一种检测珠芽蓼中黄酮类成分的薄层色谱分析方法与流程

本发明涉及中药材质量检测领域，具体涉及一种检测珠芽蓼中黄酮类成分的薄层色谱分析方法。

技术背景

本品为蓼科植物珠芽蓼Polygonum viviparum L.的根茎，收载于《卫生部颁藏药标准第一册》，具有止泻、健胃的功效。珠芽蓼主要生长在海拔在1500-5000m的山坡草地、山谷溪旁等地，广泛分布于西藏、青海、甘肃等地，具有“高原拳参”之称，珠芽蓼中含有丰富鞣质、黄酮、蛋白质、多糖等成分。其中黄酮类化合物是珠芽蓼的主要次生代谢产物，具有较强的抗自由基作用和抗氧化能力，有报道在珠芽蓼中发现了槲皮素、异鼠李素、山奈酚等黄酮苷元及相应的黄酮苷类成分，槲皮素、异鼠李素、山奈酚等具有降血压，降血脂，降低血液粘稠度，增强血管弹性，抗动脉粥样硬化等功能，是心脑血管疾病的“克星”。

珠芽蓼记载于《中华人民共和国卫生部药品标准藏药(第一册)》，其中仅有对药材进行显微鉴别没有对活性成分进行鉴别，不利于有效控制珠芽蓼的质量。目前文献对珠芽蓼的活性成分质量检测大都以1-2个有机酸或黄酮为指标成分，大都使用HPLC进行分析。如已公布文献《RP-HPLC法同时测定藏药珠芽蓼中牡荆素、槲皮苷和槲皮素的含量》(天然产物研究与开发，2011年)，《高效液相色谱法测定蝎子七中没食子酸的含量》(中国药房，2005年)。以上HPLC分析方法仪器成本高，操作复杂，对实验人员技能要求也高，且毒性试剂用量多，同时每次只能进行单个样品的测试。

寻找一种简单易行，成本低的方法对珠芽蓼中活性成分——黄酮类成分进行检测成为需求，特别是对槲皮素、异鼠李素、山奈酚的同时检测。

技术实现要素：

针对现有问题，本发明对珠芽蓼中黄酮类成分性质进行了分析研究，提供了一种检测珠芽蓼中黄酮类成分的薄层色谱分析方法，该方法具有操作简便、迅速、专属性强、成本低廉、试剂毒性小的特点，同时通过3种黄酮类成分对珠芽蓼进行了质量评价。

为了实现上述目的，本发明提供一种检测珠芽蓼中黄酮类成分的薄层色谱分析方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

a.供试品溶液制备：取珠芽蓼药材粉末，用盐酸甲醇水解提取，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解，离心取上清液，蒸干溶剂，用甲醇使复溶，即得珠芽蓼供试品溶液；

b.对照品溶液制备：取槲皮素对照品、异鼠李素对照品及山奈酚对照品，分别用甲醇溶解制成上述对照品溶液；

c.薄层色谱鉴别：对上述步骤a所述供试品溶液和步骤b所述对照品溶液进行薄层色谱分析，分析条件：GF₂₅₄薄层板，温度22-25℃，湿度60％-80％，展开剂：二氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸＝20-30:0.2-1.0:0.5:2，上行展开，展开后，喷以3％-7％的AlCl₃溶液，置紫外灯下对比检测。

在一些实施例中，所述步骤a供试品溶液制备中的盐酸甲醇水解提取方法为：取过3号筛的珠芽蓼药材粉末10g，置于500mL圆底烧瓶中，加入无水甲醇250mL，加入质量分数为25％-30％的稀盐酸60mL，于80℃水浴回流2h，取出后立即于冰浴中冷却。

在一些实施例中，所述步骤a进一步包括将离心所得上清液的蒸干残留物进行柱层析分离，分别收集多个极性段成分，分别蒸干，分别用甲醇使复溶，即得珠芽蓼供试品溶液。本发明所述的极性段是指，用柱层析分离物质时，物质中的各成分会由于各自极性的大小不同，按照一定的规律顺序的被洗脱下来，根据时间的先后或极性的大小，按顺序将洗脱下来的洗脱液分成多个部分，每个部分为一个极性段。

在一些实施例中，所述的柱层析为200-300目的硅胶柱层析，洗脱液为二氯甲烷：甲醇＝100:5；所述多个极性段为3、4或5个。

在一些实施例中，所述步骤b中对照品溶液的制备方法为：分别精密称取干燥至恒重的槲皮素、异鼠李素、山奈酚对照品适量，加甲醇制成浓度分别为0.4mg·mL^-1、0.3mg·mL^-1、0.4mg·mL^-1的对照品溶液。

在一些实施例中，其特征在于，步骤c中薄层色谱分析为二次展开薄层色谱法。

在一些实施例中，所述第二次展开的条件同第一次展开。

在一些实施例中，步骤c中所述二氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸展开系统配比组成为25:0.6:0.5:2。

本发明的积极效果包括：

(1)本发明首次提供了一种珠芽蓼中槲皮素、异鼠李素、山奈酚这3种黄酮类成分同时分析的薄层色谱方法，能够一次分析多个样品，弥补了珠芽蓼药材中多种黄酮类成分进行薄层色谱分析的空白，为其真伪鉴别和质量控制提供了简便、快捷、高效的方法。

(2)本发明用盐酸甲醇水解提取黄酮之后进行了柱层析分离，通过将洗脱成分分成不同极性段，分别进行检测，使得薄层色谱分析过程中干扰减少，鉴别更准确、专一性更强。

(3)本发明进一步使用二氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸展开系统，对样品采用了二次展开薄层色谱法，大大的提高了检测方法的分离度。

附图说明

图1珠芽蓼药材黄酮类成分薄层色谱图，图谱中1、2、3、4分别为供试品极性A段物质、异鼠李素对照品、槲皮素对照品、山奈酚对照品。薄层色谱条件为温度为20℃，湿度为60％，展开剂为二氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸＝20:0.2:0.5:2。

图2珠芽蓼药材黄酮类成分薄层色谱图，图谱中1、2、3、4分别为供试品极性A段物质、异鼠李素对照品、槲皮素对照品、山奈酚对照品。条件为温度为22℃，湿度为70％，展开剂为二氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸＝25:0.6:0.5:2。

图3珠芽蓼药材黄酮类成分薄层色谱图，图谱中1、2、3、4分别为供试品极性A段物质、异鼠李素对照品、槲皮素对照品、山奈酚对照品。条件为温度为25℃，湿度为80％，展开剂为二氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸＝30:1.0:0.5:2。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1：

供试品溶液制备：取样品10g置于500mL圆底烧瓶中，加入无水甲醇250mL，再加入质量分数为25％-30％的稀盐酸60mL，于80℃水浴回流2h，取出后立即于冰浴中冷却，过滤，取滤液于旋转蒸发仪减压蒸干以除去溶剂，残渣加1mL甲醇使溶解，离心取上清液，用2g200-300目的硅胶拌样，备用。

称取200-300目的硅胶25g，用二氯甲烷搅拌至无气泡，装柱，柱体积为70mL，使用二氯甲烷：甲醇＝100:5洗脱，分别收集硅胶柱分离的极性A段、极性B段和极性C段洗脱液，蒸干溶剂，分别加2mL甲醇复溶，得到3份供试品溶液。

对照品溶液的制备：分别精密称取干燥至恒重的槲皮素、异鼠李素、山奈酚对照品适量，加甲醇制成浓度分别为0.4mg·mL^-1、0.3mg·mL^-1、0.4mg·mL^-1的对照品溶液。

薄层层析：采用硅胶薄层层析板，取上述供试品溶液和对照品溶液各10μL，点于距硅胶G薄层板底边10mm处，以体积比为20:0.2:0.5:2的二氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸系统作为展开剂，在温度为20℃，湿度为60％的条件下于双槽展开缸的一侧加入上述展开系统预平衡10min，上行展开，展距为10cm，进行二次展开。

显色：向挥干的薄层板上喷以3％的AlCl₃试液，晾干，置紫外灯下检视荧光薄层色谱，得到珠芽蓼药材黄酮类成分图谱，见图1。图谱中1、2、3、4分别为供试品极性A段物质、异鼠李素对照品、槲皮素对照品、山奈酚对照品，供试品极性B段和极性C段洗脱液在紫外灯下无斑点。图谱中异鼠李素的R_f值为0.8，槲皮素的R_f值为0.35，山奈酚的R_f为0.70。

实施例2：

与实施例1不同的是，薄层分析的条件如下，取供试品溶液和对照品溶液各10μL，点于距硅胶G薄层板底边10mm处，用体积比为25:0.6:0.5:2的二氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸系统作为展开剂，在温度为22℃，湿度为70％的条件下于双槽展开缸的一侧加入上述展开系统预平衡10min，上行展开，展距为10cm，进行二次展开。显色的条件为向挥干的薄层板上喷以5％的AlCl₃，，晾干，置紫外灯下检视荧光薄层色谱斑点，得到珠芽蓼药材黄酮类成分图谱，见图2。图谱中1、2、3、4分别为供试品极性A段物质、异鼠李素对照品、槲皮素对照品、山奈酚对照品，供试品极性B段和极性C段洗脱液在紫外灯下无斑点。图谱中异鼠李素的R_f值为0.6，槲皮素的R_f值为0.25，山奈酚的R_f为0.5。

实施例3：

与实施例1不同的是，薄层分析的条件如下，取供试品溶液和对照品溶液各10μL，点于距硅胶G薄层板10mm处，用体积比为30:1.0:0.5:2的二氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸系统作为展开剂，在温度为25℃，湿度为80％的条件下于双槽展开缸的一侧加入上述展开系统预平衡10min，上行展开，展距为10cm，进行二次展开。显色的条件为向挥干的薄层板上喷以7％的AlCl₃溶液，，晾干，置紫外灯下检视荧光薄层色谱，得到珠芽蓼药材黄酮类成分图谱，见图3。图谱中1、2、3、4分别为供试品极性A段物质、异鼠李素对照品、槲皮素对照品、山奈酚对照品，供试品极性B段和极性C段洗脱液在紫外灯下无斑点。图谱中异鼠李素的R_f值为0.78，槲皮素的R_f值为0.4，山奈酚的R_f为0.7。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。