一种在小鼠前扣带回皮层诱发DSE现象的方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种在小鼠前扣带回皮层诱发DSE现象的方法，具体地说，涉及一种在小鼠前扣带回皮层诱发大麻素受体(CB1R)依赖DSE现象的方法。

背景技术：

麻素受体(cannabinoid receptor)泛分布于中枢神经系统中，主要分为大麻素受体1(CB1R)，大麻素受体2(CB2R)两种类型。越来越多的研究证明，大麻素受体功能与药物成瘾、认知和记忆紊乱、多种精神疾病以及慢性疼痛有关。目前，利用膜片钳技术在脑片上记录去极化诱导兴奋性传递抑制的现象，即DSE现象是用于评价CB受体功能的一项重要指标。因此找到稳定的、诱导成功率高的方法对于评价CB受体功能至关重要。

前扣带回皮层(ACC，anterior cingulated cortex)位于大脑额叶的内表面，近年来越来越多的研究证明其与慢性痛的产生与维持密切相关，同时其与记忆、社交、恐惧以及焦虑等负面情绪的发生有关。而在ACC层面阐明CB受体参与介导神经系统功能紊乱的机制，找到CB受体相关的治疗靶点，在ACC区获得稳定的DSE现象是技术关键。

DSE的首次发现是在2001年Kreitzer和Regehr在大鼠小脑浦肯野细胞上发现去极化兴奋性信息传入被短暂抑制的现象，至此十几年来，陆陆续续在小脑、杏仁核等几个脑区发现DSE现象。然而如此重要的现象在前扣带回皮层一直没有好的方法被成功诱导出现，由此，在前扣带回进行大麻素受体相关研究一直滞后。目前尚未有在ACC进行DSE诱导的相关报道。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提出了一种在小鼠前扣带回皮层诱发DSE现象的方法，该方法可以在前扣带回水平诱发CB1R介导的DSE现象，具有快速简便、成功率高、操作易行的优点，适于推广应用。

其技术方案如下：

一种在小鼠前扣带回皮层诱发DSE现象的方法，包括以下步骤：

步骤1.制备脑薄片

将动物麻醉后，取脑；利用振动切片的方法进行冠状切片；切片厚度为300um，选取bregma 0.50-1.10之间的脑片，孵育2小时；

步骤2.电生理记录

灌流液中加入GABA受体拮抗剂荷包牡丹碱，终浓度；

记录L2/3层神经元：记录电极置于L2/3，刺激电极置于L5/6；

记录L5/6层神经元：记录电极置于L5/6，刺激电极置于L2/3；

记录方法：电压钳记录，钳制电压为-70mV，记录5-10分钟基线，给予0.2Hz刺激，控制诱发的EPSC在200pA；

而后将钳制电压调至0，给予去极化2s；去极化结束后立即给予0.2Hz刺激，同基线；

记录结束后，记录细胞被动膜特性；

步骤3.结果判断

在上述的记录过程中，基线上下浮动不超过10％视为稳定记录，进一步进行分析；

去极化诱导后，细胞漏流的大小小于100pA，纳入分析；

若去极化后20s内出现了EPSC减小，减小幅度约为20％；20s后EPSC恢复正常基线水平，即视为成功诱导DSE现象。

进一步，步骤1所述动物为成年C57BL/6小鼠，年龄大于8周。

进一步，步骤2中所使用的记录液体配方为：氯化钠126mM，氯化钾2.5mM，氯化钙2.4mM，氯化镁1.2mM，磷酸二氢钠1.2mM，碳酸氢钠19mM，葡萄糖11mM，并以95％O₂和5％CO₂孵育，pH为7.35-7.45。

进一步，，步骤2中的所述记录电极的内液配方为：葡萄糖酸钾125mM，氯化钠10mM，氯化镁2.0mM，氯化钙1.0mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸10mM，羟乙基哌嗪乙硫磺酸10mM，三磷酸腺苷2.0mM，三磷酸鸟苷0.3，pH为7.3，渗透压为285-295m0sm/kg。

进一步，步骤2中记录时的记录温度为30-34℃。

本发明的有益效果为：

本发明的诱导方法具有快速简便、成功率高、操作易行的优点。不需要利用其他受体的激动剂或拮抗剂，孵育及记录液体接近生理状态，更加利于模拟在体情况。成功率高，利用本法在细胞状态好、刺激电极诱导效率高且刺激位置准确的情况下，成功率高达95％以上，因此更加利于比较各种病理模型条件下DSE现象的增强、减弱或消失。本法对于在前扣带回皮层水平诱导DSE具有较高的研究意义，适于推广应用。

附图说明

图1是电生理记录操作示意图；

图2是电生理记录的记录方法示意图；

图3是DSE诱导成功示意图；其中图3a为DSE诱导前后典型电流示意图；图3b为时间-电流变化率示意图；图3c为诱导前后电流变化率比较柱状图；图3d为不同去极化时间条件下，DSE诱导电流变化率随时间变化曲线图；

图4是mGluR5拮抗剂阻断DSE示意图；其中图4a为时间-电流变化率曲线图；图4b为诱导前后电流变化率比较柱状图；

图5是钙螯合剂阻断DSE示意图；图5a为时间-电流变化率曲线图；图5b为诱导前后电流变化率比较柱状图；

图6是CB1受体拮抗剂阻断DSE示意图。图6a为时间-电流变化率曲线图；图6b为诱导前后电流变化率比较柱状图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1.制备脑薄片：将动物麻醉后，取脑。利用振动切片的方法进行冠状切片。切片厚度为300um，选取bregma 0.50-1.10之间的脑片，孵育2小时。

2.电生理记录：灌流液中加入GABA受体拮抗剂荷包牡丹碱，终浓度。

记录L2/3层神经元：记录电极置于L2/3，刺激电极置于L5/6。

记录L5/6层神经元：记录电极置于L5/6，刺激电极置于L2/3。

记录方法：电压钳记录，钳制电压为-70mV，记录5-10分钟基线，给予0.2Hz刺激，控制诱发的EPSC在200pA左右。

而后将钳制电压调至0，给予去极化2s。去极化结束后立即给予0.2Hz刺激，同基线。

记录结束后记录细胞被动膜特性。

3.结果判断：

在上述的记录过程中，基线上下浮动不超过10％视为稳定记录，可进一步进行分析。

去极化诱导后，细胞漏流大小小于100pA，可以纳入分析。

若去极化后20s内出现了EPSC减小，减小幅度约为20％；20s后EPSC恢复正常基线水平，即可视为成功诱导DSE现象。

4.利用本法诱导DSE机制探究及验证

利用药理学方法证明：本法在ACC所诱导的DSE现象为突触后mGluR5、CB1R、Ca²⁺共同介导所发生的现象：

DSE为代谢型谷氨酸受体5(mGluR5)依赖机制：在灌流记录液体中加入mGluR5拮抗剂MPEP(10uM)，利用利用同样方法记录DSE，发现DSE现象消失，说明本法所诱导的DSE现象为mGluR5依赖。

DSE为钙依赖机制：将电极內液中加入钙螯合剂BAPTA(10mM)，阻断突触后的钙内流，利用同样方法记录DSE，发现DSE现象消失，说明本法所诱导DSE现象为钙内流依赖。

DSE为突触前CB1R依赖机制：在灌流记录液体中加入CB1特异性拮抗剂AM251(6uM)，利用同样方法记录DSE，发现DSE现象消失，说明本法所诱导的DSE现象为CB1受体依赖。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。