一种合成抗原的分子量检测方法及应用与流程

本发明涉及一种合成抗原的分子量检测方法及确定小分子化合物。

背景技术：

抗原(antigen)是一类能刺激机体的免疫系统，使之发生免疫应答，产生抗体与致敏淋巴细胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结合反应的物质。抗原在体内可以刺激机体产生免疫反应生成特异性抗体，由于抗体与抗原是特异性结合，利用该原理开展的ELISA法或胶体金免疫层析法等检测是目前临床上常用的方法之一。

对于分子量小于1万小分子化合物，往往不具有免疫原性，在体内难以引起免疫反应。为了获得这类小分子化合物的抗体，因此要将小分子化合物合成具有免疫原性的大分子物质。

抗原分子量测定是鉴定抗原(偶联抗原)、抗体的一个主要监控指标。现有的方法主要紫外分光光度法、SDS聚丙烯凝胶电泳、高效液相排阻色谱法(HPSEC)和液质联用法等。紫外分光光度法通过紫外吸收的大小进行简单的加和估算偶联的比例，其专属性不强；SDS聚丙烯凝胶电泳通过mark的标记可以粗略估算抗原合成的纯度和分子量，但其准确性较差；液质联用法能够准确的测定分子量及进行纯度确证，但其检测成本高且需要对所测的谱图进行专业分析才能得到准确的结果，该方法对仪器设备和技术人员的要求均较高，往往一般不易普及。目前可用于分子量的质谱检测方法有Q-TOF和MALDI-TOF，发明人曾采用Q-TOF对抗原分子量进行检测，数据分析表明：该方法对待测物质的纯度要求较高，如对BSA对照物质能进行准确的测定，但对于本项目组制备的抗原样品无法进行解析。原因是本方法制备的抗原组分为非纯化物质，同时含有一系列类似的组分，无法得到Q-TOF图谱典型的“五指峰”，因此该方法无法在本项目中应用。

综上所述，在合成抗原的研究和应用中，缺少一种简便、准确的合成抗原分子量检测方法，本发明方法将弥足现有技术的缺憾，为抗原的研究和应用提供技术参考。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种简便的合成抗原的分子量检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种抗原分子量的检测方法，包括如下步骤：

1)配置对照品溶液和待检样品溶液；

2)使用凝胶色谱法在相同的色谱条件下对对照品和待检样品进行分析；

3)根据对照品的色谱结果绘制标准曲线；

4)根据标准曲线计算出待检样品的分子量。

作为上述检测方法的进一步改进，对照品为IgG、BSA和马心肌球蛋白。

作为上述检测方法的进一步改进，对照品溶液为其水溶液。

作为上述检测方法的进一步改进，对照品溶液的浓度为1mg/ml。

作为上述检测方法的进一步改进，凝胶色谱法使用的色谱柱为Protein BEH SEC7.8mm×150mm。

作为上述检测方法的进一步改进，凝胶色谱法中的流动相为100mM磷酸盐缓冲液，pH6.8。

作为上述检测方法的进一步改进，凝胶色谱法中，色谱柱温度为25℃。

作为上述检测方法的进一步改进，凝胶色谱法中，检测波长280nm。

作为上述检测方法的进一步改进，凝胶色谱法中，进样量为5μL。

作为上述检测方法的进一步改进，待检品溶液的制备方法为：取待测样品溶解于水中，浓度为1mg/ml，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

本发明的有益效果是：

本发明提供的合成抗原分子量测定方法能够应用于合成抗原(抗原)、抗体及蛋白类大分子物质的检测，检测的分子量范围在16-150kDa之间。通过测定合成抗原分子量大小，再结合偶联蛋白质与小分子的分子量大小，就可以推算合成过程中，小分子与蛋白质的偶联比例。

与现有的检测方法相比，本发明方法操作简单，数据处理难度极小，检测结果可靠。

本发明方法可以对分子量大小不同的物质成分进行分离并可计算分子量大小，特别适合混合大分子物质的测定。

附图说明

图1是流速为1.0ml/min下的lgM-出峰时间校正曲线图；

图2是流速为0.8ml/min下的lgM-出峰时间校正曲线图；

图3是免疫球蛋白对照品的色谱图；

图4是BSA对照品的色谱图；

图5是肌球蛋白对照品的色谱图；

图6是酚酞抗原样品的色谱图；

图7是他达拉非抗原样品的色谱图

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

测定酚酞抗原的分子量方法

一、仪器与材料

1.1仪器设备：Agilent 1100系列液相色谱仪；Mollipore纯水系统；

色谱柱：Protein BEH SEC(7.8mm×150mm)。

1.2对照物质：人血清IgG(≥95％，SDS-PAGE，SLBK8678V，SIGMA-ALDRICH)；马心肌球蛋白(≥90％，SDS-PAGE，SLBK8678V，SIGMA-ALDRICH)；血清白蛋白(牛)(BSA，批号：140619-201421，中国食品药品检定研究院)。

1.3试药：磷酸氢二钠、磷酸均为分析纯。

二、检测方法

色谱条件与系统适用性：色谱柱为Protein BEH SEC(7.8mm×150mm)；流动相为100mM的磷酸盐缓冲液(用磷酸调pH6.8)；流速为0.8mL/min；柱温25℃；检测波长280nm。

对照品溶液的制备：分别精密量取免疫球蛋白(IgG，分子量约150KDa)、小牛血清蛋白(BSA，分子量约66.7KDa)和肌球蛋白(马心肌球蛋白，分子量约16.7KDa)适量，加水制成每1ml分别含1mg的标准混合溶液，即得。

供试品溶液的制备取待测样品适量，取约1mg，精密称定，精密加水1ml，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

测定法：精密量取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL，进样，记录保留时间；根据对照品色谱图中色谱峰的保留时间与对照品的分子量对数进行线性回归，得到标准曲线(相关系数r在0.99以上)。将供试品色谱图中的色谱峰保留时间利用校正曲线进行计算，测定供试品的分子量。

三、方法学验证

3.1校正曲线

按照拟定的方法进样测定，记录各对照物质的出峰时间(详见表1)，以各对照物质的对数与出峰时间进行线性回归，得到校正曲线(见图1)。曲线方程为T＝-1.4929lgM+11.9768，r＝0.999。

表1各对照品分子量及出峰时间(1.0ml/min)

将流速由1.0ml/min调整到0.8ml/min，结果见表2、图2。曲线方程为T＝-1.8690lgM+15.0281，r＝0.999。

表2各对照品分子量及出峰时间(0.8ml/min)

以上在两个不同的流速下，对照物质的出峰时间有所改变，但所得到的校正曲线的相关系数r均大于0.999，说明该方法对所测蛋白类成分的分子量与保留时间有较好的相关性。

3.2精密度试验

取对照物质的混合溶液，连续进样6次，比较出峰时间的相对标准偏差，考察仪器的重复性，详见表3。由表3可知：三种对照物质的出峰时间RSD(％)均小于0.06，说明保留时间的重复性较强。

表3精密度试验结果

四、样品测定

将制备得到的酚酞抗原和他达拉非抗原分别取1mg，加水1ml，溶解后进样测定，色谱图见图3～7，其中，图3是免疫球蛋白对照品的色谱图；图4是BSA对照品的色谱图；图5是肌球蛋白对照品的色谱图；图6是酚酞抗原样品的色谱图；图7是他达拉非抗原样品的色谱图。

五、分子量计算

由图6图可知，酚酞抗原的保留时间分别为6.011min，将以上保留时间分别代入公式计算，酚酞抗原的分子量约分别为66766。在结合酚酞分子量(318)，可以估算与BSA的结合比例。经估算酚酞：BSA的比值为1:1。

由图7可知，他达拉非抗原的保留时间分别为5.995min，将以上保留时间分别代入公式计算，他达拉非的抗原的分子量约分别为68095。在结合他达拉非的分子量(389)，可以估算与BSA的结合比例。经估算他达拉非：BSA的比值为4:1。