一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂及其制备方法
【专利摘要】本发明提供的一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂，所述试剂为侧链含有疏水单元和低效率荧光单元的乙二醇壳聚糖高分子。该试剂基于多位点锚定，其生物相容性好、合成简单、成本低廉、染色方便，无须清洗且不易被细胞内吞，可以用做长时间的细胞膜特异性示踪标记探针。
【专利说明】一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药【技术领域】，特别涉及一种基于多位点锚定、免清洗的长时间 细胞膜荧光成像试剂，还涉及该试剂的制备方法。
【背景技术】
[0002] 细胞膜不仅在结构上将细胞个体包裹形成稳定的内部环境，而且在功能上参与了 物质运输、能量传递、信号转导、囊泡运输、细胞生长、分化、粘附、转移、应激、胞吞、胞吐、凋 亡、坏死、自噬等很多重要生物学过程，因此关于细胞膜的研究越来越受到重视。对细胞膜 进行荧光染色可以对细胞膜进行标记和示踪，已经成为研究细胞膜结构和功能的有力手 段。
[0003] 目前市售的亲脂性荧光染料如0丨0家族（0丨0、0丨1、0丨4、0丨1?等）和？1家族 (FM4-64、FM 2-10等）存在很多的不足。这些荧光分子在水介质中也有较强的荧光，导致 过量的荧光染料存在于细胞培养液中，进而造成了荧光显微成像时背景信号干扰极大，需 要用缓冲液或者细胞培养液进行多次清洗，才能实现比较满意的成像效果。另一方面，DiD 家族因为是小分子，很容易被内吞而使细胞器的膜结构等染色，因此失去了细胞膜成像的 特异性。FM染料家族虽然通过增加极性头部的方式一定程度上提高了染料分子在细胞膜上 的稳定性，但染色10分钟以上仍然会造成内吞，难以长时间标记细胞膜。为了解决长时间 成像的问题，目前也有很多的科研人员开发了一些新型染料，它们都是利用一条或两条疏 水尾巴作为锚定区域，通过改善亲水性头部的方式进行设计，因为仍然都是小分子荧光染 料所以很容易被内吞（尤其染色时间长时，内吞更甚），因此这种单一位点锚定的方式很难 有技术突破。因此，开发一种的无须清洗的长时间细胞膜特异性成像试剂非常有必要。
[0004] 此外，由于细胞膜相关的生物学过程大多需要长时间尺度的示踪研究，因此需要 借助长时间细胞膜成像染料；然而，由于很多生物学过程需要原位捕捉最原始的状态（比 如在活体组织和器官中），无法进行体外细胞实验中常用的荧光染料清洗的操作，因此目前 迫切需要研制一类能够免清洗的细胞膜成像染料。
【发明内容】
[0005] 发明目的：本发明的目的是提供一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂。
[0006] 技术方案：本发明提供的一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂，所述试剂为 侧链含有疏水单元和低效率荧光单元的乙二醇壳聚糖。乙二醇壳聚糖在任何pH值的水溶 液中均有很好的溶解性，并且具有低免疫原性、生物相容性、生物可降解性、生物活性等特 点。疏水单元可通过疏水相互作用多位点地插入细胞膜，并把乙二醇壳聚糖高分子及其上 负载的尼罗红分子锚定到细胞膜上；乙二醇壳聚糖把各个胆固醇疏水单元和尼罗红染料单 元交联起来，防止其长时间染色被细胞内吞；尼罗红染料由于在水溶液中发光效率低，而在 疏水的细胞膜上发出红色的荧光，可以实现免清洗的长时间细胞膜荧光成像。
[0007] 作为优选，所述疏水单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比在5%到30%;所述 尼罗红染料单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比在I%到5%。
[0008] 作为另一种优选，所述乙二醇壳聚糖（glycol chitosan)的分子量在10000以上， 优选 10000-100000。
[0009] 作为另一种优选，所述疏水单元包括胆固醇、磷脂分子、烷烃和维生素 E ;所述疏 水单元通过聚乙二醇高分子链接到乙二醇壳聚糖的氨基上；所述其中聚乙二醇高分子分子 量在500以上。
[0010] 作为另一种优选，所述低效率荧光单元为羧基化的尼罗红染料或羧基化的四苯基 乙烯，其通过与氨基反应直接链接到乙二醇壳聚糖上，或通过短链PEG链接到乙二醇壳聚 糖的氨基上。所述低效率荧光单元在水溶液中发光效率低，而在疏水性环境中发光强度大 的荧光分子，以实现免清洗成像。
[0011] 所述羧基化的尼罗红染料的结构式为：
[0012]
【权利要求】
1. 一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂，其特征在于：所述试剂为侧链含有疏水 单元和低效率荧光单元的乙二醇壳聚糖。
2. 根据权利要求1所述的一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂，其特征在于：所 述疏水单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比在5%到30% ;所述尼罗红染料单元占乙 二醇壳聚糖重复单元数的百分比在1 %到5%。
3. 根据权利要求1所述的一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂，其特征在于：所 述乙二醇壳聚糖分子量在10000以上，优选10000-100000。
4. 根据权利要求1所述的一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂，其特征在于：所 述疏水单元包括胆固醇、磷脂分子、烷烃和维生素 E ;所述疏水单元通过聚乙二醇高分子链 接到乙二醇壳聚糖的氨基上；所述其中聚乙二醇高分子分子量在500以上。
5. 根据权利要求1所述的一种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂，其特征在于：所 述低效率荧光单元为羧基化的尼罗红染料或羧基化的四苯基乙烯，其通过与氨基反应直接 链接到乙二醇壳聚糖上，或通过短链PEG链接到乙二醇壳聚糖的氨基上。
6. -种免清洗的长时间细胞膜荧光成像试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步 骤： (1) 取疏水单元分子和乙二醇壳聚糖分别溶于PBS缓冲液中，混匀，室温反应；产物透 析、冻干； (2) 在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚 胺（sulfo-NHS)存在下，产物和低效率荧光单元分子室温反应，纯化即得。
【文档编号】A61K49/00GK104288787SQ201410487271
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月22日 优先权日:2014年9月22日
【发明者】吴富根, 王宏银, 陈战 申请人:东南大学