本发明涉及一种生物检验方法，尤其涉及一种椎间盘髓核组织样本中蛋白质或氨基酸的检测分析方法。
背景技术：
髓核是椎间盘的重要部分，对于对椎间盘突出病人，往往采取髓核切除的方法进行治疗，而对手术获得的髓核组织标本进行物质分析成为我们探索椎间盘退变疾病发病机制的关键手段。但是，由于髓核是一种少细胞组织，其中充满大量基质蛋白，如胶原蛋白和蛋白聚糖，在利用组织进行分析时，这些基质成分加上其他杂质往往会影响我们对目标蛋白/氨基酸的检测和分析。目前，在该研究领域，还没有一种标准高效高精度的方法来对髓核组织的蛋白质/氨基酸成分进行分析。
技术实现要素：
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种椎间盘髓核组织样本中蛋白质或氨基酸的检测分析方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明包括以下步骤：
步骤(1)样本制备：
(1.1)将手术中切除的人髓核组织放入培养皿中，用PBS洗净血液,然后利用手术显微镜去除周围多余组织,分离获得髓核组织；
(1.2)将髓核组织剪碎，然后将剪碎的组织放入研钵里,倒入液氮仔细研磨，直到固体组织变为冻干粉,注意研磨一定要均匀；
(1.3)用高精度天平称量500mg冻干粉,然后将冻干粉转移进入玻璃匀浆器中，加入超纯水(1ml/100mg组织)进行匀速匀浆,匀浆的过程中注意防止匀浆液漏出；
(1.4)持续匀浆直至待匀浆器中没有肉眼可见的髓核组织冻干粉后，将得到的匀浆液用1ml移液器全部吸出，转移到离心管中，在4摄氏度条件下11000转高速离心20分钟,取上清；
(1.5)将上清加入事先用甲醇活化和水平衡的固相萃取小柱中(HLB,Waters,USA)，将上清过柱,可用1ml注射器放在小柱口进行加压，加快液体过柱速度，液体过柱后，丢弃；注：固相萃取小柱可根据待分析物质的物理性质不同而选择不同厂家的不同型号，一切根据用途来决定。在我们本次研究中，我们选取的是美国Waters公司的小柱；
(1.6)用100ul的10％甲醇洗脱液对固相萃取小柱进行洗脱,将洗脱液收集起来。注：洗脱液的体积，以及有机溶剂的种类，浓度都可根据不同的分析目的和萃取柱的类型进行调整，需要预实验摸索条件；
(1.7)所得洗脱液即为利用髓核组织获取的液态分析样本，-80摄氏度保存待测；
步骤(2)：样本检测：
(2.1)将靶蛋白质/氨基酸的标准品，利用液相色谱质谱联用仪测定该物质的质荷比和离子谱峰的强度并绘制质谱图，然后利用已知浓度的标准品绘制质谱图，从而得到标准曲线；注：本次分析的目标物质为三肽:N端乙酰化-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸；
(2.2)将制备好的髓核组织液体样本在液相色谱质谱联用仪上进行分析，得到相应样本的质谱图，通过已知的标准曲线计算获得样本中靶物质的浓度；
步骤(3)：结果分析：
结合不同样本来源病人的临床相关资料和测量获得的靶物质浓度，跟分析得出靶物质与病人年龄，椎间盘退变，生活习惯等的相关性，从而探索不同蛋白质/氨基酸在椎间盘退变进程中的病理生理作用。
本发明的有益效果在于：
本发明是一种椎间盘髓核组织样本中蛋白质或氨基酸的检测分析方法，与现有技术相比，本发明样本制备程序简单、提取成本低，固相萃取小柱成本低廉，对靶蛋白质/氨基酸的检测特异性强，定量进度高，具有推广应用的价值。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明：
本发明包括以下步骤：
步骤(1)样本制备：
(1.1)将手术中切除的人髓核组织放入培养皿中，用PBS洗净血液,然后利用手术显微镜去除周围多余组织,分离获得髓核组织；
(1.2)将髓核组织剪碎，然后将剪碎的组织放入研钵里,倒入液氮仔细研磨，直到固体组织变为冻干粉,注意研磨一定要均匀；
(1.3)用高精度天平称量500mg冻干粉,然后将冻干粉转移进入玻璃匀浆器中，加入超纯水(1ml/100mg组织)进行匀速匀浆,匀浆的过程中注意防止匀浆液漏出；
(1.4)持续匀浆直至待匀浆器中没有肉眼可见的髓核组织冻干粉后，将得到的匀浆液用1ml移液器全部吸出，转移到离心管中，在4摄氏度条件下11000转高速离心20分钟,取上清；
(1.5)将上清加入事先用甲醇活化和水平衡的固相萃取小柱中(HLB,Waters,USA)，将上清过柱,可用1ml注射器放在小柱口进行加压，加快液体过柱速度，液体过柱后，丢弃；注：固相萃取小柱可根据待分析物质的物理性质不同而选择不同厂家的不同型号，一切根据用途来决定。在我们本次研究中，我们选取的是美国Waters公司的小柱；
(1.6)用100ul的10％甲醇洗脱液对固相萃取小柱进行洗脱,将洗脱液收集起来。注：洗脱液的体积，以及有机溶剂的种类，浓度都可根据不同的分析目的和萃取柱的类型进行调整，需要预实验摸索条件；
(1.7)所得洗脱液即为利用髓核组织获取的液态分析样本，-80摄氏度保存待测；
步骤(2)：样本检测：
(2.1)将靶蛋白质/氨基酸的标准品，利用液相色谱质谱联用仪测定该物质的质荷比和离子谱峰的强度并绘制质谱图，然后利用已知浓度的标准品绘制质谱图，从而得到标准曲线；注：本次分析的目标物质为三肽:N端乙酰化-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸；
(2.2)将制备好的髓核组织液体样本在液相色谱质谱联用仪上进行分析，得到相应样本的质谱图，通过已知的标准曲线计算获得样本中靶物质的浓度；
步骤(3)：结果分析：
结合不同样本来源病人的临床相关资料和测量获得的靶物质浓度，跟分析得出靶物质与病人年龄，椎间盘退变，生活习惯等的相关性，从而探索不同蛋白质/氨基酸在椎间盘退变进程中的病理生理作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。