一种中药荆芥抗肺癌活性成分的质量控制方法与流程

本发明属于中药领域，尤其涉及一种中药荆芥抗肺癌活性成分的质量控制方法。

背景技术：

肺癌是目前发病率和死亡率增长最快、对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。肺癌中80%是非小细胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC），病理上以鳞癌、腺癌和大细胞癌为主。近年来，肺癌的发病率和死亡率正在迅速上升，虽然手术治疗、放射治疗、化学治疗、免疫治疗及综合治疗等都取得了长足发展，但肺癌患者5年的生存率仅为15%，因此寻找有效的抗肺癌药物与方法，彻底攻克肺癌，一直是世界医学界重要的研究课题之一。

在我国，中药拥有几千年研究和应用历史，以其独特的疗效和巨大的开发潜能引起了广泛的关注。荆芥，为常用中药之一。又名“假苏”，土名“姜芥”，《神农本草经》中列为中品，属于唇形科植物植物荆芥的干燥地上部分，具有解表、透疹等药理作用。临床文献调研发现：其主要化学成分大体可以分为黄酮、多糖、挥发油、酚酸等几大类，其中黄酮类化合物具有显著的抗肿瘤活性。

中药作为一个复杂而多元化的体系，对其进行全方位的质量控制一直属于一个技术性难题。而指纹图谱的出现，从整体上对药材质量提供了有效的控制手段。目前，中药指纹图谱已成为国内外广泛接受的全面评价多维组分复杂样品质量模式的一种方法，美国FDA在植物药制品指导原则中允许申报者提供产品的色谱指纹图谱资料，德国药用植物学会、英国草药典、印度草药典以及加拿大药用级芳香植物协会也都把指纹图谱作为质量控制标准的内容之一。指纹图谱反映的是药材提取物的整体特征，所以在保证整体的前提下，针对其色谱峰与药效之间建立联系具有一定的实际意义。

在荆芥研究过程中，发现了一种制备高纯度荆芥总黄酮的方法，并且在抗肿瘤方面药效良好（专利号201410397261.1），具有较好的开发价值。为了更好地控制其在抗肺癌方面的质量，保证临床用药的安全性和有效性，亟需开发一种全面、合理、系统和有效的控制中药荆芥抗肺癌活性成分质量的方法。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供一种中药荆芥抗肺癌活性成分的质量控制方法。该方法可以全面、合理、系统和有效的控制中药荆芥抗肺癌活性成分的质量。

为实现上述目的，本发明提供一种以药效学为导向的中药荆芥抗肺癌活性成分多指标成分的质量控制方法，包括步骤如下。

（1）供试品溶液的制备。

分别称取9批不同产地荆芥药材粉末（过四号筛），置圆底烧瓶中，精密加入75 %乙醇溶液，回流提取，每次1 h，合并3次滤液（绢布过滤），用水稀释成生药所需的药液，过HPD-400型大孔吸附树脂，上样浓度0.8 g/mL（生药和湿树脂比），用2倍柱体积（BV）水洗除杂，用70%乙醇洗脱，重复上柱二次，收集洗脱液，摇匀，经滤膜滤过，即得供试品溶液。

（2）高效液相色谱条件。

Agilent poroshell SB-C₁₈色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），流动相：体积分数为0.02%的甲酸水溶液（A）- 乙腈（B），程序梯度洗脱，流速：1.0 mL·min^-1；柱温：30 ℃；进样量：2 μL；检测器：二极管阵列检测器（DAD）；检测波长：330 nm。

（3）特征色谱峰的提取。

根据对照指纹图谱（R）中峰面积满足定性及定量要求的色谱峰进行提取，保留时间分别为：8.4 min， 9.7 min，12.7 min，13.2 min，17.1 min，20.2 min，25.6 min，26.3 min，29.8 min，31.5 min，33.9 min，38.1 min，42.5 min，46.6 min，47.0 min，51.0 min，53.2 min，62.2 min，68.9 min。

（4）灰色关联分析。

将提取得到的特征色谱峰峰面积作为子序列，肺癌细胞的凋亡坏死率（%）作为母序列进行灰色关联软件分析，得到不同色谱峰抗肺癌作用的关联系数。

（5）对照品溶液的制备。

分别精密称取香叶木素对照品、木犀草苷对照品、槲皮苷对照品、橙皮苷对照品、木犀草素对照品、芹菜素对照品、迷迭香酸甲酯对照品2.47 mg、1.48 mg、11.08 mg、17.84 mg、2.91 mg、2.68 mg、8.73 mg，置于10 mL容量瓶中，加纯甲醇定容至10 mL刻度，摇匀制成储备液，精密吸取储备液1 mL置于10 mL容量瓶中，加纯甲醇定容至10 mL刻度，摇匀，即得香叶木素、木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、迷迭香酸甲酯浓度分别为0.0247 mg·mL^-1、0.0148 mg·mL^-1、0.1108 mg·mL^-1、0.1784 mg·mL^-1、0.0291 mg·mL^-1、0.0268 mg·mL^-1、0.0873 mg·mL^-1的混合对照品溶液。

（6）色谱峰指认。

利用UPLC-Q-TOF/MS技术手段对特征峰进行色谱峰归属，并通过质谱中保留时间、分子离子峰、碎片离子峰的分子量匹配得出以下信息：6号峰为木犀草苷，10号峰为槲皮苷，11号峰为橙皮苷，12号峰为迷迭香酸甲酯，16号峰为木犀草素，18号峰为芹菜素，19号峰为香叶木素。

以上色谱峰构成了荆芥醇提物的指纹图谱特征，可以对荆芥中所含主要黄酮类成分做出色谱鉴定。

（7）中药荆芥醇提物中抗肺癌活性成分的含量测定。

分别称取9种不同来源荆芥药材粉末约2.0 g，精密称定（按药典规定称取重量应准确至所取重量的千分之一），按上述制备供试品溶液及色谱条件测定峰面积，采用外标法计算样品中木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、香叶木素及迷迭香酸甲酯的含量。

本发明具备的有益效果。

本发明是在前期研究的基础上作进一步的研究。首先，以肺癌细胞A549的凋亡坏死率为评价指标，对9批不同来源的荆芥药材醇提物进行体外药效试验研究；其次，采用高效液相色谱仪，梯度洗脱的方式，建立了荆芥醇提物的HPLC指纹图谱，并采用灰色关联分析软件将药效指标与提取的色谱峰峰面积进行相关性分析筛选出关联系数较大的色谱峰；并采用液质联用的技术(UPLC-Q-TOF/MS)对荆芥醇提物HPLC标准指纹图谱中抗肺癌活性关联度较大的7种色谱峰进行成分指认，并采用高效液相色谱法对7种化学成分进行含量检测，为其发挥更好抗肺癌的效果提供实验依据。为抗肺癌药效方向上的质量控制提供了更全面、更系统的信息。

利用高效液相色谱技术，梯度洗脱，得到荆芥醇提物HPLC指纹图谱。一方面，指纹图谱所提供的化学信息丰富，能够表达该产品的特征，具有良好的专属性，以荆芥醇提物中所含成分的指纹图谱作为一个整体看待避免了只测定单一成分而判定荆芥整体质量的片面性；另一方面，采用UPLC-Q-TOF/MS串联技术，对荆芥醇提物HPLC标准指纹图谱中抗肺癌关联度较大的7种成分进行了指认，有利于对中药荆芥质量的全方面监控，并一次性测定所指认的7种成分含量，方法简单、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握。

综上所述，本发明制作该指纹图谱的方法简单、准确可靠、能更全面地反映荆芥醇提物的质量，适用于荆芥醇提物在抗肺癌作用方面的质量控制，其测定方法也具有一定的稳定性以及准确性，适用于进一步的质量研究，具有良好的实用性。

附图说明

图1 9批不同来源荆芥药材醇提物的指纹图谱。

图2 橙皮苷二级质谱图。

图3木犀草素二级质谱图。

图4芹菜素二级质谱图。

图5 木犀草苷二级质谱图。

图6香叶木素二级质谱图。

图7槲皮苷二级质谱图。

图8 迷迭香酸甲酯二级质谱图。

图9混合对照品的液相色谱图（其中：1-木犀草苷；2-槲皮苷；3-橙皮苷；4-迷迭香酸甲酯；5-木犀草素；6-芹菜素；7-香叶木素）。

图10供试品溶液的液相色谱图（其中：1-木犀草苷；2-槲皮苷；3-橙皮苷；4-迷迭香酸甲酯；5-木犀草素；6-芹菜素；7-香叶木素）。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明。

实施例1。

中药荆芥抗肺癌活性成分的质量控制方法，具体为荆芥醇提物HPLC指纹图谱的构建方法。

1.仪器与试药。

1.1 仪器：NUAIRETM US AUTOFLOW型CO₂培养箱（德国NUAIRE公司）；细胞凋亡与坏死检测试剂盒（Hoechst 33342和PI，碧云天生物技术研究所，批号：C1056-3）；Nikon ECLIPSE TI倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；Agilent 1290 型快速高效液相色谱仪（安捷伦公司）；Agilent 6550 iFunnel Q-TOF质谱（安捷伦公司）。

1.2 试药：荆芥药材来源于不同地区的药房，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定本品为才唇形科植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分。实验中液相色谱和质谱所用试剂为色谱纯和质谱纯，其余所用试剂均为分析纯，水为超纯水。

2. 方法与结果。

2.1供试品溶液制备。

称取荆芥药材粉末40.0g（误差范围39.95-40.05 g），精密加入600 mL 75 %乙醇溶液回流提取3次（误差±0.5 mL），合并滤液，稀释成生药浓度为0.1 g·mL^-1的药液，过HPD-400型大孔吸附树脂，上样浓度0.8 g·mL^-1（生药和湿树脂比），用2 倍柱体积（BV）水洗除杂，用9 BV 70%乙醇洗脱，重复上柱二次，收集洗脱液，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.2 体外药效评价试验。

人肺癌细胞 A549，常规培养于含10 %胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃，5 % CO₂培养箱内常规传代培养，取对数生长期的细胞接种于芯片，待细胞贴壁后，根据前期研究的相关数据结果IC₅₀值，用10%胎牛牛血清的DMEM培养液将9种不同来源的荆芥醇提取物分别配制成1.0 mg·mL^-1的浓度，以0.2 µL·min^-1的流速经蠕动泵灌注入芯片作用24 h，检测不同来源药材的药效差异，结果见表1。

表1 为9个不同来源的荆芥醇提取物的药效差异。

注：细胞凋亡坏死率%=（凋亡细胞数+坏死细胞数）/全部细胞数×100%。

2.3 指纹图谱的建立。

高效液相色谱条件：精密吸取供试品溶液2 μL，采用Agilent poroshell SB-C₁₈色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），流速：1.0 mL·min^-1；柱温：30 ℃；检测波长：330 nm；流动相：体积分数为0.02%的甲酸水溶液（A）- 乙腈（B），进行程序梯度洗脱，如下表2。

表2 为程序梯度洗脱对应表。

2.3.1精密度试验。

密吸取同一供试品溶液2 μL，按上述色谱条件连续进样6次，测定峰面积值。结果表明，本方法精密度良好，相对保留时间的RSD在0.18~0.23%之间，相对峰面积的RSD在1.28~2.93%之间，RSD均小于5%，说明仪器性能良好，符合指纹图谱的要求。

2.3.2稳定性试验。

制备供试品溶液一份，于室温放置0，3，6，12，24，48 h，按上述色谱条件，以峰面积为指标进样分析，记录指纹图谱，计算各色谱峰的相对峰面积的RSD。各色谱峰的相对保留时间的RSD在0.13~0.22%之间，相对峰面积的RSD在2.28~3.91 %之间，结果表明，RSD均小于5%，样品制备方法稳定性较好，符合指纹图谱的要求。

2.3.3重复性试验。

取同一批药材粉末6份，精密称定（按药典规定称取重量应准确至所取重量的千分之一），制备供试品溶液，按上述色谱条件进行分析。记录指纹图谱，计算各色谱峰的相对峰面积的RSD。各色谱峰的相对保留时间的RSD在0.58~0.93%之间，相对峰面积的RSD在2.86~3.37%之间结果表明，RSD均小于5%，样品制备方法重复性较好，符合指纹图谱的要求。

取供试品溶液按“2.3”项下色谱条件，进行分析检测，得到 9 个不同来源荆芥药材的指纹图谱，如图1所示。

2.4 特征色谱峰的提取。

根据对照指纹图谱（R）中峰面积满足定性及定量要求的色谱峰进行提取，保留时间分别为：8.4 min， 9.7 min，12.7 min，13.2 min，17.1 min，20.2 min，25.6 min，26.3 min，29.8 min，31.5 min，33.9 min，38.1 min，42.5 min，46.6 min，47.0 min，51.0 min，53.2 min，62.2 min，68.9 min。

2.5 灰色关联分析。

将提取得到的特征色谱峰峰面积作为子序列，肺癌细胞的凋亡坏死率（%）作为母序列进行灰色关联软件分析。具体的将药效指标与 19 个色谱峰的峰面积进行灰色关联分析，得到其对应的关联系数，如表3所示。

表3为19 个色谱峰面积的灰色关联系数。

在此基础上，对关联系数较大的色谱峰进行成分指认及含量测定。

2.6 对照品溶液制备。

分别精密称取香叶木素对照品、木犀草苷对照品、槲皮苷对照品、橙皮苷对照品、木犀草素对照品、芹菜素对照品、迷迭香酸甲酯对照品2.47 mg、1.48 mg、11.08 mg、17.84 mg、2.91 mg、2.68 mg、8.73 mg，置于10 mL容量瓶中，加纯甲醇定容至10 mL刻度，摇匀制成储备液，精密吸取储备液1 mL置于10 mL容量瓶中，加纯甲醇定容至10 mL刻度，摇匀，即得香叶木素、木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、迷迭香酸甲酯浓度分别为0.0247 mg·mL^-1、0.0148 mg·mL^-1、0.1108 mg·mL^-1、0.1784 mg·mL^-1、0.0291 mg·mL^-1、0.0268 mg·mL^-1、0.0873 mg·mL^-1的混合对照品溶液。

2.7色谱峰的指认。

通过UPLC-Q-TOF-MS质谱获得的二级数据与对照品相比对进行化学成分的快速鉴定，最终确定了荆芥醇提取物中对抗肺癌药效贡献较大（关联系数不小于于0.6623）的7种化学成分其中6、10、11、12、16、18、19号色谱峰的碎片离子与对照品碎裂方式一致，如图2至图8所示。其鉴定结果如表4所示。

表4 为色谱峰指认结果。

2.8 色谱峰的含量测定。

分别取9种不同来源荆芥药材粉末约2.0 g，精密称定（按药典规定称取重量应准确至所取重量的千分之一），按供试品溶液的制备方法及色谱条件测定峰面积，供试品溶液及混合对照品溶液的液相色谱图分别如图9和图10所示。并用外标法计算样品中木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、迷迭香酸甲酯、木犀草素、芹菜素、香叶木素的含量，结果见表5。

表5 为不同产地荆芥药材含量测定结果（mg/g）。

综上所述，分别称取9种不同来源荆芥药材粉末，按上述制备供试品溶液及色谱条件测定峰面积，并用外标法计算样品中木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、迷迭香酸甲酯、木犀草素、芹菜素、香叶木素的含量，9批来自不同来源的荆芥药材的醇提物中7种成分含量差异较大，并且药效差异显著。在此基础上，本发明创建了一套完整的荆芥醇提物在发挥抗肺癌活性的应用研究领域的质量控制方法，对于荆芥药材抗肺癌作用作用上的质量控制尤为重要，具有潜在的应用价值。