ3.52(1H,m)处共振峰为供试品甾醇定量峰。甾醇定量峰与内标定量峰(s,δ＝7.74)完全分离，且不受其他共振峰的干扰，满足定量要求。

将所得氢谱进行积分处理，按照公式(1)求得供试品中甾醇含量。

$W_f=W_s\×\frac{A_f}{A_s}\×\frac{N_s}{N_f}\×\frac{M_f}{M_s}\×P_s---\left(1\right)$

其中：W_f为供试品中甾醇的质量；W_s为内标物的质量；A_s为内标物定量峰的积分面积；A_f为供试品甾醇定量峰的积分面积；N_f为供试品甾醇定量峰包含的氢个数(1)；N_s为内标物定量峰包含的氢个数(1)；M_f为供试品甾醇的分子量；M_s为内标物的分子量(260.9)；P_s为内标物的纯度校正因子(99.3％)。

(3)核磁共振氢谱测定植物甾醇总含量的方法学建立

①线性关系考察

以2,3,4,5-四氯硝基苯为内标，氘代氯仿为溶剂，配制浓度为1.0mg/ml的内标溶液。以内标溶液为溶剂配制7份不同浓度(0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10mg/mL)的岩藻甾醇标准品溶液。分别精密移取0.4mL上述岩藻甾醇标准品溶液，转移至5mm核磁管中密封。按步骤(2)进行核磁共振氢谱测定。

以岩藻甾醇与内标物定量峰面积的比值为纵坐标，岩藻甾醇质量浓度为横坐标进行线性回归，回归方程为y＝0.6057x+0.0123，相关系数r＝0.9998。实验结果表明，当内标质量浓度为1.00mg/mL时，岩藻甾醇在0.25-10.00mg/mL的范围内线性关系良好。

②定量限和检测限考察

根据核磁共振氢谱，以信噪比S/N＝3时的测定浓度为其相应的检测限(LOD)，以信噪比S/N＝10时的测定浓度为其相应的定量限(LOQ)。采用岩藻甾醇标准品溶液进行实验结果表明，该方法的LOD为31.25μg/mL，LOQ为125.00μg/mL。

③精密度试验

取同一份供试品溶液，按步骤(2)进行核磁共振氢谱测定，测试6次。按公式(1)，M_f以岩藻甾醇分子量412.7计，精密度的RSD为0.95％，表明该方法精密度良好。

④重复性试验

平行制备6份供试品溶液，按步骤(2)进行核磁共振氢谱测定。按公式(1)，M_f以岩藻甾醇分子量412.7计，重复性的RSD为2.36％，表明该方法重复性良好。

⑤稳定性试验

取同一份供试品溶液，按步骤(2)，分别于0、2、4、8、24、48、72小时进行核磁共振氢谱测定。按公式(1)，M_f以岩藻甾醇分子量412.7计，各时间点测定结果的RSD为0.95％，表明供试品溶液在72h内稳定，满足分析测试要求。

⑥回收率试验

采用加标回收率方法测定回收率。称取羊栖菜粗粉750mg，加入相等质量的岩藻甾醇标准品，按步骤(1)平行制备6份供试品溶液，按步骤(2)进行核磁共振氢谱测定。按公式(1)，M_f以岩藻甾醇分子量412.7计，平均回收回收率为99.71％，RSD为4.48％，说明该方法具有较高回收率，即准确性良好。

(4)海藻样品中植物甾醇的总含量测定

分别取不同来源的海藻样品，按步骤(1)制备供试品溶液，按步骤(2)进行核磁共振氢谱测定，每个样品测定3次。按公式(1)，M_f以供试品中的代表性成分岩藻甾醇分子量412.7计，得海藻样品植物甾醇总含量，具体结果见表1。

表1不同来源海藻样品中植物甾醇的总含量(n＝3)

实施例2：羊栖菜提取物中植物甾醇总含量的测定

准确称取不同批次羊栖菜提取物各2g，分别按料液比1:10加入1.5M氢氧化钾乙醇溶液，70℃反应1.5h，得反应液。冷却至室温，加入1倍量乙醚萃取，共萃取两次，合并乙醚层，水洗至中性，氮气吹干，得乙醚萃取物。以2,3,4,5-四氯硝基苯为内标，氘代氯仿为溶剂，配制浓度为1.0mg/mL的内标溶液。准确移取0.4mL内标溶液溶解上述干燥乙醚萃取物，充分溶解后，即得供试品溶液。

按实施例1步骤(2)进行核磁共振氢谱测定，每个样品测定3次。对氢谱进行积分处理，按照实施例1中的公式(1)，M_f以供试品中的代表性成分岩藻甾醇分子量412.7计，得羊栖菜提取物中植物甾醇的总含量，具体结果见表2。

表2不同批次羊栖菜提取物中植物甾醇的总含量(n＝3)

实施例3：玉米油中植物甾醇总含量的测定

准确称取不同批次玉米油各200mg，同实施例2制备得供试品溶液。

按实施例1步骤(2)进行核磁共振氢谱测定，对氢谱进行积分处理，按照实施例1中的公式(1)，M_f以供试品中的代表性成分β-谷甾醇分子量414.7计，得玉米油中植物甾醇的总含量，具体结果见表3。

表3不同批次玉米油中植物甾醇的总含量

实施例4：保健品中植物甾醇总含量的测定

取不同品牌的保健品植物甾醇片各20片，研细，精密称取样品粉末各2.00mg。以2,3,4,5-四氯硝基苯为内标，氘代氯仿为溶剂，配制浓度为1.0mg/ml的内标溶液。向各样品粉末准确加入0.4mL上述内标溶液使其充分溶解，10000rpm离心5min，取上清液作为供试液。

按照实施例1步骤(2)进行核磁共振氢谱测定。对氢谱进行积分处理，按照实施例1中的公式(1)，M_f以供试品中的代表性成分β-谷甾醇分子量414.7计，得植物甾醇片中植物甾醇的总含量，具体结果见表4。

表4市售不同品牌植物甾醇片中植物甾醇的总含量

实施例5：核磁共振氢谱测定保健品中植物甾醇总含量的方法

取不同品牌保健品植物甾醇片各20片，研细，精密称取样品粉末各2.00mg。以2,3,4,5-四氯硝基苯为内标，氘代丙酮为溶剂，配制浓度为1.0mg/ml的内标溶液。向各样品粉末准确加入0.4mL上述内标溶液使其充分溶解，10000rpm离心5min，取上清液作为供试液。

按照实施例1步骤(2)进行核磁共振氢谱测定。选择3-H，δ3.38(1H,m)处共振峰为供试品甾醇定量峰。甾醇定量峰与内标定量峰(s，δ＝8.21)完全分离，且不受其他共振峰的干扰，满足定量要求。按照实施例1中的公式(1)，M_f以供试品中的代表性成分β-谷甾醇分子量414.7计，得植物甾醇片中植物甾醇的总含量，具体结果见表5。

表5市售不同品牌植物甾醇片中植物甾醇的总含量

实施例6：保健品中植物总甾醇含量的测定

取不同品牌保健品植物甾醇片各20片，研细，精密称取样品粉末各2.00mg。以对苯二甲酸二甲酯为内标，氘代氯仿为溶剂，配制浓度为1.0mg/ml的内标溶液。向各样品粉末准确加入0.4mL上述内标溶液使其充分溶解，10000rpm离心5min，取上清液作为供试液。

按照实施例1步骤(2)进行核磁共振氢谱测定。选择3-H峰，δ3.52(1H,m)处共振峰为定量峰。甾醇定量峰与内标定量峰(s，δ＝8.10)完全分离，且不受其他共振峰的干扰，满足定量要求。按照公式(1)，M_f以供试品中的代表性成分β-谷甾醇分子量414.7计，Ns为内标物定量峰包含的氢个数(4)，Ms为内标物的分子量(194.2)；Ps为内标物的纯度校正因子(99.9％)。计算得植物甾醇片中植物总甾醇的含量，具体结果见表6。

表6市售不同品牌植物甾醇片中植物甾醇的总含量

实施例7：核磁共振氢谱测定甾醇酯含量的方法

以2,3,4,5-四氯硝基苯为内标，氘代氯仿为溶剂，配制浓度为1.0mg/ml的内标溶液。精密称取合成样品马尾藻甾醇3-硬脂酸酯粉末2.00mg，准确加入0.4mL上述内标溶液使其充分溶解，得供试品溶液。

按照实施例1步骤(2)进行核磁共振氢谱测定。选择3-H，δ＝4.61(1H,m)处共振峰为马尾藻甾醇3-硬脂酸酯定量峰，与内标定量峰(1H，s，δ＝7.74)完全分离，且不受其他共振峰的干扰，满足定量要求。按照实施例1中的公式(1)，M_f以马尾藻甾醇3-硬脂酸酯分子量695.2计，所测合成品中马尾藻甾醇3-硬脂酸酯的含量为98.50％。

实施例8：甾醇糖苷含量的测定

以2,3,4,5-四氯硝基苯为内标，氘代二甲基亚砜为溶剂，配制浓度为1.0mg/ml的内标溶液。精密称取实验室自制的谷甾醇-3-O-β-葡萄糖苷2.00mg，准确加入0.4mL上述内标溶液使其充分溶解。

按照实施例1步骤(2)的条件进行核磁共振氢谱测定。选择3-H，δ＝3.66(1H,m)处共振峰为谷甾醇-3-O-β-葡萄糖苷定量峰，与内标定量峰(1H，s，δ＝8.48)完全分离，且不受其他共振峰的干扰，满足定量要求。按照实施例1中的公式(1)，M_f以谷甾醇-3-O-β-葡萄糖苷的分子量576.9计，所测供试品中谷甾醇-3-O-β-葡萄糖苷的含量为99.23％。

本发明的利用定量核磁共振技术测定甾醇和/或其衍生物含量的方法，优势主要表现在如下几个方面：(1)甾醇样品拥有多组信号峰。本发明通过选择特定信号峰作为定量峰，可对单个甾醇以及总甾醇的含量进行准确测定，实现了总甾醇和/或其衍生物的定量分析。(2)鉴定和检测可以同步进行。本发明的方法可以同时提供物质结构和含量信息，特别是具有独特的异构体识别能力，这是现有技术不可比拟的。(3)实验消耗少，对样品无破坏性，实验完成后样品可以回收，特别适用于不稳定化合物以及大批量样品的测定。(4)样品制备简单，无需事先进行色谱分离，不需要衍生化，可操作性强，是一种全新的简便、快速、准确的分析方法。