一种检测真菌和皮肤寄生虫的荧光染色剂的制作方法

本发明涉及一种检测真菌和皮肤寄生虫的荧光染色剂。

背景技术：

真菌性疾病：真菌引起的疾病称为真菌病，临床上真菌病可分为浅部真菌病和深部真菌病或系统性真菌病。浅部真菌病由只侵犯人体皮肤、毛发和甲等浅表组织的真菌引起。在我国90％以上的真菌病属于浅部真菌病。引起系统性真菌病的病原真菌包括组织胞浆菌、芽生菌、球孢子菌和副球孢子菌，这些都是双相真菌，在自然界中以霉菌形态菌如隐球菌属、念珠菌属、曲霉属等均可致严重的系统感染。随着器官移植的大量开展及免疫抑制剂、肿瘤患者化疗药物的广泛使用，以及糖尿病等慢性疾病患者的增多，真菌病的发病率和死亡率在逐年增加，对人类健康的危害日趋严重。

皮肤寄生虫病：皮肤寄生虫病是指寄生虫以不同方式侵袭人体引起的皮肤病。依寄生虫的种类和数量不同、人体(寄主)状况和受侵器官的不同，表现各种不同的疾病。常见的包括毛囊虫、疥虫、滴虫及阴虱等。毛囊虫又称蠕形螨，寄生于人的毛囊和皮脂腺，是一种永久性寄生螨。毛囊虫引起的慢性炎症叫蠕形螨病，临床表现为面部，背部等皮脂溢出部位的红斑，丘疹，脓疱，结痂，脱屑。疥虫，人们通常称它为疥螨，这种寄生虫是通过身体接触进行传播的。疥螨可以引起疥疮，疥疮可以通过密切接触通过皮肤等传染。滴虫是一种极微小有鞭毛的原虫生物，一般都是经由性行为而感染。阴道滴虫症是由滴虫所引起的一种性病，常致阴道粘膜炎症、粘膜充血，有假膜样白斑，白带增多，呈泡沫状。阴虱病是由寄生在人体阴毛和肛门周围体毛上的阴虱叮咬附近皮肤，而引起瘙痒的一种皮肤接触性传染性寄生虫病。主要表现为抓痕、血痂、继发性脓疱疮、毛囊炎或灰青色或淡青色斑等。

真菌检测：由于对很多真菌感染的微生物学特性了解甚少，因而出现临床诊治的困难，加之真菌感染的临床表现多种多样，故通常会出现临床的误诊漏诊，导致患者病情迁延甚至危及生命。面对这种现状，如何提高真菌病的诊断水平已成为国内外临床工作者们共同关心的热点问题。尽管分子生物学等非培养技术的迅猛发展，目前仍缺乏早期快速的诊断方法，这些都给真菌病的预防和诊治带来挑战。因此，逐步开展临床致病真菌检测的研究对于临床上致病真菌的快速诊断及早期针对性的用药具有深刻的指导意义。

临床常见的用于真菌检测的方法包括镜检法、培养法和组织病理学方法等。

1.直接镜检法：直接涂片镜检是一种常用、简便而迅速的真菌检测方法,对真菌感染的诊断具有重要意义。直接涂片镜检是将所取标本直接置于玻片上,用染色或加10％KOH溶液,在光镜下检查。但是真菌与组织细胞之间的反差不大，鉴别真菌非常困难，还需要进一步培养鉴定。另外，直接镜检阴性也不能排除真菌感染的可能性。

2.分离培养方法：从临床标本中对致病菌进行培养，目的在于从临床标本中分离真菌,以确定是否有真菌感染,特别是在直接镜检为阴性时。从疑似患者身上采集的标本可以直接接种在培养基上。一般培养超过2周仍无真菌生长,可报告阴性。培养法虽然检测结果准确性高，但由于真菌生长缓慢，培养常需要数天甚至数周才有结果，常会延误患者病情。

3.组织病理学检查：真菌病的组织病理检查与直接镜检法和培养法同样具有相当重要的价值，尤其对于深部真菌病的诊断意义更大。通过病理组织的检查可确立感染的存在，排除真菌学检查中出现的污染等现象，PAS染色、嗜银染色、黏蛋白卡红染色及阿尔辛蓝染色等可有助于组织中真菌的检测。然而，组织病理学染色只能确定部分真菌种属，适用范围受到限制。

皮肤寄生虫检测：皮肤寄生虫检测一般包括病原学检查方法、免疫学检查方法和分子生物学检查。

1.病原学检查：临床上常取病人标本置于玻片上，滴一滴生理盐水或碘液，在光学显微镜下观察寄生虫形态。病原学检查是一种常用、简便的皮肤寄生虫检测方法,但检出率偏低，容易造成漏诊。

2.免疫学检查方法：常见的包括皮内试验和血清免疫学试验，灵敏度及特异性均较高。这些方法主要用于检测寄生虫的特异性抗体，目前也已建立检测虫体循环抗原或排泄抗原的方法，以作早期诊断及疗效的考核。

3.分子生物学检查：DNA探针杂交技术、聚合酶链反应(PCR)检测部分寄生虫的DNA。此法对部分寄生虫进行了分类鉴定，并对其重要功能基因进行克隆和筛选，已成为诊断和研究寄生虫病的重要手段，但目前由于技术限制并未普及。

荧光染色法：荧光染色法通过使用化学荧光增白剂，与组织样品的β-多糖物质相结合，如纤维素、几丁质等。在荧光显微镜的紫外激发光下呈现荧光。通过荧光染料与真菌细胞壁及寄生虫的多糖成分非特异性结合，能够对真菌和寄生虫感染导致的各种疾病进行检测。早在上个世纪八十年代，就有研究者发现一种荧光增白剂能标记真菌细胞壁的几丁质成分，并开始使用荧光法检测真菌。国内外已经有很多实验证实了荧光染色法具有阳性率高的优点。

然而目前荧光染色法未能得到广泛应用，终其原因主要有以下几个方面的问题。首先，荧光染色法一般需要三种主要成分，包括荧光增白剂、氢氧化钾和背景复染剂。荧光增白剂与组织中β-多糖成分相结合，产生荧光；氢氧化钾能溶解样品组织中的角质、消除杂质，并使组织透明；而背景复染剂能降低样品组织的背景亮度，使荧光信号更加清晰。然而，由于荧光增白剂在强碱环境中稳定性差，荧光素会发生析出沉淀现象；而且背景复染剂也会影响荧光增白剂的稳定性，会引起检测灵敏度的降低，甚至无法对真菌染色。因此，在现有技术下，荧光染色法所需的这三种染色液成分无法稳定长期共存，需分别配制储存，染色时需要三个步骤才能完成，操作上相对繁琐，染色时间相对较长，据早期文献记载，整个染色过程需要20分钟。随着技术的进步，现在市面上已经有荧光染色两步法的试剂盒，操作步骤得到简化，染色时间也相对缩短，但依旧无法达到临床对真菌及皮肤寄生虫快速筛查的要求。其次，此方法对检测的标本具有局限性，只能溶解一些杂质少的标本，而对于痰液、厚甲标本和大的脚皮，染色效果很差。因此此方法的临床适用范围得到限制。

技术实现要素：

本发明是为了解决目前的荧光染色法的三种染色液成分无法稳定长期共存，需分别配制储存，操作繁琐，染色时间较长，对检测的标本具有局限性，只能溶解一些杂质少的标本，临床适用范围受限的技术问题，而提供一种检测真菌和皮肤寄生虫的荧光染色剂。

本发明的一种检测真菌和皮肤寄生虫的荧光染色剂由水、荧光增白剂、碱、背景复染剂、促溶剂和保湿剂组成；所述的荧光染色剂中荧光增白剂的浓度是0.0001g/mL～0.03g/mL，碱的浓度是0.1g/mL～0.2g/mL、背景复染剂的浓度是0.0002g/mL～0.03g/mL，促溶剂的体积浓度是5％～40％，保湿剂的体积浓度是0.5％～35％。

本发明原理：荧光染色法通过使用化学荧光增白剂，与组织样品的β-多糖物质相结合，如纤维素、几丁质等，而不能结合组织细胞。在荧光显微镜的紫外激发光下呈现荧光。将组织细胞与真菌区分且反差巨大。本发明加入合适比例的氢氧化钾能溶解样品组织中的角质、消除杂质，促溶剂的加入使得样品组织中的角质溶解得更加迅速，组织更加透明，通过加入保湿剂解决了荧光增白剂与背景染料两者互溶放置后稳定性较差的问题，提高检测灵敏度。选取的背景复染剂能降低样品组织的背景亮度，使荧光信号更加清晰。促溶剂和保湿剂的协同作用使得荧光增白剂能够与背景复染剂稳定性好，只需一步操作即可完成染色，临床使用更加方便、快捷，原本需要5分钟以上才能完成的检测现在只需数十秒即可，大大提高真菌及皮肤寄生虫的检测效率；打破了现有两步法染色，真正做到单剂一步染色；本发明独有的保湿成分，提高了阳性标本保存时间，有利于阳性示教片的复查和教学。

本发明的优点：

1、本申请配方为单剂型，使得荧光增白剂能够与强碱和背景复染剂能够稳定共存；产品稳定性好，只需一步操作即可完成染色，临床使用更加方便、快捷，原本需要5分钟以上才能完成的检测，本申请只需数十秒即可完成，大大提高真菌和皮肤寄生虫的检测效率；

2、本申请的荧光染色剂所含的强碱和促溶剂，能快速溶解标本，针对所有的标本，包括痰液、厚甲标本和大的脚皮染色效果佳，真菌或寄生虫更易被标记；

3、本申请的荧光染色剂不仅能针对所有真菌进行标记，还能检测皮肤寄生虫，如毛囊虫、疥虫、阴虱等；

4、本申请的荧光染色剂独有的保湿成分，提高了阳性标本保存时间，有利于阳性示教片的复查和教学。

附图说明

图1为试验十一中指甲标本滴加质量分数为10％的KOH水溶液的染色效果图；

图2为试验十一中指甲标本滴加荧光染色剂e的染色效果图；

图3为试验十一中指甲标本滴加荧光染色剂f的染色效果图；

图4为试验十一中指甲标本滴加荧光染色剂g的染色效果图；

图5为试验十一中指甲标本滴加荧光染色剂h的染色效果图；

图6为试验十一中指甲标本滴加质量分数为10％的KOH水溶液的染色效果图；

图7为试验十一中脚皮标本滴加荧光染色剂e的染色效果图；

图8为试验十一中脚皮标本滴加荧光染色剂f的染色效果图；

图9为试验十一中脚皮标本滴加荧光染色剂g的染色效果图；

图10为试验十一中脚皮标本滴加荧光染色剂h的染色效果图；

图11为试验十一中外耳道分泌物标本滴加质量分数为10％的KOH水溶液的染色效果图；

图12为试验十一中外耳道分泌物标本滴加荧光染色剂e的染色效果图；

图13为试验十一中外耳道分泌物标本滴加荧光染色剂f的染色效果图；

图14为试验十一中外耳道分泌物标本滴加荧光染色剂g的染色效果图；

图15为试验十一中外耳道分泌物标本滴加荧光染色剂h的染色效果图；

图16为试验十一中鼻腔粘液标本滴加质量分数为10％的KOH水溶液的染色效果图；

图17为试验十一中鼻腔粘液标本滴加荧光染色剂e的染色效果图；

图18为试验十一中鼻腔粘液标本滴加荧光染色剂f的染色效果图；

图19为试验十一中鼻腔粘液标本滴加荧光染色剂g的染色效果图；

图20为试验十一中鼻腔粘液标本滴加荧光染色剂h的染色效果图；

图21为试验十一中痰液标本滴加质量分数为10％的KOH水溶液的染色效果图；

图22为试验十一中痰液标本滴加荧光染色剂e的染色效果图；

图23为试验十一中痰液标本滴加荧光染色剂f的染色效果图；

图24为试验十一中痰液标本滴加荧光染色剂g的染色效果图；

图25为试验十一中痰液标本滴加荧光染色剂h的染色效果图；

图26为试验十二中毛囊虫在滴加一滴荧光染色剂e后荧光显微镜下的效果图；

图27为试验十二中毛囊虫在滴加一滴质量分数为10％的KOH水溶液后荧光显微镜下的效果图；

图28为试验十二中螨虫在滴加一滴荧光染色剂e后荧光显微镜下的效果图；

图29为试验十二中螨虫在滴加一滴质量分数为10％的KOH水溶液后荧光显微镜下的效果图；

图30为试验十二中阴虱虫卵在滴加一滴荧光染色剂e后荧光显微镜下的效果图；

图31为试验十二中阴虱虫卵在滴加一滴质量分数为10％的KOH水溶液后荧光显微镜下的效果图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式为一种检测真菌和皮肤寄生虫的荧光染色剂，具体是由水、荧光增白剂、碱、背景复染剂、促溶剂和保湿剂组成；所述的荧光染色剂中荧光增白剂的浓度是0.0001g/mL～0.03g/mL，碱的浓度是0.1g/mL～0.2g/mL、背景复染剂的浓度是0.0002g/mL～0.03g/mL，促溶剂的体积浓度是5％～40％，保湿剂的体积浓度是0.5％～35％。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：所述的荧光增白剂为二苯乙烯类型荧光增白剂，优选为双三嗪氨基二苯乙烯类型荧光增白剂，具体为荧光增白剂28或卡尔科弗卢尔荧光增白剂。其他与具体实施方式一相同。

本实施方式中所述的荧光增白剂28的结构式为

CAS号为4404-43-7，分子式为C₄₀H₄₄N₁₂O₁₀S₂。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：所述的水为双蒸水。其他与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：所述的碱为无机碱，具体为氢氧化钾或氢氧化钠中的一种或两种的混合物。其他与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四的不同点是：所述的背景复染剂为酚蓝类染料、蓝色偶氮类染料、甲苯胺蓝、番红或瑞氏曙红亚甲蓝。其他与具体实施方式一至四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：所述的酚蓝类染料为溴酚蓝、四溴酚蓝或百里酚蓝。其他与具体实施方式五相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式五不同点是：所述的蓝色偶氮类染料为亚甲基蓝、伊文思蓝或偶氮蓝。其他与具体实施方式五相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七的不同点是：所述的促溶剂为水溶性有机溶剂，具体为二甲基亚砜。促溶剂的作用是提高染料的溶解度和稳定性。其他与具体实施方式一至七相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八的不同点是：所述的保湿剂为甘油、丙二醇、丁二醇中的一种或几种的混合物。保护剂的作用是增加荧光染色剂溶液整体保湿度以及折光度，提高反差，从而使得染色更为清晰。其他与具体实施方式一至八相同。

通过以下试验验证本发明效果：

试验一：本试验为对比试验，具体是按以下步骤进行的：

将荧光增白剂28充分溶于浓度为0.1g/mL的氢氧化钾水溶液中，使荧光增白剂28的浓度为0.001g/mL，再加入伊文思蓝染料，使伊文思蓝染料的浓度为0.005g/mL，得到荧光染色剂a。

试验二：本试验为对比试验，具体是按以下步骤进行的：

将荧光增白剂28充分溶于浓度为0.1g/mL的氢氧化钾水溶液中，使荧光增白剂28的浓度为0.001g/mL，依次加入伊文思蓝和二甲基亚砜，使伊文思蓝染料的浓度为0.005g/mL，二甲基亚砜的体积浓度为15％，得到荧光染色剂b。

试验三：本试验为对比试验，具体是按以下步骤进行的：

将荧光增白剂28充分溶于浓度为0.1g/mL的氢氧化钾的溶液中，使荧光增白剂28的浓度为0.001g/mL，依次加入伊文思蓝和甘油，使伊文思蓝染料的浓度为0.005g/mL，甘油的体积浓度为20％，得到荧光染色剂c。

试验四：本试验为一种检测真菌和皮肤寄生虫的荧光染色剂，具体的制备方法为：

将荧光增白剂28充分溶于浓度为0.1g/mL的氢氧化钾的溶液中，使荧光增白剂28的浓度为0.001g/mL，依次加入伊文思蓝染料、二甲基亚砜和甘油，使伊文思蓝染料的浓度为0.006g/mL，二甲基亚砜的体积浓度为15％，甘油的体积浓度为20％，得到荧光染色剂d。

试验五：本试验为一种检测真菌和皮肤寄生虫的荧光染色剂，具体的制备方法为：

将荧光增白剂28充分溶于浓度为0.1g/mL的氢氧化钾的溶液中，使荧光增白剂28的浓度为0.001g/mL，依次加入伊文思蓝染料、二甲基亚砜和甘油，使伊文思蓝染料的浓度为0.005g/mL，二甲基亚砜的体积浓度为15％，甘油的体积浓度为20％，得到荧光染色剂e。

试验六：本试验为一种检测真菌和皮肤寄生虫的荧光染色剂，具体的制备方法为：

将荧光增白剂28充分溶于浓度为0.1g/mL的氢氧化钾的溶液中，使荧光增白剂28的浓度为0.001g/mL，依次加入伊文思蓝染料、二甲基亚砜和甘油，使伊文思蓝染料的浓度为0.008g/mL，二甲基亚砜的体积浓度为15％，甘油的体积浓度为20％，得到荧光染色剂f。

试验七：本试验为一种检测真菌和皮肤寄生虫的荧光染色剂，具体的制备方法为：

将荧光增白剂28充分溶于浓度为0.15g/mL的氢氧化钾的溶液中，使荧光增白剂28的浓度为0.001g/mL，依次加入伊文思蓝染料、二甲基亚砜和甘油，使伊文思蓝染料的浓度为0.005g/mL，二甲基亚砜的体积浓度为25％，甘油的体积浓度为30％，得到荧光染色剂g。

试验八：本试验为一种检测真菌和皮肤寄生虫的荧光染色剂，具体的制备方法为：

将荧光增白剂28充分溶于浓度为0.15g/mL的氢氧化钾的溶液中，使荧光增白剂28的浓度为0.001g/mL，依次加入伊文思蓝染料、二甲基亚砜和甘油，使伊文思蓝染料的浓度为0.005g/mL，二甲基亚砜的体积浓度为25％，甘油的体积浓度为30％，得到荧光染色剂g。

试验九：荧光染色剂稳定性观察：将试验一至八制备的八种荧光染色剂在室温避光下放置1年后在荧光显微镜下观察染色剂是否有荧光素沉淀析出，每周观察一次，连续观察4周。统计结果见表1，结果表明，荧光染色剂a出现大量的沉淀，稳定性差；荧光染色剂c有少量沉淀，稳定性较差；荧光染色剂b、d、e、f、g和h均无沉淀出现，稳定性好。故后续试验排除试剂a，c，对荧光染色剂b、d、e、f、g和h进行比较。

表1荧光染色剂稳定性观察

试验十：溶解时间比较：取5份同样大小的厚脚皮分别放置在5片载玻片上，分别滴加一滴试验二、四至八制备的荧光染色剂b、d、e、f、g和h，统计平均溶解时间，并在荧光显微镜下观察染色效果，结果见表2。结果表明，荧光染色剂b溶解所需的时间较长，染色效果也较差；荧光染色剂h溶解所需的时间最短，染色效果好；荧光染色剂d，e，f，g溶解时间较短，染色效果好。

表2标本溶解时间比较

试验十一：不同真菌阳性标本的染色效果对比：

采集人体的5个不同部位的真菌阳性标本，具体为脚皮、指甲、痰液、鼻腔粘膜和外耳道分泌物。每个部位分别滴加一滴试验五至八制备的荧光染色剂e，f，g，h和质量分数为10％的KOH水溶液进行染色对比，在荧光显微镜下观察效果。

染色结果见图1-25，图1-5为指甲标本的染色效果图，图1-5依次为滴加质量分数为10％的KOH水溶液、荧光染色剂e，f，g，h的效果图，可以看出荧光染色剂e，h染色效果最好，镜下真菌形态结构清晰，具有典型的菌丝横隔结构；荧光染色剂f由于背景复染剂含量偏高，导致背景暗；而荧光染色剂g由于荧光素含量高，荧光信号强。

图6-10为脚皮标本的染色效果图，图6-10依次为滴加质量分数为10％的KOH水溶液、荧光染色剂e，f，g，h的效果图，可以看出荧光染色剂e，h染色效果最好，镜下真菌形态结构清晰，具有典型的菌丝横隔结构；荧光染色剂f由于背景复染剂含量偏高，导致背景暗；而荧光染色剂g由于荧光素含量高，荧光信号强。

图11-15为外耳道分泌物的染色效果图，图11-15依次为滴加质量分数为10％的KOH水溶液、荧光染色剂e，f，g，h的效果图，可以看出荧光染色剂e，h染色效果最好，镜下孢子呈立体的圆形，部分孢子有出芽结构；试剂f由于背景复染剂含量偏高，导致背景暗，孢子形态不清晰；而荧光染色剂g由于荧光素含量高，背景偏亮，荧光信号强。

图16-20为鼻腔粘液的染色效果图，图16-20依次为滴加质量分数为10％的KOH水溶液、荧光染色剂e，f，g，h的效果图，可以看出荧光染色剂e，h染色效果最好，镜下孢子呈立体的圆形，部分孢子有出芽结构，并发现少量的真菌菌丝。荧光染色剂f由于背景复染剂含量偏高，导致背景暗，孢子形态不清晰；而试剂g由于荧光素含量高，背景偏亮。

图21-25为痰液的染色效果图，图21-25依次为滴加质量分数为10％的KOH水溶液、荧光染色剂e，f，g，h的效果图，可以看出荧光染色剂e，h染色效果最好，镜下有大量的菌丝和孢子的存在，形态结构清晰，菌丝具有典型的横隔结构，孢子呈圆形或椭圆形，呈立体的圆形，部分孢子有出芽结构，并发现少量的真菌菌丝。荧光染色剂f由于背景复染剂含量偏高，导致背景暗；而试剂g由于荧光素含量高，荧光信号亮。

结果表明：不同真菌阳性标本滴加本发明的荧光染色剂后，在紫外激发光(UV280-400nm滤镜)下，镜下可见真菌发荧光，背景呈蓝色或绿色，与KOH湿片法的结果对比，荧光染色法真菌的形态特征十分清晰、明显，结构典型，易辨认。

试验十二：皮肤寄生虫标本的染色结果：采集皮肤寄生虫标本，包括毛囊虫，螨虫，阴虱虫卵，滴加一滴试验五制备的荧光染色剂e，30秒后在荧光显微镜下观察效果。并使用质量分数为10％的KOH水溶液作为对照。

图26为毛囊虫在滴加一滴荧光染色剂e后荧光显微镜下的效果图，图27为毛囊虫在滴加一滴质量分数为10％的KOH水溶液后荧光显微镜下的效果图；

图28为螨虫在滴加一滴荧光染色剂e后荧光显微镜下的效果图，图29为螨虫在滴加一滴质量分数为10％的KOH水溶液后荧光显微镜下的效果图；

图30为阴虱虫卵在滴加一滴荧光染色剂e后荧光显微镜下的效果图，图31为阴虱虫卵在滴加一滴质量分数为10％的KOH水溶液后荧光显微镜下的效果图；

结果表明：在紫外激发光(UV280-400nm滤镜)下，镜下可见寄生虫发蓝色荧光，毛囊虫、螨虫以及阴虱虫卵结构清晰，而KOH湿片法尽管也能看到寄生虫，但对比不明显。

试验十三：阳性标本保藏时间比较：对于以上几组检出阳性标本中以试验十一中的鼻腔粘液为例，在室温放置不同时间，在显微镜镜下观察真菌染色效果，统计结果见表3。

荧光染色剂e、f和g在前24小时染色效果好，真菌清晰可见，之后效果逐渐变差，出现少量结晶现象。荧光染色剂h由于含有高浓度的甘油，保湿效果好，阳性标本保藏时间最长，72小时后观察效果仍然很好，可作为很好的临床或教学示教片。

表3阳性标本保藏时间比较