本发明属于细胞病理学领域，具体涉及一种脱落细胞一步染色法、所用染料组合及试剂盒。
背景技术：
脱落细胞学检查是指采集人体管腔器官表面脱落的上皮细胞，经染色后用显微镜观察其形态并做出诊断。它被广泛用于癌前病变筛查。脱落细胞的主要来源有：子宫颈脱落细胞、浆膜腔积液脱落细胞及泌尿系统脱落细胞。
常规脫落细胞染色法是利用细胞中各种结构的生化组成不同，与嗜酸性或嗜硷性染料反应而显示不同的颜色，使细胞的形态和结构易于辨认。常用的有巴氏和瑞-姬氏染色。
巴氏染色法：此染色法是脱落细胞染色中最常用的方法。它的特点是细胞核结构清晰，细胞浆分色明显，透明度好，胞浆颜色鲜艳。而且标本不易脱色，便于长期保存。巴氏染色对早期肿瘤细胞核内dna含量变化不显著。所以，目前用显微镜确认的肿瘤病人多为晚期。其主要原因是巴氏染色对早期肿瘤细胞内微量dna增高不敏感。巴氏染色过程复杂。同时，医生的经验和视觉疲劳也影响阅片的质量和判断。
瑞-姬氏染色法：此染色法利用姬氏法对细胞核着色较好，但细胞浆着色较差。瑞氏法胞浆着色清晰。两者复合之后可以弥补相互的不足。瑞姬氏染色的缺点是显示细胞色差弱，极易染成模糊色团，使细胞微结构不易辨认。染色过程需要30分钟。
细胞中染色体数量和dna含量反映细胞生长及分化状态,，测定dna含量的变化对判断细胞的分化，肿瘤的性质及预后具有重要意义。在进行脱落细胞dna含量(倍体)检测时，细胞核dna染色质量的好坏直接影响诊断的准确性。
feulgen染色法：此染色法是目前应用较多的一种对细胞核dna染色的方法。该方法具有对dna较好选择性的特点成为脱落细胞dna倍体染色的主要方法(cn02181534a)。但feulgen染色存在几项缺点：
(1)染色操作过程复杂，配液及反应条件要求严格，耗时长(数小时)。
(2)染色的特异性不强，复染he或ea36背景易共染，直接影响判读的准确性。
(3)feulgen试剂只对细胞核反应,不显示细胞浆的形态,因此,需要做第二次染色(he,ea36)。
(4)染色后细胞切片容易褪色无法长期保存。
(5)染色的效果与巴氏有很大不同。医生无法延用累积的(巴氏染色)经验阅片。由于以上的缺点，feulgen染色一直没有在临床上得到广泛的使用。
技术实现要素：
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种脱落细胞一步染色法、所用染料组合及试剂盒。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一种脱落细胞一步染色法，所述一步染色指对脱落细胞的细胞核及细胞浆进行同步染色，包括采用荧光染料组合对脱落细胞进行一步染色，所述荧光染料组合含有细胞核荧光染料和细胞浆荧光染料。
所述细胞核荧光染料是指对脱落细胞的细胞核进行染色的荧光染料。所述细胞浆荧光染料是指对脱落细胞的细胞浆进行染色的荧光染料。
所述细胞核荧光染料对细胞核染色后发出的荧光波长与细胞浆荧光染料对细胞浆染色后发出的荧光波长不同，能够区分。
本发明的第二方面，提供了一种脱落细胞一步染色法用荧光染料组合，所述荧光染料组合含有细胞核荧光染料和细胞浆荧光染料。
所述细胞核荧光染料是指对脱落细胞的细胞核进行染色的荧光染料。所述细胞浆荧光染料是指对脱落细胞的细胞浆进行染色的荧光染料。
所述细胞核荧光染料对细胞核染色后发出的荧光波长与细胞浆荧光染料对细胞浆染色后发出的荧光波长不同，能够区分。
本发明的第三方面，提供了一种脱落细胞一步染色法用染液，包括前述脱落细胞一步染色法用荧光染料组合和荧光保存液。
本发明的第四方面，提供了前述脱落细胞一步染色法用荧光染料组合或前述脱落细胞一步染色法用染液的用途，所述用途选自以下任一项或多项：
(1)用于脱落细胞的一步染色；
(2)用于制备脱落细胞检测试剂。
本发明的第五方面，提供了一种脱落细胞检测法，包括：
(1)采用脱落细胞一步染色法对脱落细胞的细胞核及细胞浆进行同步染色，包括采用荧光染料组合对脱落细胞进行一步染色，所述荧光染料组合含有细胞核荧光染料和细胞浆荧光染料；
(2)在暗场环境中，采用荧光显微镜对步骤(1)中染色后的脱落细胞进行观察。
本发明的第六方面，提供一种脱落细胞检测试剂盒，包括：前述脱落细胞一步染色法用荧光染料组合和/或前述脱落细胞一步染色法用染液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所采用荧光染料组合对脱落细胞的细胞核及细胞浆进行同步染色，且无需清洗背景荧光，从而能够实现快速染色和检测。本发明采用单一紫外光源激发并取得良好的效果，能够简化光源和避免两次照射形成图像的复杂性。
附图说明
图1：采用实施例1配置好的荧光染料工作液对来源于子宫颈的脱落细胞进行荧光染色结果图。
图2：将图1中的荧光染色细胞形态转化为灰度图像，被框出的部分是完整的鳞状上皮细胞。
图3：将图1中的荧光染色细胞形态转化为灰度图像，被框出的部分是细胞的细胞核，核的大小及纹理清晰可见。
图4：实施例1配置好的荧光染料保存液荧光染色的稳定性。
图5：实施例1配置好的荧光染料保存液荧光染色的时间。
图6：采用实施例2配置好的荧光染料工作液对来源于子宫颈的脱落细胞进行荧光染色结果图。
图7：将图6中的荧光染色细胞形态转化为灰度图像，被框出的部分是完整的鳞状上皮细胞。
图8：将图6中的荧光染色细胞形态转化为灰度图像，被框出的部分是细胞的细胞核，核的大小及纹理清晰可见。
图9：实施例2配置好的荧光染料保存液荧光染色的稳定性。
图10：实施例2配置好的荧光染料保存液荧光染色的时间。
图11：采用实施例3配置好的荧光染料工作液对来源于子宫颈的脱落细胞进行荧光染色结果图。
图12：将图11中的荧光染色细胞形态转化为灰度图像，被框出的部分是完整的鳞状上皮细胞。
图13：将图11中的荧光染色细胞形态转化为灰度图像，被框出的部分是细胞的细胞核，核的大小及纹理清晰可见。
图14：实施例3配置好的荧光染料工作液荧光染色的稳定性。
图15：实施例3配置好的荧光染料工作液荧光染色的时间。
具体实施方式
一、脱落细胞一步染色法
本发明的脱落细胞一步染色法，是指对脱落细胞的细胞核及细胞浆进行同步染色，包括采用荧光染料组合对脱落细胞进行一步染色，所述荧光染料组合含有细胞核荧光染料和细胞浆荧光染料。
所述细胞核荧光染料是指对脱落细胞的细胞核进行染色的荧光染料。所述细胞浆荧光染料是指对脱落细胞的细胞浆进行染色的荧光染料。
进一步地，细胞核荧光染料对细胞核染色后发出的荧光波长与细胞浆荧光染料对细胞浆染色后发出的荧光波长不同，能够区分。例如，能够被人眼或光学图像传感器(ccd,cmos等)区分。
进一步地，所述细胞核荧光染料选自：dapi、sytodna、hoechst33342、pi(碘化丙啶)、eb(溴化乙锭)；所述细胞浆荧光染料选自：ao、fitc(异硫氰酸荧光素)、cpo、鬼笔环肽。
在优选例中，所述荧光染料组合由dapi及ao组成。
dapi是指4,6联脒-2-苯基吲哚。dapi与细胞核内的dna结合的亲和力极高。因此，dapi发射的荧光主要反映了细胞核内的dna分布状态。
ao是指荧光染料吖啶橙。ao主要与细胞浆内的rna结合。因此，ao发射的荧光反映了细胞浆的形态和rna代谢信息。
本发明经过广泛而深入的实验发现，由ao和dapi组成的荧光染料组合，二者之间无无不良相互影响。不会产生相互淬灭，且a0与细胞核内dna结合后发射的微弱橙色荧光并不干扰dapi与细胞核内dna结合后所发射的强烈蓝色荧光。在dapi和ao两种荧光染料的共同作用下，细胞核与细胞浆的荧光颜色区分明显，在摄像传感器的不同颜色通道中分别获取细胞核的信息(蓝色)和细胞浆的信息(绿色)。这种取图方式有助于人工智能系统的识别，分类和判断，大大提高脱落细胞的检出率。
由ao和dapi组成的荧光染料组合，另一特征是当它们单独存在于溶液中，仅发出极微弱的荧光。一旦荧光染料与核酸分子结合后，在激发光(320nm--400nm)照射下,荧光产生效率大大提高。这一特征使核酸存在区域有强烈的荧光而无核酸区域背景荧光极弱。此特征避免了荧光染色后,为取得干净的背景而反复冲洗的步骤。这使整个染色反应非常简单而有效。从而大大降低了人力及自动化过程的复杂性。
进一步地，采用由dapi及ao组成的荧光染料组合对脱落细胞进行一步染色时，dapi与细胞混合时的工作浓度范围是：0.025～0.50ug/ml。ao与细胞混合时的工作浓度范围是1.0～10ug/ml。
进一步地，dapi与细胞混合时的工作浓度范围是：0.025～0.05ug/ml。
进一步地，dapi与细胞混合时的工作浓度范围是：0.05～0.50ug/ml
在优选例中，dapi与细胞混合时的工作浓度是0.025ug/ml、0.05ug/ml或0.5ug/ml均可。
进一步地，ao与细胞混合时的工作浓度范围是1.0～5.0ug/ml。
进一步地，ao与细胞混合时的工作浓度范围是5.0～10.0ug/ml。
在优选例中，1.0ug/ml、5.0ug/ml或10.0ug/ml均可。
进一步地，采用由dapi及ao组成的荧光染料组合对脱落细胞进行一步染色时，dapi和ao溶解于荧光保存液中。
进一步地，所述荧光保存液的ph值范围是2～6。更优选地为3.5。
进一步地，所述荧光保存液选自：磷酸缓冲液、hepes缓冲液、醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液。
优选例中，所述荧光保存液选用柠檬酸-磷酸盐缓冲液。
进一步地，采用荧光染料组合对脱落细胞进行一步染色后，无需冲洗，去除背景荧光。
进一步地，所述一步染色法仅需5min即可完成染色。
进一步地，所述脱落细胞来源于胸水、腹水、尿液、痰液或宫颈。
进一步地，所述脱落细胞的捕获方法选自：液基细胞法，沉降法，离心法或微流控法。
进一步地，所述脱落细胞制备成脱落细胞涂片后进行染色。
所述脱落细胞涂片是将脱落细胞转移至透明的载体上制备而成。所述透明的载体选自载玻片或芯片。
二、脱落细胞一步染色法用荧光染料组合
本发明的脱落细胞一步染色法用荧光染料组合，含有细胞核荧光染料和细胞浆荧光染料。
进一步地，细胞核荧光染料对细胞核染色后发出的荧光与细胞浆荧光染料对细胞浆染色后发出的荧光不同，能够区分。
进一步地，所述细胞核荧光染料选自：dapi、sytodna、hoechst33342、pi(碘化丙啶)、eb(溴化乙锭)；所述细胞浆荧光染料选自：ao、fitc(异硫氰酸荧光素)、cpo、鬼笔环肽。
进一步地，所述荧光染料组合由dapi及ao组成。
进一步地，dapi与ao的质量比例范围为(1～100)：(5～5000)。
三、脱落细胞一步染色法用染液
本发明的脱落细胞一步染色法用染液，包括前述脱落细胞一步染色法用荧光染料组合和荧光保存液。
优选地，所述荧光保存液的ph值范围是2～6。更优选为3.5。
进一步地，所述荧光保存液选自：磷酸缓冲液、hepes缓冲液、醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液。
优选例中，所述缓冲液选用柠檬酸-磷酸盐缓冲液。
本发明还提供前述脱落细胞一步染色法用荧光染料组合或前述脱落细胞一步染色法用染液的用途，所述用途选自以下任一项或多项：
(1)用于脱落细胞的一步染色；(2)用于制备脱落细胞检测试剂。
四、脱落细胞检测法
本发明的脱落细胞检测法，包括：
(1)采用前述脱落细胞一步染色法对脱落细胞的细胞核及细胞浆进行同步染色，包括采用荧光染料组合对脱落细胞进行一步染色，所述荧光染料组合含有细胞核荧光染料和细胞浆荧光染料；
(2)在暗场环境中，采用荧光显微镜对步骤(1)中染色后的脱落细胞进行观察。
进一步地，步骤(1)中，所述脱落细胞来源于胸水、腹水、尿液、痰液或宫颈。
进一步地，步骤(1)中，所述脱落细胞的捕获方法选自：液基细胞法，沉降法，离心法或微流控法。
进一步地，步骤(1)中，所述脱落细胞制备成脱落细胞涂片后进行染色。
所述脱落细胞涂片是将脱落细胞转移至透明的载体上制备而成。所述透明的载体选自载玻片或芯片。
进一步地，细胞核荧光染料对细胞核染色后发出的荧光与细胞浆荧光染料对细胞浆染色后发出的荧光不同，能够区分。
进一步地，所述细胞核荧光染料选自：dapi、sytodna、hoechst33342、pi(碘化丙啶)、eb(溴化乙锭)；所述细胞浆荧光染料选自：ao、fitc(异硫氰酸荧光素)、cpo、鬼笔环肽。
在优选例中，所述荧光染料组合由dapi及ao组成。
dapi是指4,6联脒-2-苯基吲哚。dapi与细胞核内的dna结合的亲和力极高。因此，dapi发射的荧光主要反映了细胞核内的dna分布状态。
ao是指荧光染料吖啶橙。ao主要与细胞浆内的rna结合。因此，ao发射的荧光反映了细胞浆的形态和rna代谢信息。
本发明经过广泛而深入的实验发现，由ao和dapi组成的荧光染料组合，二者之间无无不良相互影响。不会产生相互淬灭，且a0与细胞核内dna结合后发射的微弱橙色荧光并不干扰dapi与细胞核内dna结合后所发射的强烈蓝色荧光。在dapi和ao两种荧光染料的共同作用下，细胞核与细胞浆的荧光颜色区分明显，在摄像传感器的不同颜色通道中分别获取细胞核的信息(蓝色)和细胞浆的信息(绿色)。这种取图方式有助于人工智能系统的识别，分类和判断，大大提高脱落细胞的检出率。
传统方法中，是将dapi和ao分别进行保存。dapi通常采用纯化水新鲜配制并加入抗淬灭剂，需要-20℃保存，室温中一般只能24小时有效。这种使用方式很难在临床上推广。ao采用磷酸缓冲液配制，配备后室温中有效期为24小时，长期保存也需要-20℃条件下保存。当它们单独存在于溶液中，仅发出极微弱的荧光。而本发明中，将dapi和ao放在一起保存于荧光保存液中，一旦荧光染料与核酸分子结合后，在激发光(320nm--400nm)照射下,荧光产生效率大大提高。这一特征使核酸存在区域有强烈的荧光而无核酸区域背景荧光极弱。此特征避免了荧光染色后,为取得干净的背景而反复冲洗的步骤。这使整个染色反应非常简单而有效。从而大大降低了人力及自动化过程的复杂性。
进一步地，采用由dapi及ao组成的荧光染料组合对脱落细胞进行一步染色时，dapi与细胞混合时的工作浓度范围是：0.025～0.50ug/ml。ao与细胞混合时的工作浓度范围是1.0～10ug/ml。
进一步地，dapi与细胞混合时的工作浓度范围是：0.025～0.05ug/ml。
进一步地，dapi与细胞混合时的工作浓度范围是：0.05～0.50ug/ml
在优选例中，dapi与细胞混合时的工作浓度是0.025ug/ml、0.05ug/ml或0.5ug/ml均可。
进一步地，ao与细胞混合时的工作浓度范围是1.0～5.0ug/ml。
进一步地，ao与细胞混合时的工作浓度范围是5.0～10.0ug/ml。
在优选例中，1.0ug/ml、5.0ug/ml或10.0ug/ml均可。
进一步地，采用由dapi及ao组成的荧光染料组合对脱落细胞进行一步染色时，dapi和ao溶解于荧光保存液中。
进一步地，所述荧光保存液的ph值范围是2～6。更优选为3.5。
进一步地，所述荧光保存液选自：磷酸缓冲液、hepes缓冲液、醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液。
优选例中，所述荧光保存液选用柠檬酸-磷酸盐缓冲液。
进一步地，采用荧光染料组合对脱落细胞进行一步染色后，无需冲洗，去除背景荧光。
进一步地，所述一步染色法仅需5分钟即可完成染色。
对两种不同的荧光染料，传统的激发方法是采用两种不同波长的光源。例如：针对dapi经常采用350nm的紫外光，而ao的激发光是在460nm(检测rna)。在仪器制造中，由于两种光源的使用增高复杂性和成本。同时，两个光源照射需要两次成像，在后期通过图像处理将两次图像进行复合。这样的过程会延长图像处理时间,延迟报告诊断的时间。
而本发明中，优选地，步骤(2)中，观察时采用单一紫外光进行激光，所述紫外光的波长范围是：320～400nm。采用单一紫外光源，能够简化光源和避免两次照射形成图像的复杂性，取得了良好的效果。
所述检测方法为体外检测方法。
通过荧光复染色,提升早期肿瘤(脱落细胞中)的检出率。为病理医生提供一种快速,自动,准确的筛选异倍体细胞的方法。
五、脱落细胞检测试剂盒
本发明的脱落细胞检测试剂盒，包括：前述脱落细胞一步染色法用荧光染料组合和/或前述脱落细胞一步染色法用染液。
本发明所采用荧光染料组合对脱落细胞的细胞核及细胞浆进行同步染色，且无需清洗背景荧光，从而能够实现快速染色和检测。本发明采用单一紫外光源激发并取得良好的效果，能够简化光源和避免两次照射形成图像的复杂性。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。
实施例1
一、荧光染料缓冲液配置
1、0.1m柠檬酸母液：称取2.1g一水合柠檬酸，溶解于100mldh2o中；
2、0.2m磷酸氢二钠：称取7.16克十二水合磷酸氢二钠，溶解于100mldh2o中；
3、10mm柠檬酸-磷酸盐缓冲液，0.1mnacl：取9.92ml0.1m柠檬酸，5.46ml0.2m磷酸氢二钠，1.7gnacl，加水至200ml并搅拌溶解，调剂ph至3.5。
以上10mm柠檬酸-磷酸盐缓冲液，ph3.5，0.1mnacl即荧光染料保存液。
二、荧光染料工作液配置
1、精确称量吖啶橙(ao)5mg，溶解于10ml10mm柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，作为吖啶橙(ao)母液(0.5mg/ml)，2-8℃保存；
2、精确称量dapi0.25mg，溶解于10mldh2o中，作为dapi母液(0.025mg/ml)，-20℃保存；
3、取500ul吖啶橙(ao)母液和100uldapi母液，加10mm柠檬酸-磷酸盐缓冲液至50ml即配成荧光染料工作液(5ug/mlao,0.05ug/mldapi)。
三、采用配置好的荧光染料工作液对脱落细胞进行荧光染色
1、采用配置好的荧光染料工作液对来源于子宫颈的脱落细胞进行荧光染色：
具体地，包括步骤：(1)获取来源于子宫颈的脱落细胞：可采用多种捕获方法获取脱落细胞，例如：液基细胞法，沉降法，离心法和微流控法获取的脱落细胞层或集落。
(2)获取脱落细胞涂片：将步骤(1)获取的脱落细胞转移至透明的载体(载玻片或芯片)上，获得脱落细胞涂片；
(3)荧光染色：将步骤(2)获得的脱落细胞涂片，采用本实施例已经配置好的荧光染料工作液进行染色数分钟；无需冲洗；
(4)扫描观察：在暗场环境中，采用荧光显微镜对步骤(3)中荧光染色后的脱落细胞进行扫描和图像分析；采用一种紫外光激发(波长320～400nm)，由彩色摄像机取图并通过计算机图像分析系统对细胞进行分类,对细胞dna含量进行配准和检测出异常dna倍体细胞。
结果，如图1所示，用彩色摄像头在20倍荧光显微镜下拍摄的图像，脱落细胞来源于子宫颈；可见鳞状上皮细胞和淋巴细胞；可明显区分细胞核与细胞浆；细胞类型也清晰可辨认。
将图1中的荧光染色细胞形态转化为灰度图像，如图2所示，被框出的部分是完整的鳞状上皮细胞。如图3所示，被框出的部分是细胞的细胞核，核的大小及纹理清晰可见。
四、配置好的荧光染料工作液稳定性长7天
实验设计是将一瓶配置好的荧光染料工作液连续使用七天。每天上午染色一次。细胞来源于同一个细胞池，该池是将五位正常人子宫颈细胞样本混合并在细胞保存液(bd产品)中悬浮和冷藏。在整个实验过程中细胞池在4℃中冷藏约七天。下图4所示第一、三、七天的扫描图。比较第一天和第七天的核荧光强度及胞浆荧光强度发现它们没有出现衰退。经计算机图像分析荧光强度基本保持在同一水平上。
五、配置好的荧光染料工作液进行荧光染色在5分钟内趋于稳定，即可完成染色
将步骤(2)获得的脱落细胞涂片，采用本实施例已经配置好的荧光染料工作液分别进行染色2分钟、5分钟、染色10分钟；无需冲洗。
结果如图5所示，从左自右，第一张图染色2分钟显示荧光染色较弱，胞浆显色不明显；第二张图染色5分钟显示核与胞浆染色明显而且稳定；第三张图染色10分钟图8显示细胞荧光染色强度与5分钟差异小，胞浆略有偏红。由此可见，采用本实施例已经配置好的荧光染料工作液进行荧光染色5分钟趋于稳定，即可完成染色。
实施例2
一、荧光染料缓冲液配置
1、0.1m柠檬酸母液：称取2.1g一水合柠檬酸，溶解于100mldh2o中；
2、0.2m磷酸氢二钠：称取7.16克十二水合磷酸氢二钠，溶解于100mldh2o中；
3、10mm柠檬酸-磷酸盐缓冲液，0.1mnacl：取9.92ml0.1m柠檬酸，5.46ml0.2m磷酸氢二钠，1.7gnacl，加水至200ml并搅拌溶解，调节ph至2。
以上10mm柠檬酸-磷酸盐缓冲液，ph2，0.1mnacl即荧光染料保存液。
二、荧光染料工作液配置
1、精确称量吖啶橙(ao)100mg，溶解于10ml10mm柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，作为吖啶橙(ao)母液(10mg/ml)，2-8℃保存；
2、精确称量dapi0.25mg，溶解于10mldh2o中，作为dapi母液(0.025mg/ml)，-20℃保存；
3、取5ul吖啶橙(ao)母液和1000uldapi母液，加10mm柠檬酸-磷酸盐缓冲液至50ml即配成荧光染料工作液(1.0ug/mlao,0.50ug/mldapi)。
三、采用配置好的荧光染料工作液对脱落细胞进行荧光染色
1、采用配置好的荧光染料工作液对来源于子宫颈的脱落细胞进行荧光染色：
具体地，包括步骤：(1)获取来源于子宫颈的脱落细胞：可采用多种捕获方法获取脱落细胞，例如：液基细胞法，沉降法，离心法和微流控法获取的脱落细胞层或集落。
(2)获取脱落细胞涂片：将步骤(1)获取的脱落细胞转移至透明的载体(载玻片或芯片)上，获得脱落细胞涂片；
(3)荧光染色：将步骤(2)获得的脱落细胞涂片，采用本实施例已经配置好的荧光染料工作液进行染色数分钟；无需冲洗；
(4)扫描观察：在暗场环境中，采用荧光显微镜对步骤(3)中荧光染色后的脱落细胞进行扫描和图像分析；采用一种紫外光激发(波长320～400nm)，由彩色摄像机取图并通过计算机图像分析系统对细胞进行分类,对细胞dna含量进行配准和检测出异常dna倍体细胞。
结果，如图6所示，用彩色摄像头在20倍荧光显微镜下拍摄的图像，脱落细胞来源于子宫颈；可见鳞状上皮细胞和淋巴细胞；可明显区分细胞核与细胞浆；细胞类型也清晰可辨认。
将图6中的荧光染色细胞形态转化为灰度图像，如图7所示，被框出的部分是完整的鳞状上皮细胞。如图8所示，被框出的部分是细胞的细胞核，核的大小及纹理清晰可见。
四、配置好的荧光染料工作液稳定性长7天
实验设计是将一瓶配置好的荧光染料工作液连续使用七天。每天上午染色一次。细胞来源于同一个细胞池，该池是将五位正常人子宫颈细胞样本混合并在细胞保存液(bd产品)中悬浮和冷藏。在整个实验过程中细胞池在4℃中冷藏约七天。下图9所示第一、三、七天的扫描图。比较第一天和第七天的核荧光强度及胞浆荧光强度发现它们没有出现衰退。经计算机图像分析荧光强度基本保持在同一水平上。
五、配置好的荧光染料工作液进行荧光染色在5分钟内趋于稳定，即可完成染色
将步骤(2)获得的脱落细胞涂片，采用本实施例已经配置好的荧光染料工作液分别进行染色2分钟、5分钟、染色10分钟；无需冲洗。
结果如图10所示，从左自右，第一张图染色2分钟显示荧光染色较弱，胞浆显色不明显；第二张图染色5分钟显示核与胞浆染色明显而且稳定；第三张图染色10分钟图8显示细胞荧光染色强度与5分钟差异小，胞浆略有偏红。由此可见，采用本实施例已经配置好的荧光染料工作液进行荧光染色5分钟趋于稳定，即可完成染色。
实施例3
一、荧光染料缓冲液配置
1、0.1m柠檬酸母液：称取2.1g一水合柠檬酸，溶解于100mldh2o中；
2、0.2m磷酸氢二钠：称取7.16克十二水合磷酸氢二钠，溶解于100mldh2o中；
3、10mm柠檬酸-磷酸盐缓冲液，0.1mnacl：取9.92ml0.1m柠檬酸，5.46ml0.2m磷酸氢二钠，1.7gnacl，加水至200ml并搅拌溶解，调节ph至6。
以上10mm柠檬酸-磷酸盐缓冲液，ph6，0.1mnacl即荧光染料保存液。
二、荧光染料工作液配置
1、精确称量吖啶橙(ao)1mg，溶解于10ml10mm柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，作为吖啶橙(ao)母液(0.1mg/ml)，2-8℃保存；
2、精确称量dapi1.25mg，溶解于10mldh2o中，作为dapi母液(0.125mg/ml)，-20℃保存；3、取5000ul吖啶橙(ao)母液和10uldapi母液，加10mm柠檬酸-磷酸盐缓冲液至50ml即配成荧光染料工作液(10ug/mlao,0.025ug/mldapi)。
三、采用配置好的荧光染料工作液对脱落细胞进行荧光染色
1、采用配置好的荧光染料工作液对来源于子宫颈的脱落细胞进行荧光染色：
具体地，包括步骤：(1)获取来源于子宫颈的脱落细胞：可采用多种捕获方法获取脱落细胞，例如：液基细胞法，沉降法，离心法和微流控法获取的脱落细胞层或集落。
(2)获取脱落细胞涂片：将步骤(1)获取的脱落细胞转移至透明的载体(载玻片或芯片)上，获得脱落细胞涂片；
(3)荧光染色：将步骤(2)获得的脱落细胞涂片，采用本实施例已经配置好的荧光染料工作液进行染色数分钟；无需冲洗；
(4)扫描观察：在暗场环境中，采用荧光显微镜对步骤(3)中荧光染色后的脱落细胞进行扫描和图像分析；采用一种紫外光激发(波长320～400nm)，由彩色摄像机取图并通过计算机图像分析系统对细胞进行分类,对细胞dna含量进行配准和检测出异常dna倍体细胞。
结果，如图11所示，用彩色摄像头在20倍荧光显微镜下拍摄的图像，脱落细胞来源于子宫颈；可见鳞状上皮细胞和淋巴细胞；可明显区分细胞核与细胞浆；细胞类型也清晰可辨认。
将图11中的荧光染色细胞形态转化为灰度图像，如图12所示，被框出的部分是完整的鳞状上皮细胞。如图13所示，被框出的部分是细胞的细胞核，核的大小及纹理清晰可见。
四、配置好的荧光染料工作液稳定性长7天
实验设计是将一瓶配置好的荧光染料工作液连续使用七天。每天上午染色一次。细胞来源于同一个细胞池，该池是将五位正常人子宫颈细胞样本混合并在细胞保存液(bd产品)中悬浮和冷藏。在整个实验过程中细胞池在4℃中冷藏约七天。下图14所示第一、三、七天的扫描图。比较第一天和第七天的核荧光强度及胞浆荧光强度发现它们没有出现衰退。经计算机图像分析荧光强度基本保持在同一水平上。
五、配置好的荧光染料工作液进行荧光染色在5分钟内趋于稳定，即可完成染色
将步骤(2)获得的脱落细胞涂片，采用本实施例已经配置好的荧光染料工作液分别进行染色2分钟、5分钟、染色10分钟；无需冲洗。
结果如图15所示，从左自右，第一张图染色2分钟显示荧光染色较弱，胞浆显色不明显；第二张图染色5分钟显示核与胞浆染色明显而且稳定；第三张图染色10分钟图8显示细胞荧光染色强度与5分钟差异小，胞浆略有偏红。由此可见，采用本实施例已经配置好的荧光染料工作液进行荧光染色5分钟趋于稳定，即可完成染色。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。