一种快速分析尿中邻苯二甲酸酯代谢产物、双酚A和雌激素的方法与流程

本发明属于分析化学领域。涉及同时分析尿中塑料添加剂，单体和雌激素代谢物的方法，具体涉及一种快速分析尿中邻苯二甲酸酯代谢产物、双酚A和雌激素的方法。
背景技术：
：现有技术公开了邻苯二甲酸酯类化合物（PAEs）和酚类化合物分别是重要的塑料添加剂和单体，应用广泛。近年来，越来越多的研究发现PAEs和酚类化合物具有内分泌干扰效应，已成为本领域当前非持久性环境内分泌干扰物的研究重点。有研究显示PAEs和酚类化合物可以通过多种途径干扰机体的内分泌系统，引起与内分泌有关的代谢性疾病。流行病学研究发现人群广泛暴露于PAEs和酚类化合物，同时也观察到PAEs和酚类化合物暴露与人体雌激素改变有关，而且与肥胖和糖尿病发生正相关。鉴于流行病学研究涉及的研究对象通常为数百，甚至上千人的大样本，导致研究期限较长，为提高PAEs和酚类化合物人群暴露以及与人群健康关系的研究效率，建立一种样本用量少，而且快速灵敏的评价PAEs和酚类化合物暴露和机体雌激素水平的方法将是有关流行病学研究的关键步骤。动物和人体药物代谢动力学研究均发现PAEs和酚类化合物进入机体后，被肝脏微粒体酶系统快速代谢，前者主要被代谢单酯化合物，可以被进一步氧化，之后葡萄糖醛酸结合，而后者直接与葡萄糖醛酸结合，最后两者主要经尿液排除体外；雌激素在机体中代谢过程与酚类化合物类似。有关流行病学研究中，通常尿样采集易于被研究对象接受，而且PAEs和酚类化合物代谢产物能够避免环境中广泛存在的PAEs和酚类化合物在样本收集、保存和分析过程中对尿样的污染，有利于提高评价PAEs和酚类化合物的准确性，尿液中PAEs、酚类化合物和雌激素代谢产物已被业内选择作为PAEs和酚类化合物暴露和人体雌激素改变的生物标志物。目前，采用配备电喷雾离子源的反相液相色谱串联质谱法是分析尿中PAEs、酚类化合物和雌激素代谢产物的国际上公认方法。由于PAEs代谢产物含有羧基，而酚类化合物和雌激素含有酚羟基，两者均适合在阴离子模式下离子化，PAEs代谢产物含有羧基，极性大，为保证其能在反相色谱柱上保留，通常需要在流动相中加入甲酸或乙酸，改善峰形，优化色谱分离效果；与PAEs代谢产物不同，酚类化合物和雌激素代谢产物极性小于PAEs代谢产物，不需要在流动相中加入甲酸或乙酸，如果在流动相中加入甲酸或乙酸将抑制阴离子模式下酚类化合物和雌激素的离子化效率，降低灵敏度，因此，在实际分析中，尽管已经实现尿中三类化合物的同时净化，但是尿中PAEs代谢产物的色谱质谱分析与酚类化合物和雌激素的色谱质谱分析分开进行，需要进行两次色谱质谱分析，即PAEs代谢产物在酸性流动相中分离，而酚类化合物和雌激素在中性流动相中分析，这势必会增加分析时间、样本用量、溶剂消耗和其它分析成本，降低分析效能。基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种同时分析尿中塑料添加剂，单体和雌激素代谢物的方法，具体涉及一种快速分析尿中邻苯二甲酸酯代谢产物、双酚A和雌激素的方法。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种同时分析尿中塑料添加剂，单体和雌激素代谢物的方法，具体涉及一种快速分析尿中邻苯二甲酸酯代谢产物、双酚A和雌激素的方法。该方法基于色谱柱后pH值调整同时分析尿中邻苯二甲酸酯类化合物、酚类化合物和雌激素代谢产物。具体的，本发明的一种快速分析尿中邻苯二甲酸酯代谢产物、双酚A和雌激素的方法，其包括，在酸性条件下实现尿中PAEs、酚类化合物和雌激素代谢产物的色谱分离后，通过向从色谱柱流出的流动相中注入高pH值溶液，在进入质谱分析之前将流动相调整为碱性，保证PAEs代谢产物色谱分离效果，提高待测物在质谱离子源中的离子化效率，实现所述三类化合物在一次进样中的同时分析，提高分析效能。本发明中，所述高pH值溶液是不同浓度的氨水、氢氧化钠或氢氧化钾溶液。本发明中，所使用的流动相为乙腈和水的混合物或者为甲醇和水的混合物。本发明中，所使用的流动相中添加的乙酸或甲酸的体积比含量在0.00002%到0.5%之间。本发明中，流动相pH值调整发生在PAEs、酚类化合物和雌激素代谢产物在酸性条件下实现色谱分离后与进入质谱分析之前。本发明中，所述PAEs代谢产物包括邻苯二甲酸单乙基己基酯（MEHP）、邻苯二甲酸单(2-乙基-5-羟基己基)酯（MEHHP）、邻苯二甲酸单(2-乙基-5-氧己基)酯（MEOHP）、邻苯二甲酸单(2-乙基-5-羧基戊基)酯（MECPP）、邻苯二甲酸单(2-羧基乙基-己基)酯（MCMHP）、邻苯二甲酸单甲基酯（MMP）、邻苯二甲酸单环己基酯（MCHP）、邻苯二甲酸单异丁基酯（MiBP）、邻苯二甲酸单丁基酯（MBP）、邻苯二甲酸单羟基丁基酯（MHBP）、邻苯二甲酸单乙基酯（MEP）、邻苯二甲酸单苄基酯（MBzP）、邻苯二甲酸单辛基酯（MOP）和邻苯二甲酸单异壬基酯（MiNP）。本发明中，所述酚类化合物素包括双酚A（BPA）和双酚A类似物，后者主要包括双酚F（BPF）、双酚S（BPS）、双酚AF（BPAF）、双酚B(BPB)、双酚C（BPC）和双酚E（BPE）。本发明中，所述雌激素主要包括雌酮（E1）、雌三醇（E3）、β-雌二醇（β-E2）、4-羟基-雌酮（4-0HE1）、2-羟基-雌酮（2-0HE1）、16α-羟基-雌酮（16α-0HE1）、2-甲氧基-雌酮（2-Me0E1）、3-甲氧基-雌酮(3-MeOE1）、16-酮基-雌二醇(16-ketoE2）、4-甲氧基-雌二醇（4-MeOE2）、2-甲氧基-雌二醇（2-MeOE2）和2-羟基-雌二醇（2-OHE2）。本发明的实施例中，按如图1所示过程实现，高压色谱泵泵出酸性流动相将进样器内的含有PAEs、酚类化合物和雌激素代谢产物的尿样处理液带入反相色谱柱进行色谱分离；在实现它们与尿液中杂质和它们之间的分离后，依次从色谱柱流出；从色谱柱流出的酸性流动相与注射泵泵出的高pH值溶液在混合器混合，使流出混合器的流动相pH值由酸性转变为碱性；流动相通过毛细管柱，进入电喷雾离子源在阴离子模式下待测化合物离子化，变为阴离子后，通过离子提取锥进入质谱仪分析。本发明方法通过在酸性流动相分离PAEs、酚类化合物和雌激素代谢产物之后改变色谱流出物pH值，实现PAEs、酚类化合物和雌激素代谢产物的一次进样色谱质谱分析，既能保证PAEs代谢产物色谱分离效果，同时改善酚类化合物和雌激素代谢产物的离子化效率，能达到提高分析速度和灵敏度的目的。附图说明图1为本发明的实现过程示意图。图2为7种目标化合物在乙腈和水流动相中的提取离子流色谱图。图3为7种目标化合物在添加乙酸的乙腈和水流动相中的提取离子流色谱图。图4为7种目标化合物在添加乙酸的乙腈和水流动相中同时进行柱后pH调整的提取离子流色谱图。具体实施方式实施例1如图1所示，高压色谱泵泵出酸性流动相将进样器内的含有PAEs、酚类化合物和雌激素代谢产物的尿样处理液带入反相色谱柱进行色谱分离；在实现它们与尿液中杂质和它们之间的分离后，依次从色谱柱流出；从色谱柱流出的酸性流动相与注射泵泵出的高pH值溶液在混合器混合，使流出混合器的流动相pH值由酸性转变为碱性；流动相通过毛细管柱，进入电喷雾离子源在阴离子模式下待测化合物离子化，变为阴离子后，通过离子提取锥进入质谱仪分析。1）材料与方法仪器与试剂ACQUITY超高效液相色谱仪串联SYNAPTG2高分辨率四极杆/飞行时间质谱仪和60mg/3ml规格的HLB固相萃取小柱（美国Waters公司）；12位固相萃取装置（美国Supelco公司）；OA-SYS-5085型氮吹仪（美国OrganomationAssociates公司）。邻苯二甲酸单乙基酯（MEP）、邻苯二甲酸单丁基酯（MBP）、邻苯二甲酸单乙基己基酯（MEHP）、邻苯二甲酸单辛基酯（MOP）和三种同位素内标（MEP-13C4、MBP-13C4和MEHP-13C4）（美国CambridgeIsotopeLaboratories公司）。BPA、β-雌二醇（β-E2）、雌酮（E1）、2种同位素内标（BPA-d16和β-E2-d3）、LC-MS级乙酸、LC-MS级氨水和罗曼蜗牛β-葡萄糖醛酸酶水溶液（TypeHP-2S）（美国Sigma公司）；LC-MS级甲醇、乙腈和纯水（美国Fisher公司）。方法;色谱条件:色谱柱为ACQUITYUPLCBEHT3（1.7μm×3.0mm×100mm）；流动相为含添加或不添加乙酸的水和乙腈；流速为0.3mL/min；采用梯度洗脱：起始流动相为0%乙腈，0min~2.0min内线性升至30%乙腈，2.0min~6.0min内线性升至95%乙腈，6.0min-8.0min保持95%乙腈，8.0min~8.5min内线性降至0%乙腈，并保持1min；柱温为50℃；进样量为30μl;柱后pH调整:如图1所示，使用氨水作为柱后pH调整液，保证酸性流动相流出混合器的pH值均调整为大于8；也可不注入氨水，保持原有流动相的pH值:质谱条件；采用阴离子模式下的电喷雾离子源；毛细管电压为2.8kV，锥孔电压为35V，提取锥电压为4V，离子源温度为110℃，锥孔气流量为40L/h，脱溶剂气温度为400℃，脱溶剂气流量为800L/h，质量扫描范围为50～1000Da，扫描时间为0.2s；各待测物定量离子如表1所示；表1各化合物在不同流动相组成和柱后pH调整下色谱峰高的变化a,色谱峰峰高样品分析：取1.0ml尿样，加入20μl的2μg/ml含有5种同位素内标的甲醇溶液、20μl的β-葡萄糖醛酸酶水溶液和50μl乙酸氨缓冲溶液（pH=4.5）后，混匀，置于37℃水浴酶解7h以上。预先用2mL甲醇和2mL纯水活化平衡HLB固相萃取小柱后，将上述经过酶解的尿液全部上柱，依次用2mL纯水和2mL30%甲醇水溶液淋洗杂质，用3mL甲醇洗脱待测物。在45℃水浴下，用弱氮气流分别将含洗脱液吹至近干，用0.5mL的30%乙腈水溶液复溶后，取10μl进样分析；标准曲线的绘制;使用混合标准溶液，在30%乙腈溶液中配制成浓度分别为0.20ng/ml、0.50ng/ml、1.00ng/ml、5.00ng/ml、10.0ng/ml、50.0ng/ml的混合标准溶液系列，同添加与样品相同量的同位素内标，取10μl进样分析。采用20mDa质量窗口提取待测物定量离子色谱质谱图，以其色谱峰峰面积与对应的同位素定量离子色谱峰峰面积之比为纵坐标，以待测物浓度为横坐标，绘制内标标准曲线；结果显示;色谱分离和质谱响应;:如图2和图3所示，与乙腈和水流动相相比，当乙腈和水流动相中加入乙酸后，MEHP、MOP和MBP的峰形变得更加尖锐，但是BPA、E1和β-E2的峰高降低4-22倍（如表1和图3所示）；当使用氨水调整pH后，在保持MEHP、MOP和MBP峰形的同时，BPA、E1和β-E2的峰高提高4-20倍（如表1和图4所示）；线性和灵敏度：如表2所示，各化合物具有良好的线性，相关系数均大于0.986；以3倍基线对的各化合物检出限（LOD）在0.5-2.3ng/ml之间，以10倍基线对应的各化合物定量限（LOQ）在1.7-7.6ng/ml之间；表2方法线性和灵敏度化合物线性灵敏度线性范围（ng/ml）相关系数LOD（ng/ml）LOQ（ng/ml）MBP5-2000.9920.62.1MEHP5-2000.9970.51.7MOP5-2000.9951.34.3MEP10-2000.9862.37.6BPA5-2000.99930.51.8E15-2000.9910.62.1β-E25-2000.9970.93.0LOD：检出限；LOQ：定量限精密度和回收率：如表3所示，在尿中添加浓度分别为10和50ng/ml，而且每个浓度重复5次时，各化合物回收率在71-113%之间，精密度在4.3-12.4%之间；表3方法回收率和精密度（n=5）化合物加标浓度（ng/ml）回收率（%）相对标准偏差（%）MBP1082-958.15089-1025.2MEHP1076-9310.15081-1128.6MOP1073-9712.45079-1138.7MEP1086-1077.45085-1036.1BPA1089-1096.75093-1085.1E11071-10511.65078-1077.8β-E21086-1086.95088-1054.3本发明以常见4种PAEs、BPA和2种雌激素代谢产物作为目标化合物，展示它们在中性流动相（乙腈和水）和酸性流动相（添加乙酸）中采用柱后pH调整后灵敏度的变化以及方法精密度和准确性，结果表明，采用柱后pH调整技术能实现尿中PAEs、酚类化合物和雌激素代谢产物的同时快速分析，适用于大规模流行病学中该三类化合物的分析。当前第1页1 2 3